蛭弧菌游泳体和蛭质体混合体菌液在海参育苗中的应用.pdf

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1、10申请公布号CN102017904A43申请公布日20110420CN102017904ACN102017904A21申请号201010268417822申请日20100831CCTCCNOM20806620080428A01K61/00200601A23K1/18200601A23K1/16200601C12N1/20200601C12R1/0120060171申请人华南理工大学地址510640广东省广州市天河区五山路381号72发明人蔡俊鹏孙丽滢74专利代理机构广州市华学知识产权代理有限公司44245代理人裘晖54发明名称蛭弧菌游泳体和蛭质体混合体菌液在海参育苗中的应用57摘要本发明公开。

2、了蛭弧菌游泳体和蛭质体混合制剂在海参育苗中的应用，通过在水体和饲料中添加蛭弧菌游泳体和蛭质体混合菌液实现，具体包括育苗设施与水质条件，亲参采捕，亲参蓄养，产卵孵化与幼体培育，采苗和稚参培育，关键技术是在水体中添加浓度为10107PFU/ML的蛭弧菌混合制剂，和/或同时饲料也用浓度为10107PFU/ML的混合制剂浸泡30MIN，应用本发明平均育苗成活率达到50以上，并且能有效改善水质，实验表明最长可长达20天不换水，节约成本，人力，大大提高了经济效益，且育苗成活率高、苗种质量好、节水节能、绿色低碳。83生物保藏信息51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明。

3、书8页附图1页CN102017916A1/1页21蛭弧菌混合体菌液在海参养殖中的应用，其特征在于所述蛭弧菌混合体菌液为蛭弧菌蛭质体菌液和游泳体菌液混合。2根据权利要求1所述蛭弧菌蛭质体菌液在海参养殖中的应用，其特征在于所述蛭弧菌蛭弧菌为蛭弧菌BDELLOVIBRIOSPBDM01于2008年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNOM208066。3根据权利要求1所述蛭弧菌混合体菌液在海参养殖中的应用，其特征在于所述蛭弧菌混合体菌液为蛭质体菌液与游泳体菌液按细菌数11混合。4根据权利要求1所述蛭弧菌混合体菌液在海参养殖中的应用，其特征在于所述蛭弧菌混合体菌液在海参养殖中的。

4、应用是将饲料在蛭弧菌混合体菌液中浸泡1545MIN。5根据权利要求1所述蛭弧菌混合体菌液在海参养殖中的应用，其特征在于所述蛭弧菌混合体菌液在海参养殖中的应用是在水体中添加蛭弧菌混合体菌液，使水体中蛭弧菌混合体浓度为101107PFU/ML。权利要求书CN102017904ACN102017916A1/8页3蛭弧菌游泳体和蛭质体混合体菌液在海参育苗中的应用技术领域0001本发明属于生物技术领域，涉及一种细菌的应用，特别涉及蛭弧菌游泳体和蛭质体混合体菌液在海参育苗中的应用。背景技术0002海参APOSTICHOPUSJAPONICUS，属海参纲HOLOTHURIOIDEA，以海底藻类和浮游生物为食。

5、。海参全身长满肉刺，广布于世界各海洋中。海参同人参、燕窝、鱼翅齐名，是世界八大珍品之一。海参不仅是珍贵的食品，也是名贵的药材。现代研究表明，海参具有提高记忆力、延缓性腺衰老，防止动脉硬化、糖尿病以及抗肿瘤等作用。0003近年来，随着城乡居民生活水平的不断提高以及医疗保健意识的增强，海参的消费需求不断上升，价格不断上涨，由此带动了海参养殖的兴起，海参养殖已成为继对虾养殖之后又一新的海水养殖热点。现在我国每年生产的海参商品苗已突破亿枚，居世界榜首。由于种苗数量的逐渐提高，规模的不断扩大也出现许多问题急待加以解决追求利润最大化导致近亲繁殖、亲体小型化、病害猖獗；无序大量使用抗生素造成海参体内药物残留。

