利用颗粒体蛋白前体PGRN治疗神经变性疾病.pdf

发明详述

提供了用于治疗由环境对患者的损伤介导的神经变性疾病的方法和组合物。在一个例证性的实施方案中，通过给患者施用包含颗粒体蛋白前体的组合物，可以治疗神经变性疾病患者，其中用包含颗粒体蛋白前体的组合物治疗患者会减轻患者中神经学疾病的症状。

在上述的例证性的实施方案中，神经变性疾病可以由环境损伤介导。

在另一个实施方案中，提供了用于减少患者中神经元细胞死亡的方法。该方法包含下述步骤：给神经变性疾病患者施用治疗有效量的颗粒体蛋白前体，其中颗粒体蛋白前体的量可以有效地增加患者中的神经元细胞存活或增殖。

在上述的例证性的实施方案中，神经变性疾病可以由环境损伤介导。

本文使用的“颗粒体蛋白前体”或“颗粒体蛋白前体多肽”是指选自下述的多肽：SEQ ID NO.2的多肽，与SEQ ID NO.2具有约95％同源性、约96％、约97％、约98％、约99％同源性的多肽；SEQ ID NO.12的多肽，与SEQ ID NO.12具有约95％同源性、约96％、约97％、约98％、约99％同源性的多肽；SEQ ID NO.3的多肽，与SEQ ID NO.3具有约95％同源性、约96％、约97％、约98％、约99％同源性的多肽；SEQ ID NO.4的多肽，与SEQ ID NO.4具有约95％同源性、约96％、约97％、约98％、约99％同源性的多肽；SEQ ID NO.5的多肽，与SEQ ID NO.5具有约95％同源性、约96％、约97％、约98％、约99％同源性的多肽；SEQ ID NO.6的多肽，与SEQ ID NO.6具有约95％同源性、约96％、约97％、约98％、约99％同源性的多肽；SEQID NO.7的多肽，与SEQ ID NO.7具有约95％同源性、约96％、约97％、约98％、约99％同源性的多肽；SEQ ID NO.8的多肽，与SEQID NO.8具有约95％同源性、约96％、约97％、约98％、约99％同源性的多肽；或SEQ ID NO.9的多肽，与SEQ ID NO.9具有约95％同源性、约96％、约97％、约98％、约99％同源性的多肽。

