明胶微球/磷酸钙骨水泥复合的多级释药载体的制备方法.pdf

本发明明胶微球/磷酸钙骨水泥复合的多级释药载体的制备方法，以植物油为连续相，将明胶水溶液分散其中形成乳状液，通过控制植物油的温度和搅拌时间获得不同粒径的明胶微球；按明胶微球和磷酸钙骨水泥粉末的质量比为(5～20)∶(95～80)称取相应物质，混合均匀获得复合粉体，用质量百分比浓度为0.8％的NaH2PO4调和上述复合粉体配制复合粉体浆料，在室温下调和60～90s，将该混合浆料填入模具中，于37℃恒温、湿度为100％的条件下固化1～2h，得到复合载体。将明胶微球与骨水泥复合，构建释药复合载体，根据明胶微球的降解速率不同来设计包封药物种类，从而实现不同药物的定时、定量释放；同时释药载体本身可作为骨修复支架，最终替代磷酸钙骨水泥载体支架。

1.  一种明胶微球/磷酸钙骨水泥复合的多级释药载体的制备方法，其特征在于步骤如下：
1).明胶微球的制备：以植物油为连续相，将明胶水溶液分散其中形成乳状液，通过控制植物油的温度和搅拌时间获得不同粒径的明胶微球；
2).明胶微球/磷酸钙骨水泥复合药物载体的制备：
按明胶微球和磷酸钙骨水泥粉末的质量比为(5～20)∶(95～80)称取相应物质，混合均匀获得复合粉体，用质量百分比浓度为0.8％的NaH₂PO₄调和上述复合粉体配制复合粉体浆料，在室温下调和60～90s，将该混合浆料填入模具中，于37℃恒温、湿度为100％的条件下固化1～2h，得到复合载体。

2.  如权利要求1所述的明胶微球/磷酸钙骨水泥复合的多级释药载体的制备方法，其特征在于所述的明胶微球的制备方法是：
将明胶溶于温度为大于等于40℃的去离子水中，配制成浓度为0.1～0.3g/mL的明胶溶液；在搅拌速度为300～700rpm的条件下将该明胶溶液通过多孔喷头加入植物油中，油温保持在15～50℃，然后搅拌形成乳状液，在保持搅拌速度不变的条件下迅速改为冰浴，使体系温度低于4℃，继续搅拌15～60min，并缓慢滴加浓度为25～50％的戊二醛溶液，使明胶微球质量与戊二醛溶液体积之比为0.9g/ml。搅拌0.5～1h后，将过滤后的微球浸泡在氨基乙酸溶液中，除去未反应的戊二醛，并用丙酮脱水，再用乙醇清洗残留的丙酮，在空气中自然干燥得到粒径为100～600μm，降解周期为1～30天的明胶微球。

明胶微球/磷酸钙骨水泥复合的多级释药载体的制备方法
技术领域
本发明涉及一种明胶微球/磷酸钙骨水泥复合的多级释药载体的制备方法，属于生物医药材料制备技术领域。
背景技术
随着交通事故的频繁发生以及人口的老龄化，因骨折、骨瘤或骨质疏松等原因造成骨缺损的病人越来越多，因此骨修复治疗的研究越来越受到人们的关注。传统的骨修复治疗容易引起术后并发症，而这些反应依次发生在术后数天、数周和数月并依次增加，因此需要在术后不同时期对应使用不同的药物进行治疗。如果能一次性负载多种药物，并使其定时定量依次释放，将极大地减轻病人的痛苦。目前常采用口服或注射等给药方式，这些给药方式容易造成药物在体内释放时出现浓度忽高忽低，甚至引起毒副作用，并且药物利用率也很低。针对这些情况，人们提出了一种新型的给药方式，即将药物负载于骨修复支架中，再把这种释药载体支架植入骨修复处，使其承载的药物能持续、稳定、高效地缓慢释放，达到骨修复和治疗同步进行的目的，要达到预期效果，其关键在于释药载体的开发。