6、，品质下降；近亲育苗，降低了苗种的生存力；按目前的生产工艺，多数育苗场用水量大，水不经处理直接入海，严重污染环境。0004蛭弧菌是寄生于其他细菌，并能导致宿主细菌裂解的一类细菌。比一般细菌小，能通过细菌滤器，有类似噬菌体的作用。蛭弧菌的生活史可分为脱离宿主细菌、具有鞭毛、自由游泳的游泳体状态和在宿主细菌内生长发育的蛭质体状态。0005用蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合制剂作为用于海参育苗的微生物制剂，对育苗水体和饵料进行处理，可有效裂解消除水体中可能产生海参参苗病害的细菌，兼具游泳体起效快，活力强和蛭质体制备、保存容易，杀菌作用时间更久和环境耐受力更强的优点。从而克服了抗生素滥用带来的副作用和常规消。

7、毒剂残留等问题。同时在蛭质体发育期间，所入侵的宿主虽已无活性，但蛭弧菌并不改变宿主细胞的表面结构，使原宿主仍具有抗原作用，因此不影响宿主的免疫原性，可刺激生物体，产生免疫应答反应。故蛭质体形式是潜在的疫苗在育苗过程中有提高苗种的免疫力的功能。0006蛭弧菌游泳体和蛭质体混合制剂一方面能够裂解水体中的潜在致病菌，净化水体，减少换水频率和换水量，另一方面蛭弧菌能改善养殖生物肠道环境，提高免疫力，促进幼苗发育和生长，提高苗种成活率。0007到目前为止，尚无对海参育苗过程中使用蛭弧菌游泳体和蛭质体混合制剂的研究报道。发明内容0008本发明的目的在于克服已有方法的不足，提供蛭弧菌游泳体和蛭质体混合体菌液。

8、在海参育苗中的应用方法，能有效控制病害发生，提高苗种质量和育苗成功率，减少育苗过程中污水的排放。说明书CN102017904ACN102017916A2/8页40009本发明的目的可以通过以下方案实现0010蛭弧菌混合体菌液在海参养殖中的应用，所述蛭弧菌混合体菌液为蛭弧菌蛭质体菌液和游泳体菌液混合。0011所述蛭弧菌蛭弧菌为蛭弧菌BDELLOVIBRIOSPBDM01于2008年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNOM208066。0012所述蛭弧菌混合体菌液为蛭质体菌液与游泳体菌液按细菌数11混合。0013所述蛭弧菌混合体菌液在海参养殖中的应用是将饲料在蛭弧菌混合体。

9、菌液中浸泡1545MIN。0014所述蛭弧菌混合体菌液在海参养殖中的应用是在水体中添加蛭弧菌混合体菌液，使水体中蛭弧菌混合体浓度为101107PFU/ML。0015本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果00161、本发明所述蛭弧菌混合制剂兼具游泳体起效快，活力强和蛭质体制备、保存容易，杀菌作用时间更久和环境耐受力更强，且可作为潜在疫苗的优点，效果更好。00172、本发明所述蛭弧菌混合制剂在海参的应用中安全性好。0018蛭弧菌通过裂解而消除致病菌的方法是生物方法，绿色、安全、无污染。蛭弧菌可侵染、裂解宿主细菌的特性使之适合作为抑制或清除生物体及其环境中致病菌的生物净化因子，且其在裂解完宿主细。

10、菌后，会因饥饿而自动消亡，从而克服了抗生素滥用带来的副作用。现有的研究表明蛭弧菌对海参无毒性作用，对人类无致病性。00193、所述蛭弧菌混合制剂可有效提高种苗免疫力0020蛭弧菌混合制剂可调节参苗自身的菌系，维护肠道系统环境，促进免疫系统的发育，增强苗种的体质，方案于实际实施中各项免疫指标的测定均高于使用传统的方法，且游泳体和蛭质体混合制剂中的蛭质体所携带的宿主气单胞菌虽已无活性，但免疫原性并未被破坏，故可发挥疫苗的作用。00214、本发明方案可有效减少换水、倒池的次数，经实验证实在幼体培育期无需换水，在稚参的培育期最长可达20天不换水倒池，减少了污水的排放，降低对环境的影响，是一种绿色、环保。