人颗粒体蛋白前体SEQ ID NO：2

MWTLVSWVALTAGLVAGTRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRP

LLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRG

FHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCED

RVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDG

STCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPA

HTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGT

CEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIP

EAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSC

PVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFL

ARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCA

ARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQLL

人颗粒体蛋白前体DNA SEQ ID NO：1

1    ggcgagagga agcagggagg agagtgattt gagtagaaaa gaaacacagc attccaggct

61   ggccccacct ctatattgat aagtagccaa tgggagcggg tagccctgat ccctggccaa

121  tggaaactga ggtaggcggg tcatcgcgct ggggtctgta gtctgagcgc tacccggttg

181  ctgctgccca aggaccgcgg agtcggacgc aggcagacca tgtggaccct ggtgagctgg

241  gtggccttaa cagcagggct ggtggctgga acgcggtgcc cagatggtca gttctgccct

301  gtggcctgct gcctggaccc cggaggagcc agctacagct gctgccgtcc ccttctggac

361  aaatggccca caacactgag caggcatctg ggtggcccct gccaggttga tgcccactgc

421  tctgccggcc actcctgcat ctttaccgtc tcagggactt ccagttgctg ccccttccca

481  gaggccgtgg catgcgggga tggccarcac tgctgcccac ggggcttcca ctgcagtgca

541  gacgggcgat cctgcttcca aagatcaggt aacaactccg tgggtgccat ccagtgccct

601  gatagtcagt tcgaatgccc ggacttctcc acgtgctgtg ttatggtcga tggctcctgg

661  gggtgctgcc ccatgcccca ggcttcctgc tgtgaagaca gggtgcactg ctgtccgcac

721  ggtgccttct gcgacctggt tcacacccgc tgcatcacac ccacgggcac ccaccccctg

781  gcaaagaagc tccctgccca gaggactaac agggcagtgg ccrtgtccag ctcggtcatg

841  tgtccggacg cacggtcccg gtgccctgat ggttctacct gctgtgagct gcccagtggg

901  aagtatggct gctgcccaat gcccaacgcc acctgctgct ccgatcacct gcactgctgc

961  ccccaagaca ctgtgtgtga cctgatccag agtaagtgcc tctccaagga gaacgctacc

1021 acggacctcc tcactaagct gcctgcgcac acagtggggg atgtgaaatg tgacatggag

1081 gtgagctgcc cagatggcta tacctgctgc cgtctacagt cgggggcctg gggctgctgc

1141 ccttttaccc aggctgtgtg ctgtgaggac cacatacact gctgtcccgc ggggtttacg

1201 tgtgacacgc agaagggtac ctgtgaacag gggccccacc aggtgccctg gatggagaag

1261 gccccagctc acctcagcct gccagaccca caagccttga agagagatgt cccctgtgat

1321 aatgtcagca gctgtccctc ctccgatacc tgctgccaac tcacgtctgg ggagtggggc

1381 tgctgtccaa tcccagaggc tgtctgctgc tcggaccacc agcactgctg cccccagggc

1441 tacacgtgtg tagctgaggg gcagtgtcag cgaggaagcg agatcgtggc tggactggag

1501 aagatgcctg cccgccgggc ttccttatcc caccccagag acatcggctg tgaccagcac

1561 accagctgcc cggtggggca gacctgctgc ccgagcctgg gtgggagctg ggcctgctgc

1621 cagttgcccc atgctgtgtg ctgcgaggat cgccagcact gctgcccggc tggctacacc

1681 tgcaacgtga aggctcgatc ctgcgagaag gaagtggtct ctgcccagcc tgccaccttc

1741 ctggcccgta gccctcacgt gggtgtgaag gacgtggagt gtggggaagg acacttctgc

1801 catgataacc agacctgctg ccgagacaac cgacagggct gggcctgctg tccctaccgc

1861 cagggcgtct gttgtgctga tcggcgccac tgctgtcctg ctggcttccg ctgcgcagcc

1921 aggggtacca agtgtttgcg cagggaggcc ccgcgctggg acgccccttt gagggaccca

1981 gccttgagac agctgctgtg agggacagta ctgaagactc tgcagccctc gggaccccac

2041 tcggagggtg ccctctgctc aggcctccct agcacctccc cctaaccaaa ttctccctgg

2101 accccattct gagctcccca tcaccatggg aggtggggcc tcaatctaag gccttccctg

2161 tcagaagggg gttgtggcaa aagccacatt acaagctgcc atcccctccc cgtttcagtg

2221 gaccctgtgg ccaggtgctt ttccctatcc acaggggtgt ttgtgtgtgt gcgcgtgtgc

2281 gtttcaataa agtttgtaca ctttcaaaaa aaaaaaaaaa aaa

小鼠颗粒体蛋白前体SEQ ID NO：12

MWVLMSWLAFAAGLVAGTQCPDGQFCPVACCLDQGGANYSCCNP

LLDTWPRITSHHLDGSCQTHGHCPAGYSCLLTVSGTSSCCPFSKGVSCGDGYHCCPQG

FHCSADGKSCFQMSDNPLGAVQCPGSQFECPDSATCCIMVDGSWGCCPMPQASCCEDR

VHCCPHGASCDLVHTRCVSPTGTHTLLKKFPAQKTNRAVSLPFSVVCPDAKTQCPDDS

TCCELPTGKYGCCPMPNAICCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKNYTTDLLTKLPGYP

VKEVKCDMEVSCPEGYTCCRLNTGAWGCCPFAKAVCCEDHIHCCPAGFQCHTEKGTCE

MGILQVPWMKKVIAPLRLPDPQILKSDTPCDDFTRCPTNNTCCKLNSGDWGCCPIPEA

VCCSDNQHCCPQGFTCLAQGYCQKGDTMVAGLEKIPARQTTPLQIGDIGCDQHTSCPV

GQTCCPSLKGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARTCEKDVDFIQPPVLLTL

GPKVGNVECGEGHFCHDNQTCCKDSAGVWACCPYLKGVCCRDGRHCCPGGFHCSARGT

KCLRKKIPRWDMFLRDPVPRPLL

小鼠颗粒体蛋白前体DNA SEQ ID NO：13

1   gagatgcctc ccagggagcc cggaccccga cgcaggcaga ccatgtgggt cctgatgagc

61  tggctggcct tcgcggcagg gctggtagcc ggaacacagt gtccagatgg gcagttctgc

121 cctgttgcct gctgccttga ccagggagga gccaactaca gctgctgtaa ccctcttctg

181 gacacatggc ctagaataac gagccatcat ctagatggct cctgccagac ccatggccac

241 tgtcctgctg gctattcttg tcttctcact gtgtctggga cttccagctg ctgcccgttc

301 tctaagggtg tgtcttgtgg tgatggctac cactgctgcc cccagggctt ccactgtagt

361 gcagatggga aatcctgctt ccagatgtca gataacccct tgggtgctgt ccagtgtcct

421 gggagccagt ttgaatgtcc tgactctgcc acctgctgca ttatggttga tggttcgtgg

481 ggatgttgtc ccatgcccca ggcctcttgc tgtgaagaca gagtgcattg ctgtccccat

541 ggggcctcct gtgacctggt tcacacacga tgcgtttcac ccacgggcac ccacacccta

601 ctaaagaagt tccctgcaca aaagaccaac agggcagtgt ctttgccttt ttctgtcgtg

661 tgccctgatg ctaagaccca gtgtcccgat gattctacct gctgtgagct acccactggg

721 aagtatggct gctgtccaat gcccaatgcc atctgctgtt ccgaccacct gcactgctgc

781 ccccaggaca ctgtatgtga cctgatccag agtaagtgcc tatccaagaa ctacaccacg

841 gatctcctga ccaagctgcc tggataccca gtgaaggagg tgaagtgcga catggaggtg

901 agctgccctg aaggatatac ctgctgccgc ctcaacactg gggcctgggg ctgctgtcca

961 tttgccaagg ccgtgtgttg tgaggatcac attcattgct gcccggcagg gtttcagtgt

1021 cacacagaga aaggaacctg cgaaatgggt atcctccaag taccctggat gaagaaggtc

1081 atagcccccc tccgcctgcc agacccacag atcttgaaga gtgatacacc ttgtgatgac

1141 ttcactaggt gtcctacaaa caatacctgc tgcaaactca attctgggga ctggggctgc

1201 tgtcccatcc cagaggctgt ctgctgctca gacaaccagc attgctgccc tcagggcttc

1261 acatgtctgg ctcaggggta ctgtcagaag ggagacacaa tggtggctgg cctggagaag

1321 atacctgccc gccagacaac cccgctccaa attggagata tcggttgtga ccagcatacc

1381 agctgcccag tagggcaaac ctgctgccca agcctcaagg gaagttgggc ctgctgccag

1441 ctgccccatg ctgtgtgctg tgaggaccgg cagcactgtt gcccggccgg gtacacctgc

1501 aatgtgaagg cgaggacctg tgagaaggat gtcgatttta tccagcctcc cgtgctcctg

1561 accctcggcc ctaaggttgg gaatgtggag tgtggagaag ggcatttctg ccatgataac

1621 cagacctgtt gtaaagacag tgcaggagtc tgggcctgct gtccctacct aaagggtgtc

1681 tgctgtagag atggacgtca ctgttgcccc ggtggcttcc actgttcagc caggggaacc

1741 aagtgtttgc gaaagaagat tcctcgctgg gacatgtttt tgagggatcc ggtcccaaga

1801 ccgctactgt aaggaagggc tacagactta aggaactcca cagtcctggg aaccctgttc

1861 cgagggtacc cactactcag gcctccctag cgcctcctcc cctaacgtct ccccggccta

1921 ctcatcctga gtcaccctat caccatggga ggtggagcct caaactaaaa ccttctttta

1981 tggaaagaag gctgtggcca aaagccccgt atcaaactgc catttcttcc ggtttctgtg

2041 gaccttgtgg ccaggtgctc ttcccgagcc acaggtgttc tgtgagcttg cttgtgtgtg

2101 tgtgcgcgtg tgcgtgtgtt gctccaataa agtttgtaca ctttc

SEQ ID NO：3hGrnA

DVKCDMEVS-CPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQ

SEQ ID NO：4hGrnB

-VMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLS

SEQ ID NO：5hGrnC

-VPCDNVSS-CPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQ-CQSEQ ID NO：6hGrnD

DIGCDQHTS-CPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCE

SEQ ID NO：7hGrnE

DVECGEGHF-CHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCL

SEQ ID NO：8hGrnF

AIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCISEQ ID NO：9hGrnG

GGPCQVDAH-CSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFSEQ ID NO：10grn D

AMDIGCDQHTS-CPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCE-KLAAALEHHHHHH

SEQ ID NO：11grn F

AMAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCI-KLAAALEHHHHHH

本领域技术人员熟知，通过保守置换改变蛋白的任意非关键氨基酸，不会显著改变蛋白的活性，因为用于替换天然氨基酸的氨基酸的侧链应当能形成与已经被替换的氨基酸的侧链类似的键和接触。

非保守置换是可行的，只要它们不会过度地影响多肽的神经保护或神经再生活性和/或减少它在治疗神经变性疾病中的有效性。

本领域众所周知，氨基酸的“保守置换”或多肽的“保守置换变体”是指氨基酸置换，其维持：1)多肽主链的结构(例如β折叠或α-螺旋结构)；2)氨基酸的电荷或疏水性；和3)侧链的庞大性(bulkiness)，或这些特征中的任意一项或更多项。更具体地，众所周知的术语“亲水的残基”涉及丝氨酸或苏氨酸。“疏水的残基”涉及亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸。“带正电荷的残基”涉及赖氨酸、精氨酸或组氨酸。“带负电荷的残基”涉及天冬氨酸或谷氨酸。具有“大侧链”的残基涉及苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸。

术语“保守的氨基酸置换”是本领域众所周知的，它涉及用具有类似特征的氨基酸(例如，类似的电荷或疏水性，类似的庞大性)置换特定氨基酸。实例包括用天冬氨酸置换谷氨酸，或用异亮氨酸置换亮氨酸。在表1中给出了例证性的保守氨基酸置换的列表。保守置换变体1)相对于母本序列仅具有保守的氨基酸置换，2)相对于母本序列具有至少90％序列同一性，优选至少95％同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性或99％或更高的同一性；和3)保留神经保护或神经恢复活性。在这方面，根据本发明预见到上述多肽序列的任意保守置换变体。这样的变体被视作“颗粒体蛋白前体”。

表1

在一个例证性的方面，神经变性疾病状态可以包括，但不限于，帕金森病和帕金森综合征(包括进行性核上性麻痹)、阿尔茨海默氏病、和运动神经元病(例如，肌萎缩侧索硬化)，或由神经元细胞死亡的增加和颗粒体蛋白前体表达的修饰介导的任意其它神经变性疾病。

在另一个实施方案中，提供了药物组合物。所述药物组合物包含治疗有效量的颗粒体蛋白前体和药学上可接受的载体，其中所述治疗有效量包含能减轻或预防由环境对患者的损伤介导的神经变性疾病的症状的量。

根据患者状况、待治疗的疾病状态、颗粒体蛋白前体的给药途径和组织分布和共同使用其它治疗性处理的可能性，包含颗粒体蛋白前体多肽的组合物的单元日剂量可以显著变化。要施用给患者的颗粒体蛋白前体的有效量是基于体表面积、患者体重、医师对患者状况的评判等。在一个例证性的实施方案中，颗粒体蛋白前体的有效剂量可以在从约1ng/kg患者体重至约1mg/kg患者体重的范围内，更优选从约1ng/kg患者体重至约500ng/kg患者体重，最优选从约1ng/kg患者体重至约100ng/kg患者体重。

在另一个例证性的实施方案中，颗粒体蛋白前体多肽的有效剂量可以在从约1pg/kg患者体重至约1mg/kg患者体重的范围内。在不同的例证性的实施方案中，有效剂量可以在下述范围内：从约1pg/kg患者体重至约500ng/kg患者体重，从约500pg/kg患者体重至约500ng/kg患者体重，从约1ng/kg患者体重至约500ng/kg患者体重，从约100ng/kg患者体重至约500ng/kg患者体重，和从约1ng/kg患者体重至约100ng/kg患者体重。

