用阴离子交换树脂吸附细胞因子在血液/浆灌流中的应用.pdf

本发明涉及一种阴离子交换树脂作为清除细胞因子吸附剂在血液/血浆灌流器中的应用。本发明的有益效果：采用具有特异性选择功能的阴离子交换树脂通置于血液/血浆灌流罐中清除细胞因子，具有高效、安全、价格低廉、制备容易和操作简便的特点，体外实验结果显示：按照吸附剂与血浆体积比为1∶10的比例，阴离子交换树脂对细胞因子TNF-α吸附率达55％，对IL-1吸附率达57％，对IL-6吸附率达75％，对IL-8吸附率达42％，对蛋白质有一定影响，对电解质无明显影响，对白细胞、红细胞、血小板及电解质没有明显影响，证明选择的离子交换树脂是清除细胞因子的高效吸附剂。

1.  阴离子交换树脂作为清除细胞因子吸附剂在血液/血浆灌流器中的应用。

用阴离子交换树脂吸附细胞因子在血液/浆灌流中的应用
技术领域
本发明属于血液净化吸附剂，尤其涉及一种用阴离子交换树脂吸附细胞因子在血液/浆灌流中的应用。
背景技术
感染是临床最常见的疾病之一，重度感染可引起死亡。在该疾病的发生发展过程中，内毒素起到了重要作用。同时内毒素还可刺激多种细胞如单核/巨噬细胞、粒细胞和内皮细胞活化，产生细胞因子加剧感染过程，这些细胞因子主要包括TNF、IL-1-、IL-6和IL-8，重度感染最终可导致全身炎症反应综合征(SIRS)、多器官功能不全综合征(MODS)甚至多器官功能衰竭(MOF)以至死亡。尤其是患有慢性肝病、肝硬化和重型肝炎的患者，其肠道中细菌及内毒素可穿过上皮屏障进入肠系膜淋巴结，进入血液和器官，同时肝病时肠道黏膜屏障损害和肠道菌群失调也可促进肠源性内毒素血症的发生与发展；肝病时往往合并黄疸，血中增高的胆红素可抑制kupffer细胞功能，使其清除内毒素的能力下降，也促使内毒素血症的形成，进而产生大量细胞因子如TNF、IL-1-、IL-6和IL-8，加剧疾病发展过程。目前采用血液/血浆灌流器尚缺乏清除内毒素血症中细胞因子的血液净化吸附剂。
发明内容
本发明是为了克服现有技术中的不足，提供一种用阴离子交换树脂吸附细胞因子在血液/浆灌流中的应用，采用具有特异性选择功能的阴离子交换树脂置于血液/血浆灌流罐中可以高效清除细胞因子。
本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：一种用阴离子交换树脂作为清除细胞因子吸附剂在血液/血浆灌流器中的应用。
上述吸附剂阴离子交换树脂的制备：阴离子交换树脂选用苯乙烯系阴离子交换树脂合成，苯乙烯系阴离子交换树脂是苯乙烯和二乙烯苯在水相中进行悬浮聚合得到共聚物珠体，然后向共聚物珠体中引入可离子化的基团合成后制得；
A、共聚物珠体(交联聚苯乙烯珠体)的制备：
采用单体是苯乙烯和二乙烯苯，珠体采用自由基悬浮共聚合制成；
B、共聚物珠体(交联聚苯乙烯珠体)的功能基化-大孔阴离子交换树脂的制备：
苯乙烯系强碱性和(或)弱碱性阴离子交换树脂都是由氯甲基化交联聚苯乙烯胺化制得，对交联聚苯乙烯的氯甲基化可通过弗里德尔-克拉夫茨烷基化反应在交联聚苯乙烯的苯环上引入氯甲基，当氯甲基树脂再与叔胺反应则形成季胺型强碱性离子交换树脂；或当氯甲基树脂与氨、伯胺或仲胺反应则形成弱碱性阴离子交换树脂。
采用阴离子交换树脂作吸附剂清除内毒素血症中细胞因子的具体步骤：
A.灌流器的准备：将装有阴离子交换树脂的灌流器垂直固定，用无菌生理盐水自下而上冲洗灌流器，轻轻敲打灌流器排除气泡，再用肝素生理盐水溶液预充灌流器；血液灌流时，用动静脉管路以常规方式连接灌流器；血浆灌流时，则需要连接血浆分离器；并连接动、静脉压监测及气泡检测装置及保温装置，调整保温温度至37℃；
B.血液通路：
(1)静脉穿刺置管(双腔管)：可选择颈内静脉、锁骨下静脉、股静脉；
(2)动静脉直接穿刺：可选择桡动脉、肱动脉、足背动脉、股动脉、肘正中静脉、股静脉等；
C.肝素的使用：根据病人的具体情况使用肝素，肝素常用剂量：首剂1mg～3mg/kg体重，追加维持剂量8mg～15mg/h。对肝素用量过大出现出血倾向时，应停用肝素并考虑使用鱼精蛋白静脉缓慢推注；
D.灌流操作：连接动脉血路，开动血泵，血流量控制在50ml～100ml/min，血液流至肝素管前，注入首剂肝素，调节肝素维持量(如做血浆灌流则需要连接血浆分离器)，连接静脉管路或静脉针，调节血流量至150ml～200ml/min或血浆流量25±5ml，或同时连接动、静脉管路，每个灌流器治疗时间为1～3小时；
E.灌流结束：关闭血泵，断开动脉管路，连接生理盐水250ml左右，开动血泵，流量为50ml～100ml/min，将剩余血液回输后，断开静脉管路，穿刺部位应加压包扎止血。