11、、低碳的节水型新育苗技术。附图说明0022图1为实施例育苗试验后免疫因素酸性磷酸酶ACIDPHOSPHATASE，ACP结果0023图2为实施例育苗试验后免疫因素碱性磷酸酶ALKALINEPHOSPHATASE，AKP结果具体实施方式0024下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。0025实施例1蛭弧菌混合制剂的制备0026蛭弧菌蛭质体菌液优选通过以下方法制备接种05ML106CFU/ML嗜水气单胞菌AEROMONASHYDROPHILA，购于广东省微生物所菌种保藏中心，编号GIM1172于100ML营养肉汤蛋白胨10G，牛肉膏3G，氯化钠5G，蒸馏水1000ML。

12、，PH74液体培养基中，说明书CN102017904ACN102017916A3/8页528培养20H，培养液经6000RPM离心20MIN后，沉淀用5MLDNBDILUTENUTRIENTBROTH液体培养基营养肉汤08G，酪蛋白酸水解物05G，酵母精提物01G，溶于1000ML蒸馏水中，PH值为74悬浮，后加入至100MLDNB中，接入1ML1103PFU/ML蛭弧菌BDFM05，28培养48H，培养液经7000RPM离心20MIN后，去除含蛭弧菌游泳体的上清液，沉淀用1MLDNB液体培养基悬浮，得到1ML蛭弧菌蛭质体菌液，浓度为108PFU/ML。0027蛭弧菌游泳体菌液的制备方法为将蛭。

13、弧菌蛭质体制备方法中的含蛭弧菌游泳体的上清液经16000RPM离心20MIN后，沉淀用1MLDNB液体培养基悬浮，得到1ML蛭弧菌游泳体菌液，经OD600NM测定LYSISOFVIBRIOSBYBDELLOVIBRIOANDLIKEORGANISMSBALOSISOLATEDFROMMARINEENVIRONMENTJJOURNALOFFOODSAFETY，2008，282220235，浓度为108PFU/ML。0028所述蛭弧菌游泳体和蛭质体混合制剂按蛭弧菌游泳体和蛭质体菌数11比例混合。0029实施例2蛭弧菌混合制剂在海参育苗中的应用实验0030实施地点山东某海参养殖场，育苗种类仿刺参又名。

14、灰参00311亲参采捕自然海区采捕。采捕时间海水底层水温达到1516时，亲参产卵前5天集中采捕。选择体长20CM以上，体重250G以上、性腺指数10以上、无损伤的个体作亲参。00322亲参蓄养0033蓄养密度15只/M3，蓄养的水温1618，蓄养时间5天，在蓄养池中进行。蓄养池中的水经过精细过滤。在水中加入蛭弧菌游泳体和蛭质体混合菌液，使培育池中的蛭弧菌浓度达到101107PFU/ML。短期蓄养过程不投饵，不换水，每天早晚利用虹吸作用清理池中的粪便等污物。0034暂养期间，每日清晨吸底检查是否有卵，以免漏掉，如仅见少量产卵可弃掉。00353产卵孵化与幼体培育0036受精采用混合受精方式。为保证。

15、受精质量，防止精液过多，需及时将过多的雄参已见排精的个体挑出并移入另外的水池中。亲参产卵受精后及时将亲参移出，并用过滤海水洗卵，直到池水变清为止，再向池中加入浓度为101107PFU/ML的蛭弧菌混合制剂，受精卵直接在蓄养池中孵化。0037受精卵的孵化密度为5个/ML，孵化水温为20。孵化期间每隔05H用搅水耙将池水上、下翻动一次，翻水时应不留死角且不能向一个方向旋转，以避免将胚体旋向池中心聚集。胚体孵出后，必要时可给予充气。00384幼体培育0039当胚胎发育到小耳幼体时，要进行选育。将上浮的幼体移入培育池内继续培养。培育池中的海水为经砂滤的海水，池中添加蛭弧菌混合制剂使池中的蛭弧菌浓度为1。