目前，国内外研究较多的骨修复释药载体主要有多孔羟基磷灰石陶瓷和高分子微球与磷酸钙骨水泥复合的支架体系。由于多孔羟基磷灰石陶瓷(HAP)微球或支架的化学组成与人体骨一致，因此具有良好的生物相容性，可广泛应用于骨修复释药载体。如文献(刘伟张等，华西药学杂志，1997，vol14(3)，p172-174)报道了多孔羟基磷灰石陶瓷作为药物载体制备的人工骨，实验发现载药HAP人工骨在骨修复过程中具有一定的药物缓释治疗作用。世界专利WO 98/43558和美国专利5,055,307均报道了陶瓷微球载体的制备特点。这类载体材料的脆性大、强度差、难以塑形，且陶瓷的高温烧结导致HAP生物活性下降，在体内吸收困难，易引起骨溶解；同时药物是通过浸泡多孔HAP陶瓷进行表面吸附载药，吸附量少，难于精确控制载药剂量，在体内缓释时间短且难以控制，因而限制了其在临床上的应用。另一类骨修复释药载体就是高分子微球与磷酸钙骨水泥复合的支架体系；磷酸钙骨水泥(CPC)在室温可自固化转化为羟基磷灰石，具有随意塑性的特点，生物活性良好。与其它骨修复释药载体相比，具有不可取代的优势。但CPC也存在一些难以克服的问题，如固化体的孔隙率较低，且孔径较小，新骨难以长入；同时降解缓慢不利于骨快速愈合，药物释放速率无法控制等，这使得CPC载体的应用受到了限制。虽然通过将碳酸氢钠、氯化钠晶粒或蔗糖等加入CPC中可以制备较大孔径的多孔骨水泥材料，如US7,381,262，但孔隙率增加会导致材料强度急剧下降。近期研究发现将CPC与高分子微球复合所构建的药物载体能很好地解决以上问题。目前复合较多的高分子微球有聚乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)、壳聚糖、明胶微球等。如CN 101249281公开了一种磷酸钙骨水泥/PLGA/头孢唑啉钠复合材料，它利用干法球磨将磷酸钙骨水泥和聚乳酸-聚羟基乙酸微球均匀混合，然后将设定量的抗生素头孢唑啉钠充分溶于去离子水中配成调和液，按设定的固液比将其混合，即可自动固化形成高强度负载抗生素且可控制药物缓释的人工骨活性材料。US5,866,155也公开了类似的PLGA/磷酸钙骨水泥复合材料的制备方法。但是，PLGA在降解过程产生的酸性环境易导致无菌性炎症，且PLGA含量过高将导致磷酸钙骨水泥不能固化，从而极大地限制了它在临床上的应用。同样CN 1736928也报道了将壳聚糖微球与磷酸钙骨水泥复合，制备可体内降解成孔、初期强度高、后期降解速度较快的磷酸钙骨水泥复合支架的制备方法，该复合材料的强度提高到15MPa，但由于壳聚糖微球降解产物呈碱性，抑制了磷酸钙骨水泥基体的降解，从而影响新骨生成。明胶作为药物载体主要是利用了其独特的理化性能：能形成凝胶，易于成型，能被酶降解，被人体吸收；但未经交联改性的明胶遇水迅速溶胀、溶解，达不到缓释作用。当明胶与别的物质(如戊二醛)发生交联反应，形成缓释层，避免了药物的“突释现象”。对明胶微球交联改性的研究报道很多，如专利CN101099739，CN101167736，US7282220，US 20070264341等。CN101099739涉及恩诺沙星明胶微球及其制备方法。以A型明胶作为载体，以恩诺沙星为载药，戊二醛为交联剂，采用乳化冷凝法制备了静脉注射后靶向肺部的明胶微球。该微球载药量为5～50wt％，具有肺靶向性，可有效降低原有药物的毒副作用，在肺部具有长效作用。CN101167736公开了一种阿奇霉素微球制备方法，采用生物可降解的明胶，通过乳化凝聚法制得微球，由于戊二醛的交联作用，使得微球作用强而持久、疗效高，提高药物生物利用度。US7282220公开了一种制备载肝磷脂明胶微球的方法，采用乳化-溶剂挥发法，并选用京尼平作交联剂，明显减缓药物释放，达到了长效释药的目的。但明胶微球载体本身不能作为骨修复支架，只有与其它支架复合才能构建可作为骨修复的药物载体支架。