在另一个例证性的实施方案中，颗粒体蛋白前体多肽的有效剂量可以在从约1μg/kg患者体重至约1mg/kg患者体重的范围内。在不同的例证性的实施方案中，有效剂量可以在下述范围内：从约1μg/kg患者体重至约500μg/kg患者体重，从约500ng/kg患者体重至约500μg/kg患者体重，从约1μg/kg患者体重至约500μg/kg患者体重，从约0.1μg/kg患者体重至约5μg/kg患者体重，从约0.1μg/kg患者体重至约10μg/kg患者体重，和从约0.1μg/kg患者体重至约100μg/kg患者体重。

包含颗粒体蛋白前体的组合物优选地肠胃外地施用给患者，例如，真皮内地、皮下地、肌肉内地、腹膜内地、静脉内地、心室内地、鞘内地、大脑内地或脊索内地(intracordally)(脊的(spinal))。或者，颗粒体蛋白前体组合物可以通过其它医学上有用的过程施用给患者，且可以使用任意有效的剂量和合适的治疗剂型，包括延长的或持续的释放剂型。可以通过注射进行给药。也可以使用慢泵递送包含颗粒体蛋白前体的组合物。

肠胃外剂型的实例包括活性剂的水溶液，其在等渗盐水、5％葡萄糖或其它众所周知的药学上可接受的液体载体例如液体醇、二醇、酯和酰胺中。根据本发明的肠胃外剂型可以是可重配的冻干物(lyophilizate)形式，其包含一定剂量的含有颗粒体蛋白前体的组合物。在本实施方案的一个方面，可以施用本领域已知的许多延长的或持续的释放剂型中的任一种，例如，在美国专利号4,713,249、5,266,333和5,417,982中所述的可生物降解的碳水化合物基质，它们的公开内容通过引用并入本文。

在一个例证性的实施方案中，描述了用于一般用途的肠胃外施用的含有颗粒体蛋白前体的药物制剂，其包含：a)药学活性量的颗粒体蛋白前体；b)药学上可接受的pH缓冲剂，以提供在约pH 4.5至约pH9范围内的pH；c)浓度范围为约0至约250毫摩尔的离子强度调节剂；和d)浓度范围为约0.5％至约7％总式量的水溶性的粘度调节剂，或a)、b)、c)和d)的任意组合。

在不同的例证性的实施方案中，用于本文所述组合物和方法中的pH缓冲剂是技术人员已知的那些试剂，包括，例如，醋酸盐、硼酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐缓冲剂、以及氢氯酸、氢氧化钠、氧化镁、磷酸二氢钾、碳酸氢盐、氨水、碳酸、氢氯酸、柠檬酸钠、柠檬酸、醋酸、磷酸氢二钠、硼砂、硼酸、氢氧化钠、二乙基巴比妥酸和蛋白，以及不同的生物学缓冲液，例如，TAPS、N，N-二(羟乙基)甘氨酸、Tris、Tricine、HEPES、TES、MOPS、PIPES、二甲砷酸盐、MES。

在另一个例证性的实施方案中，离子强度调节剂包括本领域已知的那些试剂，例如，甘油、丙二醇、甘露醇、葡萄糖、右旋糖、山梨醇、氯化钠、氯化钾和其它电解质。

有用的粘度调节剂包括、但不限于，离子的和非离子的水溶性聚合物；交联的丙烯酸聚合物，例如“卡波姆”家族的聚合物，例如，可以在Carbopol商标下商业地得到的羧聚烯烃(carboxypolyalkylene)；亲水的聚合物例如聚氧化乙烯、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物和聚乙烯醇；纤维质聚合物和纤维质聚合物衍生物例如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素酞酸酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素和酯化的纤维素；树胶例如西黄蓍胶和黄原胶；海藻酸钠；明胶、透明质酸和其盐、壳聚糖、胶凝糖或其任意组合。优选地，为了便于达到希望的制剂pH，可以采用非酸性的粘度增强剂，例如中性的或碱性的试剂。如果需要均匀的凝胶，可以加入分散剂例如醇、山梨醇或甘油，或可以通过研磨、机械混合或搅拌，或它们的组合，分散胶凝剂。在一个实施方案中，粘度增强剂也可以提供碱性，如上面讨论的。在一个优选的实施方案中，粘度调节剂是已经改良的纤维素，例如通过醚化或酯化。

在不同的例证性的实施方案中，提供了颗粒体蛋白前体组合物，其可以包含全部或部分的颗粒体蛋白前体多肽，后者是单独的或与至少一种其它试剂相组合，例如赋形剂和/或稳定化的化合物和/或增溶剂，且可以在任意无菌的生物相容的药物载体中施用，包括、但不限于，盐水、缓冲盐水、右旋糖、葡萄糖和水。合适的赋形剂是碳水化合物或蛋白填充剂例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；来自玉米、小麦、米、马铃薯等的淀粉；纤维素例如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠；和树胶包括阿拉伯胶和西黄蓍胶；和蛋白例如明胶和胶原。合适的崩解剂或增溶剂包括琼脂、海藻酸或它们的盐例如海藻酸钠。

在例证性的实施方案中，颗粒体蛋白前体多肽可以单独地或与其它试剂、药物或激素组合地或在药物组合物中施用给患者，在所述药物组合物中，它与赋形剂或其它药学上可接受的载体混合在一起。在一个实施方案中，药学上可接受的载体是药学上惰性的。在另一个实施方案中，颗粒体蛋白前体多肽可以单独地施用给遭受神经学疾病的患者。