本发明的有益效果：采用具有特异性选择功能的阴离子交换树脂置于血液/血浆灌流罐中清除细胞因子，具有高效、安全、价格低廉、制备容易和操作简便的特点，体外实验结果显示：按照吸附剂与血浆体积比为1∶10的比例，阴离子交换树脂对细胞因子TNF-α吸附率达55％，对IL-1吸附率达57％，对IL-6吸附率达75％，对IL-8吸附率达42％，对蛋白质有一定影响，对电解质无明显影响，对白细胞、红细胞、血小板及电解质没有明显影响，证明选择的离子交换树脂是清除细胞因子的高效吸附剂。
具体实施方式
以下结合较佳实施例，对依据本发明提供的具体实施方式详述如下：
一种阴离子交换树脂作为清除细胞因子吸附剂在血液/血浆灌流器中的应用。采用具有特异性选择功能的阴离子交换树脂置于血液/血浆灌流罐中可以高效清除细胞因子。
上述作为吸附剂的阴离子交换树脂的制备：阴离子交换树脂选用苯乙烯系阴离子交换树脂合成，苯乙烯系阴离子交换树脂是苯乙烯和二乙烯苯在水相中进行悬浮聚合得到共聚物珠体，然后向共聚物珠体中引入可离子化的基团合成后制得；
A、共聚物珠体(交联聚苯乙烯珠体)的制备：
采用单体是苯乙烯和二乙烯苯，珠体采用自由基悬浮共聚合制成；
B、共聚物珠体(交联聚苯乙烯珠体)的功能基化-大孔阴离子交换树脂的制备：
苯乙烯系强碱性和(或)弱碱性阴离子交换树脂都是由氯甲基化交联聚苯乙烯胺化制得，对交联聚苯乙烯的氯甲基化可通过弗里德尔-克拉夫茨烷基化反应在交联聚苯乙烯的苯环上引入氯甲基，当氯甲基树脂再与叔胺反应则形成季胺型强碱性离子交换树脂；或当氯甲基树脂与氨、伯胺或仲胺反应则形成弱碱性阴离子交换树脂。
采用阴离子交换树脂作吸附剂清除内毒素血症中细胞因子的具体步骤：
A.灌流器的准备：将装有阴离子交换树脂的灌流器垂直固定，用无菌生理盐水自下而上冲洗灌流器，轻轻敲打灌流器排除气泡，再用肝素生理盐水溶液预充灌流器；血液灌流时，用动静脉管路以常规方式连接灌流器；血浆灌流时，则需要连接血浆分离器；并连接动、静脉压监测及气泡检测装置及保温装置，调整保温温度至37℃；
B.血液通路：
(1)静脉穿刺置管(双腔管)：可选择颈内静脉、锁骨下静脉、股静脉；
(2)动静脉直接穿刺：可选择桡动脉、肱动脉、足背动脉、股动脉、肘正中静脉、股静脉等；
C.肝素的使用：根据病人的具体情况使用肝素，肝素常用剂量：首剂1mg～3mg/kg体重，追加维持剂量8mg～15mg/h。对肝素用量过大出现出血倾向时，应停用肝素并考虑使用鱼精蛋白静脉缓慢推注；
D.灌流操作：连接动脉血路，开动血泵，血流量控制在50ml～100ml/min，血液流至肝素管前，注入首剂肝素，调节肝素维持量(如做血浆灌流则需要连接血浆分离器)，连接静脉管路或静脉针，调节血流量至150ml～200ml/min或血浆流量25±5ml，或同时连接动、静脉管路，每个灌流器治疗时间为1～3小时；
E.灌流结束：关闭血泵，断开动脉管路，连接生理盐水250ml左右，开动血泵，流量为50ml～100ml/min，将剩余血液回输后，断开静脉管路，穿刺部位应加压包扎止血。
体外实验记录
1.材料和方法
1.1树脂准备
阴离子交换树脂使用前均经过筛、酸、碱、乙醇和冷热水处理，装入自制灌流器中，灌流器两端装有80目过滤网，采用高压蒸汽灭菌，并经溶出物、热源和急性毒性实验合格后备用。每次灌流树脂用量为10ml。
1.2血浆准备
取经血浆置换得到的内毒素阳性血浆50ml备用。
1.3灌流方法
在注射泵的驱驱动下，用50ml内毒素阳性血浆对10ml阴离子交换树脂进行血浆灌流，血浆流速为50ml/min，灌流时间为120min，灌流前及灌流30min、60min和120min取样测定内毒素、细胞因子、蛋白质和电解质浓度。
1.4检测方法：
血浆细胞因子检测采用酶联免疫法(ELISA)，试剂盒来自美国RapidBioLab，血浆内毒素检测使用MB-80型微生物快速动态检测仪(天津医科大学总医院检验科)检测，血浆蛋白质、电解质使用TOSHIBA TBA-120FR型全自动生化测定仪(天津市第三中心医院检验科)检测。
1.5统计学方法：
所有数据以均数±标准差表示，采用配对样品的t检验。
2.结果
2.1.内毒素和细胞因子灌流前后比较，血浆内毒素和细胞因子均有明显下降，其中内毒素下降99.9％，细胞因子TNF-α下降55％，IL-1下降57％，IL-6下降75％，IL-8下降42％，统计学差异有显著性(P＜0.05)。见表1。
表1灌流前后血浆内毒素、细胞因子变化(n＝10)