上述载体多用于负载一种药物，不能满足骨修复治疗时要求的多种药物的定时、定量释放。因此探索一种能够负载多种药物，在药物释放过程能够原位成孔，形成高孔隙率骨支架，并且具有可调药物释放特性，经济可行的骨修复释药载体的制备方法，对骨修复和治疗将有积极促进作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种明胶微球/磷酸钙骨水泥复合的多级释药载体的制备方法，依该方法制得的释药载体，可以根据明胶微球不同的降解速率包覆不同种类和剂量的药物，实现定时、定量的释放以维持药物足够的剂量强度，达到治疗的目的。同时释药载体本身可作为骨修复支架，在释放初期具有足够的强度，而药物释放过程中明胶的溶胀、降解又能原位成孔，有利于血管长入和新生骨生成，最终替代磷酸钙骨水泥载体支架。明胶微球粒径为100～600μm，载药量大，降解周期可控制在1～30天，药物释放后载体支架的孔隙率为60～84％，贯通性好，可用于治疗骨组织缺损和修复的药物载体。
本发明是通过以下技术方案加以实现的：
本发明的明胶微球/磷酸钙骨水泥复合的多级释药载体的制备方法，步骤如下：
1).明胶微球的制备：以植物油为连续相，将明胶水溶液分散其中形成乳状液，通过控制植物油的温度和搅拌时间获得不同粒径的明胶微球；
2).明胶微球/磷酸钙骨水泥复合药物载体的制备：
按明胶微球和磷酸钙骨水泥粉末的质量比为(5～20)∶(95～80)称取相应物质，混合均匀获得复合粉体，用质量百分比浓度为0.8％的NaH₂PO₄调和上述复合粉体配制复合粉体浆料，在室温下调和60～90s，将该混合浆料填入模具中，于37℃恒温、湿度为100％的条件下固化1～2h，得到复合载体。
明胶微球可以采用以下的制备方法：
将明胶溶于温度为大于等于40℃的去离子水中，配制成浓度为0.1～0.3g/mL的明胶溶液；在搅拌速度为300～700rpm的条件下将该明胶溶液通过多孔喷头加入植物油中，油温保持在15～50℃，然后搅拌形成乳状液，在保持搅拌速度不变的条件下迅速改为冰浴，使体系温度低于4℃，继续搅拌15～60min，并缓慢滴加浓度为25～50％的戊二醛溶液，使明胶微球质量与戊二醛溶液体积之比为0.9g/ml。搅拌0.5～1h后，将过滤后的微球浸泡在氨基乙酸溶液中，除去未反应的戊二醛，并用丙酮脱水，再用乙醇清洗残留的丙酮，在空气中自然干燥得到粒径为100～600μm，降解周期为1～30天的明胶微球。
磷酸钙骨水泥(CPC)的配置可以采用通常的方法，也可以采用本申请人的专利CN133842425A和CN101143718公开的方法制备。
本发明的优点在于获得的明胶微球/磷酸钙骨水泥复合载体可实现药物的多级释放，即以植物油为连续相，将明胶水溶液分散其中形成乳状液，通过控制植物油的温度和搅拌时间获得不同粒径的明胶微球，再将微球与戊二醛进行交联反应，通过控制戊二醛溶液的浓度和反应时间，可获得具有不同降解速度的明胶微球。(而传统乳化凝聚法是以液体石蜡为连续相，Span-80为乳化剂，将明胶溶液直接与液体石蜡和乳化剂混合制得乳化液，再加入戊二醛溶液进行交联反应，可获得均匀粒径的明胶微球)。再将明胶微球与骨水泥复合，构建释药复合载体，根据明胶微球的降解速率不同来设计包封药物种类，从而实现不同药物的定时、定量释放；同时释药载体本身可作为骨修复支架，在释放初期具有足够的强度，而药物释放过程中明胶的溶胀、降解又能原位成孔，有利于血管长入和新骨生成，最终替代磷酸钙骨水泥载体支架。因此，本发明制备的明胶微球/磷酸钙骨水泥复合的多级释药载体可作为骨修复和治疗一体化的释药体系。