施用包含颗粒体蛋白前体的组合物的任何有效的方案都可以使用。例如，包含颗粒体蛋白前体的组合物可以作为单次剂量来施用，或可以将包含颗粒体蛋白前体的组合物分开，并作为多剂量每日方案来施用。此外，交错的方案，例如，每周1-3天，可以用作每日治疗的替代方案，且为了本发明的目的，将这样的间隔的或交错的每日方案视作每天治疗的等同方案，且在本发明的范围内。在一个实施方案中，通过多次注射包含颗粒体蛋白前体的组合物来治疗患者，以减少神经元细胞死亡。在另一个实施方案中，给患者注射多次(例如，约2次至多达约50次)包含颗粒体蛋白前体的组合物，例如，以12-72小时间隔或以48-72小时间隔。可以在初期注射(单次或复数次)后间隔数天或数月，给患者额外注射包含颗粒体蛋白前体的组合物，该额外注射预防疾病的复发。或者，包含颗粒体蛋白前体的组合物的初期注射(单次或复数次)可以预防疾病的复发。

在另一个例证性的实施方案中，通过给患者施用组合物来治疗神经变性疾病患者，所述组合物包含修饰颗粒体蛋白前体表达的效应物(例如，编码治疗分子的DNA，例如编码颗粒体蛋白前体或颗粒体蛋白前体的部分的DNA)或效应物的组合，其中用包含修饰颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物治疗患者会减轻患者中神经学疾病的症状。

在另一个实施方案中，提供了药物组合物。所述药物组合物包含治疗有效量的修饰颗粒体蛋白前体表达的效应物和药学上可接受的载体，其中所述治疗有效量包含能减轻或预防神经变性疾病的症状的量。

在另一个实施方案中，提供了减少患者中神经元细胞死亡的方法。该方法包含下述步骤：给神经变性疾病患者施用治疗有效量的修饰颗粒体蛋白前体表达的效应物，其中效应物的量可以有效地增加患者中的神经元细胞存活或增殖。在另一个例证性的实施方案中，效应物的量可以有效地增加神经元中颗粒体蛋白前体的表达。在其它例证性的实施方案中，效应物的量可以有效地降低非神经元细胞中颗粒体蛋白前体的表达。

在另一个例证性的实施方案中，通过给患者施用组合物，可以治疗由限于编码颗粒体蛋白前体或颗粒体蛋白前体的部分的DNA受到环境损伤介导的神经变性疾病患者，所述组合物包含修饰颗粒体蛋白前体表达的效应物(例如，编码治疗分子的DNA)或效应物的组合，其中用包含修饰颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物治疗患者会减轻患者中神经学疾病的症状。

在另一个实施方案中，提供了药物组合物。所述药物组合物包含治疗有效量的修饰颗粒体蛋白前体表达的效应物和药学上可接受的载体，其中所述治疗有效量包含能减轻或预防由环境对患者的损伤介导的神经变性疾病的症状的量。

在另一个实施方案中，提供了减少患者中神经元细胞死亡的方法。该方法包含下述步骤：给由环境损伤介导的神经变性疾病患者施用治疗有效量的修饰颗粒体蛋白前体表达的效应物，其中效应物的量可以有效地增加患者中的神经元细胞存活或增殖。在另一个例证性的实施方案中，效应物的量可以有效地增加神经元中颗粒体蛋白前体的表达。在其它例证性的实施方案中，效应物的量可以有效地降低非神经元细胞中颗粒体蛋白前体的表达。

本文使用的“修饰颗粒体蛋白前体表达的效应物”是指增加靶细胞中颗粒体蛋白前体表达的核酸(例如，DNA、cDNA或mRNA)。本文使用的“靶细胞”包含神经元细胞。根据患者状况、待治疗的疾病状态、效应物分子量、它的给药途径和组织分布和共同使用其它治疗性处理的可能性，包含修饰颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物的单元日剂量可以显著变化。要施用给患者的有效量是基于体表面积、患者体重和医师对患者状况的评判。在一个例证性的实施方案中，效应物的有效剂量可以在从约1ng/kg患者体重至约1mg/kg患者体重的范围内，更优选从约1ng/kg患者体重至约500ng/kg患者体重，最优选从约1ng/kg患者体重至约100ng/kg患者体重。

在另一个例证性的实施方案中，效应物的有效剂量可以在从约1pg/kg患者体重至约1mg/kg患者体重的范围内。在不同的例证性的实施方案中，有效剂量可以在下述范围内：从约1pg/kg患者体重至约500ng/kg患者体重，从约500pg/kg患者体重至约500ng/kg患者体重，从约1ng/kg患者体重至约500ng/kg患者体重，从约100ng/kg患者体重至约500ng/kg患者体重，和从约1ng/kg患者体重至约100ng/kg患者体重。

在另一个例证性的实施方案中，效应物的有效剂量可以在从约100万效应物分子/70kg患者体重至约10亿效应物分子/70kg患者体重的范围内。在不同的例证性的实施方案中，有效剂量可以在下述范围内：从约100万效应物分子/70kg患者体重至约5亿效应物分子/70kg患者体重，从约20万效应物分子/70kg患者体重至约2亿效应物分子/70kg患者体重，从约100万效应物分子/70kg患者体重至约2亿效应物分子/70kg患者体重。

包含修饰颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物优选地肠胃外地施用给患者，例如，真皮内地、皮下地、肌肉内地、腹膜内地、静脉内地、心室内地、鞘内地、大脑内地或脊索内地(脊的)。或者，包含修饰颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物可以通过其它医学上有用的过程施用给患者，且可以使用任意有效的剂量和合适的治疗剂型，包括延长释放剂型。可以通过注射进行给药。