16、01107PFU/ML，幼体布池密度约为05个/ML。0040孵化36小时后，即投饵。饵料主要为天然的牟氏角毛藻。藻类的日投饵量在初耳幼体期为15万细胞/ML，中耳幼体期为2万3万细胞/ML，大耳幼体期为4万说明书CN102017904ACN102017916A4/8页65万细胞/ML。每日分3次投喂，每次投饵量的标准以投饵1小时后大多数幼体满胃即可，下次投饵要接近半胃为准。所有投喂的饵料需事先用浓度为101107PFU/ML的蛭弧菌混合制剂泡30MIN。0041幼体培育期间全部使用二级砂滤水。本阶段不换水、倒池，但要及时利用虹吸作用或吸底器清除池底污物00425稚参的采集和培育0043当幼体。

17、25发育至蹲形幼虫时，即可投放稚波纹板做附着基，附着基投放前用20MG/L的高锰酸钾溶液浸泡2天，再用过滤海水冲洗干净。洗刷干净后放入饵料池中供自然海水中存在的底栖硅藻附着。经过20天，在附着基上面附着一层天然的底栖硅藻，即投放使用。使用前用水冲去附着基上的污物，再放入浓度为101107PFU/ML的蛭弧菌混合制剂中浸泡30MIN。每平方米投放60片波纹板，呈60斜放，以便投饵时承接饵料。0044体长2MM以前的稚参，以附着基上的底栖硅藻为主食。随着稚参的增长，及时补充新的底栖硅藻及鼠尾藻磨碎液。当稚参体长达2MM时，以鼠尾藻磨碎液为饵料，每日投喂4次，每次2030万个细胞单位。0045投放的。

18、所有饵料均需要放入浓度为101107PFU/ML的蛭弧菌游混合制剂中泡30MIN。0046育苗期间随时观察温度，及时清除池底部的沉淀物及水表面的杂物。参照水体情况可设不同的换水周期，试验结果表明最长可达20天不换水，每次换水时注入二级砂滤水，换水完毕后需施加蛭弧菌混合制剂，使水体中的蛭弧菌浓度达到101107PFU/ML。0047根据稚参生长状况，可提前移出已达出苗规格2CM的稚参，分期出池，以利个体小的迅速生长。0048实验分组0049实验分ABCD四大组，其中0050A组对照按现有的工厂化生产方法实施。0051B组蛭弧菌混合制剂浸泡饲料0052B11B14全程用101PFU/ML蛭弧菌混合。

19、制剂浸泡所有饵料，稚参培育期分别每隔5天、10天、15天、20天换水一次。0053B21B24全程用103PFU/ML蛭弧菌混合制剂浸泡所有饵料，稚参培育期分别每隔5天、10天、15天、20天换水一次。0054B31B34全程用105PFU/ML蛭弧菌混合制剂浸泡所有饵料，稚参培育期分别每隔5天、10天、15天、20天换水一次。0055B41B44全程用107PFU/ML蛭弧菌混合制剂浸泡所有饵料，稚参培育期分别每隔5天、10天、15天、20天换水一次。0056C组蛭弧菌混合制剂泼洒于水体用蛭弧菌混合制剂均匀泼洒于水体中，使水体中的蛭弧菌浓度达到设定要求。浓度和换水间隔设置同B组。0057D组。

20、蛭弧菌混合制剂泼洒于水体中和浸泡饵料用蛭弧菌混合制剂均匀泼洒于水体中和浸泡所有饵料，浓度和换水间隔设置同B组。说明书CN102017904ACN102017916A5/8页70058免疫指标测定00591酸性磷酸酶ACP与碱性磷酸酶AKP活力的测定0060制备粗酶提取液。育苗实验结束，每组随机取仿刺参幼苗6只用冰冻双蒸水4，PH70冲洗干净，用吸水纸吸干水分后，准确称取组织质量，按质量体积比19加入086的冷生理盐水，在液氮中研磨成匀浆状，分装于15ML的离心管中，4，12000R/MIN离心10MIN，取上清液，加入9倍体积冷生理盐水，制成粗酶提取液。4保存，并于24H内分析完毕。0061碱。