附图说明
图1为本发明实施例1制得的明胶微球的扫描电镜像片；
图2为本发明实施例1制得的复合载体支架，降解14天后得到的多孔结构的扫描电镜像片；
图3为本发明实施例1制得的复合载体支架，降解14天后得到的贯通性微孔结构的扫描电镜像片。
具体实施方式
实施例1
步骤一：明胶微球的制备
将3g明胶溶于30mL温度为40℃的去离子水中，配制浓度为0.10g/mL的明胶溶液；然后将该明胶溶液通过多孔喷头加入连续搅拌(搅拌速度700rpm)的125mL的植物油中，油温保持在15℃，搅拌10min形成乳状液，在保持搅拌速度不变的条件下迅速改为冰浴，使体系温度低于4℃，继续搅拌15min，缓慢滴加5mL浓度为25％的戊二醛溶液，继续搅拌0.5h，过滤后，将微球浸泡在浓度为1mol/L的氨基乙酸溶液中30min，除去未反应的戊二醛，并用丙酮和乙醇依次洗涤制备的微球3次，自然干燥得到粒径范围为355～600μm的明胶微球(如图1所示)，将微球过筛分级，分别获得粒径小于425μm，以及粒径为425、500和600μm的明胶微球。
步骤二：骨水泥固相粉末的配置
CPC固相粉末包括α-磷酸三钙粉末(α-TCP)、Ca(H₂PO₄)₂·H₂O、碳酸钙和羟基磷灰石粉末。以总质量为20克，按质量比86∶5∶5∶4称取17.2克α-TCP粉末、1克分析纯的Ca(H₂PO₄)₂·H₂O、1克分析纯的CaCO₃和0.8克羟基磷灰石粉末配置骨水泥，在玛瑙碾钵中均匀研磨、待用。α-磷酸三钙粉末和羟基磷灰石粉末的具体制备过程可以分别按照本发明人的专利CN133842425A和CN101143718公开的方法制备。
步骤三：明胶微球/磷酸钙骨水泥复合载体的制备
称取步骤一制得的粒径小于425μm和粒径为500μm的微球0.15g，其质量比为40∶60，然后与步骤二制得的1.0g骨水泥固相粉末混合均匀，加入0.7mL质量百分比浓度为0.8％的Na₂HPO₄溶液配制骨水泥浆体，在室温下调和60～90s，将该复合浆体填入模具中，在恒温37℃、湿度为100％的条件下固化1h，然后置于37℃，pH＝7.4的模拟体液中测试明胶微球的降解速度，发现前5天降解速度最快，14天降解率达到90％以上，明胶降解后载体支架的孔隙率为76±2％(如图2所示)，贯通性好(如图3所示)。
实施例2：
步骤一：明胶微球的制备
将9g明胶溶于30mL温度为40℃的去离子水中，配制浓度为0.3g/mL的明胶溶液；然后将该明胶溶液用注射器逐滴加入连续搅拌(搅拌速度500rpm)的125mL的植物油中，油温保持在38℃，搅拌30min形成乳状液，在保持搅拌速度不变的条件下迅速改为冰浴，使体系温度低于4℃，继续搅拌30min，缓慢滴加10mL浓度为25％的戊二醛溶液，继续搅拌0.5h，过滤后，将微球浸泡在1mol/L的氨基乙酸溶液中30min，除去未反应的戊二醛，并用丙酮和乙醇依次洗涤制备的微球3次，自然干燥得到粒径范围为100～250μm的明胶微球，将微球过筛分级，分别获得粒径为小于125，以及150和250μm的明胶微球。
步骤二：骨水泥固相粉末的配置
与实施例1步骤二相同。
步骤三：明胶微球/磷酸钙骨水泥复合载体的制备