优选地肠胃外地注射包含修饰颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物，这样的注射可以是真皮内注射、腹膜内注射、皮下注射、肌肉内注射、静脉内注射、心室内注射、鞘内注射、大脑内注射或脊索内注射(脊的)。也可以使用慢泵递送包含修饰颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物。另外，合适的途径可以例如包括经口的或透过粘膜的给药。如下所述也可以治疗性施用细胞内地修饰颗粒体蛋白前体表达的效应物。肠胃外剂型的实例包括活性剂的水溶液，其在等渗盐水、5％葡萄糖或其它众所周知的药学上可接受的液体载体例如液体醇、二醇、酯和酰胺中。根据本发明的肠胃外剂型可以是可重配的冻干物形式，其包含一定剂量的包含修饰颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物。在本实施方案的一个方面，可以施用本领域已知的许多延长释放剂型中的任一种，例如，在美国专利号4,713,249、5,266,333和5,417,982中所述的可生物降解的碳水化合物基质，它们的公开内容通过引用并入本文。

施用包含修饰颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物的任何有效的方案都可以使用。例如，包含修饰颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物可以作为单次剂量来施用，或包含修饰颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物可以在多次剂量中施用。此外，交错的方案，例如，每周1-3天，可以用作每日治疗的替代方案，且为了本发明的目的，将这样的间隔的或交错的每日方案视作每天治疗的等同方案，且在本发明的范围内。在一个实施方案中，通过一次或更多次注射包含修饰颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物来治疗患者。在另一个实施方案中，给患者注射多次(例如，约2次至多达约50次)包含修饰颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物，例如，以12-72小时间隔或以48-72小时间隔。可以在初期注射(单次或复数次)后间隔数天或数月，给患者额外注射包含修饰颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物，该额外注射预防疾病的复发。或者，包含修饰颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物的初期一次或更多次注射可以预防疾病的复发。

在不同的例证性的实施方案中，本文所述的组合物包含分离的和纯化的编码颗粒体蛋白前体基因或其部分的核酸序列。纯化核酸的方法是本领域技术人员众所周知的。在一个实施方案中，所述序列可操作地连接至指导颗粒体蛋白前体基因的表达的调节序列。在其它实施方案中，所述序列可操作地连接至异源启动子。在更进一步的实施方案中，所述序列是包含在载体中。在有些实施方案中，所述载体是在宿主细胞(例如，神经元细胞)中。

本文使用的术语“载体”用于指将DNA或mRNA片段转移进患者的细胞中的核酸分子。所述载体含有核酸序列和在患者中表达可操作地连接的核酸编码序列所必需的适当核酸序列。载体能表达插入该载体中的核酸分子，并生成多肽或蛋白。表达必需的核酸序列通常包括启动子、操纵基因(任选的)和核糖体结合位点，经常与其它序列例如增强子和终止和多腺苷酸化信号一起。

如果使用细胞来递送核酸，通过用核酸转导、转染、显微注射或电穿孔细胞，可以将核酸导入细胞。当这些核酸已经导入细胞中时，可以用外源的或异源的核酸转化、转导或转染递送细胞(例如，通过磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、聚凝胺(polybrene)-介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂转染、原生质体融合、逆转录病毒感染、基因枪法等)。转化DNA例如可以与染色体DNA整合(共价连接)或不整合，构成递送细胞的基因组。在哺乳动物细胞中，例如，转化DNA可以维持在附加体元件例如质粒上。在真核细胞中，稳定转化的细胞是其中转化DNA已经整合进染色体中从而通过染色体复制被子代细胞遗传的细胞。

本文使用的“修饰颗粒体蛋白前体表达的效应物”可以包含“颗粒体蛋白前体核酸”，且所述颗粒体蛋白前体核酸包含完整的颗粒体蛋白前体编码序列或本文所述的同源序列。

在另一个例证性的实施方案中，颗粒体蛋白前体核酸可以掺入载体中，并通过本领域已知的任意方法施用给患者，例如在美国专利号6,333,194、7,105,342和7,112,668中所述的方法，它们通过引用并入本文。在例证性的实施方案中，可以将颗粒体蛋白前体核酸在体外导入从患者器官提取的细胞，其中然后将修饰的细胞重新导入身体，或直接在体内导入适当组织或使用靶向载体-颗粒体蛋白前体核酸构建体。在不同的例证性的实施方案中，可以将颗粒体蛋白前体核酸导入细胞或器官，其中使用例如病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒的方法，例如转染、裸DNA的注射、电穿孔、声穿孔(sonoporation)、“基因枪”(例如，使用高压气体，把DNA包被的金颗粒射击进细胞)、合成的寡聚体、lipoplex、polyplex、病毒颗粒或树枝状聚合物。

在一个治疗细胞或器官的实施方案中，可以使用病毒载体将颗粒体蛋白前体核酸导入细胞或器官。所述病毒载体可以是本领域已知的任意病毒载体。例如，所述病毒载体可以是腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、改良的疱疹病毒载体等。在另一个例证性的转染细胞的实施方案中，可以通过直接DNA转染(脂转染、磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔等)，将颗粒体蛋白前体核酸导入细胞。