21、性磷酸酶AKP和酸性磷酸酶ACP活性均采用KRUZEL1982磷酸苯二钠法，以每克组织蛋白在37与磷酸苯二钠分别作用15MIN和30MIN，产生1MG酚为一个酶活力单位。00622感染实验0063试验结束后，感染试验于预先消毒的盛有50L砂滤海水盐度2930的透明水族箱中进行，以工厂化生产的A组作为对照组，其他BD组为实验组。对照和实验各组，每组随机取海参苗40头，平均分成两个平行系列。按实施例1中的方法制备嗜水气单胞菌AEROMONASHYDROPHILA，购于广东省微生物所菌种保藏中心，编号GIM1172菌液，之后投入到对照和实验组的养殖水体中，使水体中的嗜水气单胞菌浓度达到107CFU/。

22、ML。试验水温保持在1820，充气培养。人工感染后，记录刺参的体表变化、运动、摄食及死亡情况连续观察7D，最终计算成活率，采用相对存活率RELATIVEPERCENTAGESURVIVAL，RPS计算式0064RPS1免疫组死亡率/对照组死亡率1000065水质检测0066水质检测项目包括色臭味，酸碱度，氨态氮，亚硝酸盐氮，硫化物。其中PH用数字式PH计测定分辨率001PH，氨态氮用次溴酸纳氧化法法测定GB12763491；亚硝酸盐氮用重氮偶氮光度法测定GB12763491；硫化物用对氨基二甲基苯胺光度法亚甲蓝法GB1648996。0067四、实验结果0068成活率、RPS结果如表1所示，AC。

23、P、AKP结果见图1，图2。从表1和图1、2可以看出，实验组B，C，D无论是育苗成功率还是各项免疫指标均好于对照A组，由此表明本方案用蛭弧菌游泳体和蛭质体混合制剂进行海参育苗可提高稚参的成活率和免疫力，优于现有生产模式培育出的育苗质量。0069比较实验组B/C/D，可知B组成活率最高可达541，感染实验的PRS最高可达51，但包括ACP、AKP在内均要略低于C组。D组成活率最高可达688，RPS可达62，均高于B，C两组，ACP，AKP的数据同样如此，表明用蛭弧菌同时处理饵料和水体可更有效地提高稚参的成活率和免疫力。0070从各组组内的对比可知，各项指标的数据随着蛭弧菌游泳体和蛭质体混合制剂浓。

24、度的升高而升高，但换水周期对其的影响不显著。因此，在实际生产中，换水周期可设为20天一次。如此，既可降低能耗和劳动力，又可减少排污，保护环境。0071水质检测结果各组均符合渔业水质标准GB116071989和无公害食品海水养殖用水水质NY50522001标准。但A1组的氨态氮，亚硝态氮，硫化物测定说明书CN102017904ACN102017916A6/8页8值均高于试验组B、C、D的。其中，A组氨态氮的检测结果为0322MG/L，B/C/D组均0231MG/L；亚硝态氮A组检测结果为0018MG/L，B/C/D组均0015MG/L；硫化物A组检测结果为0108MG/L，B/C/D组均0101MG/L。0072由此可见，无论在水中还是在饲料中添加浓度为101107PFU/ML的蛭弧菌游泳体和蛭质体混合制剂，520天换水一次，均能提高海参的免疫力和成活率，净化水质，促进参苗生长。在水中和饲料中同时添加蛭弧菌游泳体和蛭质体混合菌液，效果更佳。0073表1稚参各项指标测定结果0074说明书CN102017904ACN102017916A7/8页900750076说明书CN102017904ACN102017916A8/8页10说明书CN102017904ACN102017916A1/1页11图1图2说明书附图CN102017904A。