称取步骤一制得的粒径为250μm的微球0.05g，与步骤二制得的1.0g骨水泥固相粉末混合均匀，加入0.6mL质量百分比浓度为0.8％的Na₂HPO₄溶液，配制复合粉体浆体，在室温下调60～90s，将该明胶微球/骨水泥浆体填入模具中，在恒温37℃、湿度为100％的条件下固化1h，然后置于37℃，pH＝7.4的模拟体液中测试明胶微球的降解速度，发现前3天降解速度最快，7天降解率达到90％以上，明胶降解后载体支架的孔隙率为60±3％，贯通性好。
实施例3：
步骤一：明胶微球的制备
将9g明胶溶于30mL温度为40℃的去离子水中，配制浓度为0.3g/mL的明胶溶液；然后将该明胶溶液用注射器逐滴加入连续搅拌(搅拌速度300rpm)的125mL的植物油中，油温保持在50℃，搅拌30min形成乳状液，在保持搅拌速度不变的条件下迅速改为冰浴，使体系温度低于4℃，继续搅拌60min，缓慢滴加10mL浓度为50％的戊二醛溶液，继续搅拌1h，过滤后，将微球浸泡在1mol/L的氨基乙酸溶液中30min，除去未反应的戊二醛，并用丙酮和乙醇依次洗涤制备的微球3次，自然干燥得到粒径范围为75～150μm的明胶微球，将微球过筛分级，获得粒径为75、96和150μm的明胶微球。
步骤二：骨水泥固相粉末的配置
与实施例1步骤二相同。
步骤三：明胶微球/磷酸钙骨水泥复合载体的制备
称取步骤一制得的粒径为150μm的微球0.2g，与步骤二制得的1.0g骨水泥固相粉末混合均匀，加入0.8mL质量百分比浓度为0.8％的Na₂HPO₄溶液配制骨水泥浆体，在室温下调和60～90s，将该骨水泥浆体填入模具中，在恒温37℃、湿度为100％的条件下固化1h，然后置于37℃，pH＝7.4的模拟体液中测试明胶微球的降解速度，发现前7天降解速度最快，18天降解率达到90％以上，明胶降解后载体支架的孔隙率为84±2％，贯通性好。
实施例4
步骤一：载药微球的制备(按实施例1的参数来写)
将4.5g明胶溶于30mL温度为40℃的去离子水中，配制浓度为0.15g/mL的明胶溶液，然后按照30mg/mL的配比加入900mg庆大霉素原料药，完全溶解后将该混合溶液通过多孔喷头加入连续搅拌(搅拌速度700rpm)的125mL的植物油中，油温保持在14±1℃，搅拌10min形成乳状液，在保持搅拌速度不变的条件下迅速改为冰浴，使体系温度低于4℃，继续搅拌15min，缓慢滴加5mL浓度为25％的戊二醛溶液，继续搅拌0.5h，过滤后，将微球浸泡在浓度为1mol/L的氨基乙酸溶液中30min，除去未反应的戊二醛，并用丙酮和乙醇依次洗涤制备的微球3次，自然干燥得到粒径范围为355～600μm的明胶微球，将微球过筛分级，分别获得粒径小于425μm，以及粒径为425、500和600μm的明胶微球。
步骤二：骨水泥固相粉末的配置
与实施例1步骤二相同。
步骤三：载药明胶微球/骨水泥复合药物释放体系的制备
称取步骤一制得的粒径小于425μm和粒径为500μm的微球0.15g，其质量比为40∶60，然后与步骤二制得的1.0g骨水泥固相粉末混合均匀，加入0.7mL质量百分比浓度为0.8％的Na₂HPO₄溶液配制骨水泥浆体，在室温下调和60～90s，将该复合浆体填入模具中，在恒温37℃、湿度为100％的条件下固化1h，获得载药明胶微球/骨水泥复合药物释放体系。
步骤四：药物释放周期的测试