在不同的例证性的实施方案中，颗粒体蛋白前体核酸可以是，例如，DNA分子、RNA分子、cDNA分子或包含颗粒体蛋白前体核酸的表达构建体。

通过通常用于制备或分离核酸的任意常规方法，可以制备或分离本文所述的颗粒体蛋白前体核酸，其包括SEQ ID NO(1)和(13)的核酸。例如，通过本领域已知的方法，使用可商业得到的试剂和合成仪，可以化学地合成DNA和RNA分子。通过本领域通常用于纯化核酸的任意常规方法，可以纯化本文所述的颗粒体蛋白前体核酸。例如，使用本领域已知的电泳方法和核酸纯化试剂盒(例如Quigen试剂盒)，可以纯化颗粒体蛋白前体核酸。使用本领域已知的任意重组方法，也可以制备适合使用病毒载体递送或适合通过直接DNA转染导入细胞中的颗粒体蛋白前体核酸。

具有修饰的核苷间键的核酸也可以用于本文所述的方法和组合物中。使用本领域已知的试剂和方法，例如，用于合成含有膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲氧基乙基氨基磷酸酯、formacetal、thioformacetal、二异丙基甲硅烷基、acetamidate、氨基甲酸酯、二亚甲基-硫化物(--CH₂--S--CH₂--)、二亚甲基-亚砜(--CH₂--SO--CH₂--)、二亚甲基-砜(--CH₂--SO₂--CH₂--)、2′-O-烷基和2′-脱氧-2′-氟代硫代磷酸酯核苷间键的核酸的方法，可以合成含有修饰的核苷间键的核酸。

本发明也包括修饰的颗粒体蛋白前体序列，即不同于编码天然颗粒体蛋白前体的序列的序列，只要该修饰的序列仍然编码在更高或更低的活性水平表现出天然颗粒体蛋白前体的生物活性的蛋白。这些修饰的颗粒体蛋白前体序列包括由点突变造成的修饰、由于遗传密码的简并或天然存在的等位基因变体造成的修饰和为了制备重组颗粒体蛋白前体核酸通过基因工程引入的其它修饰。

颗粒体蛋白前体核酸包括这样的核酸，其与SEQ ID NO 1和13具有95％同源性，或与在非常严格的条件下与颗粒体蛋白前体的DNA编码序列SEQ ID NO 1或13的互补物杂交的核酸具有95％同源性。本文使用的术语“杂交”用于指互补核酸的配对。杂交和杂交的强度(例如，核酸之间缔合的强度)受到诸如下述因素的影响：核酸之间的互补程度，涉及的条件的严格性，形成的杂种的T_m(解链温度)，和核酸内的G∶C比。本文使用的术语“严格性”用于指进行核酸杂交的条件：温度、离子强度和其它化合物例如有机溶剂的存在。

在一个例证性的实施例中，“非常严格的条件”可以指在65℃、在5X SSPE和50％甲酰胺中杂交，在65℃、在0.5X SSPE中洗涤。在另一个例证性的实施例中，“非常严格的条件”可以指在55℃、在由下述试剂组成的杂交缓冲液中杂交18-24小时：50％甲酰胺(vol/vol)，10％硫酸葡聚糖，1x登哈特溶液，20mM磷酸钠、pH 6.5，5x SSC，和200μg鲑精DNA/ml杂交缓冲液，并用2x SSC、1％SDS在室温洗涤4次(每次5分钟)，然后用0.1x SSC在50-55℃洗涤15分钟。在另一个例证性的实施例中，高严格性杂交的条件描述在Sambrook等人，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(2001)，通过引用并入本文。在有些例证性的方面，沿着核酸的全长发生杂交。

在本文所述的方法和组合物的不同实施方案中，使用例如荧光化合物、放射性同位素、抗原、生物素-抗生物素蛋白、比色化合物或本领域技术人员已知的其它标记试剂，可以标记探针，以便于检测和定量扩增的DNA，例如通过实时PCR。在例证性的实施方案中，标记可以包括6-羧基荧光素(FAM^TM)、TET^TM(四氯-6-羧基荧光素)、JOE^TM(2，7，-二甲氧基-4，5-二氯-6-羧基荧光素)、VIC^TM、HEX(六氯-6-羧基荧光素)、TAMRA^TM(6-羧基-N，N，N′，N′-四甲基罗丹明)、BHQ^TM、SYBR绿、Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、Cascade Blue、Cy3、Cy5，6-FAM、荧光素、俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝、REG、罗丹明绿、罗丹明红、ROX和/或德克萨斯红。

在本发明的上下文中，非常严格的杂交的检测表示与例如本文提供的核酸强烈的结构相似性或结构同源性(例如，核苷酸结构、碱基组成、排列或次序)。

也包括与颗粒体蛋白前体的DNA编码序列SEQ ID NO.1或13具有约80％、约85％、约90％、约95％、96％、97％、98％和99％同源性的核酸分子。本文使用的两个序列之间的同源性百分比相当于序列之间的同一性百分比。序列之间的同一性或同源性百分比的测定，可以使用例如GAP程序(Genetics Computer Group，软件现在可以在http://www.accelrys.com上从Accelrys得到)来实现，比对可以使用例如ClustalW算法(VNTI软件，InforMax Inc.)来实现。可以使用目标核酸序列搜索序列数据库。搜索数据库的算法通常是基于BLAST软件(Altschul等人，1990)。在有些实施方案中，可以沿着核酸的全长测定同源性或同一性百分比。

本文使用的术语“互补的”是指嘌呤和嘧啶核苷酸序列通过氢键缔合形成双链核酸分子的能力。鸟嘌呤和胞嘧啶、腺嘌呤和胸腺嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶是互补的，当两个核酸分子具有“互补的”序列时，可以通过氢键缔合，导致双链核酸分子的形成。互补的序列可以是DNA或RNA序列。互补的DNA或RNA序列称作“互补物”。互补可以是“部分的”，其中仅一些核酸碱基根据碱基配对原则配对。或者，核酸之间可以是“完全”或“全部”互补的。