2.蛋白质灌流前后比较，血浆蛋白有一定下降，至灌流结束，总蛋白下降25.9％，白蛋白下降18.2％，球蛋白下降34.2％，统计学差异有显著性(P＜0.05)，见表2。
表2：灌流前后血浆蛋白质变化(n＝10)


3.电解质灌流前后比较，血浆电解质钾、钠、氯、钙、镁和磷均无明显影响(P＞0.05)，见表3。
表3：灌流前后血浆电解质变化(mmol/L)

树脂应用于临床的安全性问题：与工业用树脂相比，医用树脂对安全性有更高的要求，具体要求为，对血液有形成分(血小板、白细胞、红细胞)的影响最小、对凝血机制无明显影响、对血浆电解质无明显影响、对血浆蛋白质影响尽量小、无毒性、无刺激性、无过敏、无热源、无菌、尽量少的微粒脱落等等。为达到安全性的目的，需要对树脂进行严格处理，主要处理步骤如下：
1.树脂用80目过滤网过筛，筛掉细小微粒；
2.用医用级无水乙醇淋洗72小时以上；
3.用1N NaOH淋洗24小时，再用1N HCl淋洗24小时，如此反复三次；
4.用符合注射标准的蒸馏水淋洗24小时；
5.用符合注射标准的蒸馏水煮沸2清洗小时；
6.用符合注射标准的蒸馏水漂洗三次；
7.用符合医用标准的0.9％NaCl漂洗三次备用。
在常规保存条件下，树脂的交换功能会逐渐衰减，为了较长期保存树脂的交换功能，我们采用如下树脂保存技术：
1.树脂保存液：树脂保存于液体中而不是通常的干态保存，保存液为符合医用标准的0.9％NaCl。
2.树脂保存于37℃条件下，并尽量于37℃条件下运输。
以上两项树脂长期保存技术可以保证树脂的交换功能在两年内不会下降。
阴离子交换树脂对细胞因子TNF-α可以清除55％，对IL-1可以清除57％，对IL-6可以清除75％，对IL-8可以清除42％，完全可以达到临床应用的要求。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的结构作任何形式上的限制。凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明的技术方案的范围内。