将步骤三制得的药物释放体系称取适量置于3mL，37℃，pH＝7.4的模拟体液中浸泡，分别于0.5h、1h、2h、4h、6h、12h、1d、2d、3d、5d、7d、14d、21d、28d取出浸泡液，并更换新的浸泡液；对浸泡液进行处理后利用紫外分光光度计在庆大霉素的最大吸收波长处进行吸光度测定，根据标准曲线计算出各时间间隔的药物释放浓度，进而计算出药物的释放速度，发现药物的释放周期与实施例1制得的明胶微球的降解周期基本保持一致，前5天的累积释放量达到总释放量的70％，14天后累积释放量超过90％，药物释放后载体支架的孔隙率也相同。因此可以根据明胶的降解速率来设计药物的释放速率。
实施例5
步骤一：载药微球的制备
将9g明胶溶于30mL温度为40℃的去离子水中，配制浓度为0.3g/mL的明胶溶液，然后按照20mg/mL的配比加入600mg红霉素原料药，均匀分散于明胶溶液后通过多孔喷头加入连续搅拌(搅拌速度500rpm)的125mL的植物油中，油温保持在38±1℃，搅拌30min形成乳状液，在保持搅拌速度不变的条件下迅速改为冰浴，使体系温度低于4℃，继续搅拌30min，缓慢滴加10mL浓度为25％的戊二醛溶液，继续搅拌0.5h，过滤后，将微球浸泡在浓度为1mol/L的氨基乙酸溶液中30min，除去未反应的戊二醛，并用丙酮和乙醇依次洗涤制备的微球3次，自然干燥得到粒径范围为100～250μm的明胶微球，将微球过筛分级，分别获得粒径为小于125，以及150和250μm的明胶微球。
步骤二：骨水泥固相粉末的配置
与实施例1步骤二相同。
步骤三：载药明胶微球/骨水泥复合药物释放体系的制备
称取步骤一制得的粒径为250μm的微球0.1g，然后与步骤二制得的1.0g骨水泥固相粉末混合均匀，加入0.6mL质量百分比浓度为0.8％的Na₂HPO₄溶液配制骨水泥浆体，在室温下调和60～90s，将该复合浆体填入模具中，在恒温37℃、湿度为100％的条件下固化1h，获得红霉素明胶微球/骨水泥复合药物释放体系。
步骤四：药物释放周期的测试
将步骤三制得的药物释放体系称取适量置于3mL，37℃，pH＝7.4的模拟体液中浸泡，分别于0.5h、1h、2h、4h、6h、12h、1d、2d、3d、5d、7d、14d、21d、28d取出浸泡液，并更换新的浸泡液；对浸泡液进行处理后利用紫外分光光度计在庆大霉素的最大吸收波长处进行吸光度测定，根据标准曲线计算出各时间间隔的药物释放浓度，进而计算出药物的释放速度，发现药物的释放周期与实施例2制得的明胶微球的降解周期基本保持一致，前3天的累积释放量达到总释放量的70％，7天后累积释放量超过90％，药物释放后载体支架的孔隙率也相同。因此可以根据明胶的降解速率来设计药物的释放速率。
支架是通过具有不同降解速率的明胶微球承载多种药物，根据明胶的降解速率可以选择承载不同的药物，使不同的药物呈现不同的释放周期。即通过测定载有单一药物微球的载体在模拟体液中的药物释放速率就可以判断其承载多种药物时的释放速率，因为释放到模拟体液中的药物浓度不可能达到饱和(体液是流动的，模拟体液也是定期更换的)，因此一种药物的释放速率不会受到其它药物释放的影响，这样就可用载单一药物微球的支架在模拟体液中的药物释放速率来衡量载多种药物微球载体中药物的释放速率。
本发明提出的一种明胶微球/磷酸钙骨水泥复合的多级释药载体的制备方法，已通过实施例进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明的内容、精神和范围内对本文所述的内容进行改动或适当变更与组合，来实现本发明。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明的精神、范围和内容中。