在例证性的实施方案中，神经变性疾病由环境对患者的损伤介导。本文使用的“由环境对患者的损伤介导的神经变性疾病”是指由环境损伤造成、且不是由修饰颗粒体蛋白前体表达的颗粒体蛋白前体基因的可遗传突变造成的疾病。可遗传的突变是患者的DNA中的永久突变，其可能传递给患者的后代。但是，这些例证性的实施方案并不意味着排除修饰基因的等位基因变体的影响，其例如参与神经毒素的代谢，使个体对神经变性疾病发展的敏感性更高或更低。本文使用的这些修饰基因可以改变疾病发展进程。

由环境对患者的损伤介导的神经变性疾病可以是与环境因素有关的散发病，所述环境因素通过改变基因表达，直接地或间接地造成神经元细胞死亡。在不同的其它例证性的实施方案中，环境损伤是源自患者的饮食，或是内源合成的结果，或二者。在一个例证性的实施方案中，环境损伤造成合成在体内产生有害效应的化合物。神经元细胞死亡可以通过任意种类的方式发生，包括、但不限于兴奋性中毒或氧化应激。例如，在美国专利申请公开号2006-0252705中，描述了环境毒素导致神经元细胞死亡的不同方式，它通过引用并入本文。

在另一个例证性的实施方案中，神经变性疾病状态是由兴奋性毒素介导。兴奋性毒素是一类通过受体(例如，兴奋性的神经递质谷氨酸盐的受体)的过度激活破坏神经元、导致神经元细胞死亡的物质。兴奋性毒素的实例包括兴奋性的氨基酸，它们可以造成中枢神经系统的损伤。兴奋性毒素的其它实例包括、但不限于，甾醇葡糖苷包括β-谷甾醇-β-D-葡糖苷和胆固醇葡糖苷，蛋氨酸sulfoximine，和本领域已知的会在患者中诱导神经兴奋性中毒反应的其它物质。在一个例证性的实施方案中，兴奋性毒素是甾醇糖苷。在其它例证性的实施方案中，甾醇糖苷选自β-谷甾醇-β-D-葡糖苷和胆固醇葡糖苷或其类似物或衍生物。

在一个例证性的实施方案中，神经变性疾病选自：帕金森病、阿尔茨海默氏病和ALS。包括阿尔茨海默氏病、帕金森病和ALS在内的神经学疾病通常导致可以在临床上观察到的行为缺陷。这些疾病靶向神经元群体，导致神经病理性的和行为的症状。阿尔茨海默氏病包含大脑皮质和海马多种区域的神经元死亡，导致认知功能例如记忆和学习的丧失。帕金森病导致黑质-纹状体系统的部分的退化。起始阶段包含来自黑质的含有多巴胺的神经元的末端突出的丧失。这又造成黑质中神经元细胞体的死亡，影响运动控制，并导致震颤和步态障碍。

运动神经元病的一个实例是肌萎缩侧索硬化(ALS)。ALS主要包含脊髓和皮质运动神经元的丧失，导致日益增加的麻痹和最终的死亡。ALS的早期症状包括、但不限于，足下垂或患者腿、脚或踝无力，手无力或笨拙，肌肉痛性痉挛和手臂、肩和舌的颤搐。ALS通常影响咀嚼、吞咽、说话和呼吸，最终导致执行这些功能所需的肌肉的麻痹。在Shaw等人，Neuroscience and Biobehavioral Reviews，27：493(2003)中，阐明了不同神经学疾病的综述，它通过引用并入本文。本发明的方法和组合物可以用于人临床医学和兽医学用途。本文所述的方法和组合物可以单独地或与其它方法或组合物组合地使用。

在另一个例证性的实施方案中，可以通过给患者施用组合物来治疗由环境损伤介导的神经变性疾病患者，所述组合物包含修饰颗粒体蛋白前体表达的效应物(例如，编码治疗分子的DNA)或效应物的组合，其中用包含修饰颗粒体蛋白前体表达的效应物的组合物治疗患者会减轻患者中神经学疾病的症状。使用介导颗粒体蛋白前体表达的效应物的任意上述实施方案适用于这个实施方案。

在另一个实施方案中，提供了药物组合物。所述药物组合物包含治疗有效量的修饰颗粒体蛋白前体表达的效应物和药学上可接受的载体，其中所述治疗有效量包含能减轻或预防由环境对患者的损伤介导的神经变性疾病的症状的量。使用介导颗粒体蛋白前体表达的效应物的任意上述实施方案适用于这个实施方案。

在另一个实施方案中，提供了用于减少患者中神经元细胞死亡的方法。该方法包含下述步骤：给由环境损伤介导的神经变性疾病患者施用治疗有效量的修饰颗粒体蛋白前体表达的效应物，其中效应物的量可以有效地增加患者中的神经元细胞存活或增殖。在另一个例证性的实施方案中，效应物的量可以有效地增加神经元中颗粒体蛋白前体的表达。在其它例证性的实施方案中，效应物的量可以有效地降低非神经元细胞中颗粒体蛋白前体的表达。使用介导颗粒体蛋白前体表达的效应物的任意上述实施方案适用于这个实施方案。

实施例1

动物

使用CD-1群体饲养的购自Charles River(Wilmington，MA)的5-7个月龄的雄性小鼠，进行体内实验。

实施例2

显微镜检查

使用Motic B5 Professional Series 3.0(Motic Instruments Inc.，Richmond，Canada)照相机和Zeiss Axiovert Epiflorescence 2000显微镜，对小鼠切片进行显微镜检查并捕获所有显微照片。使用Motic B5Professional，Motic Images Advanced 3.0和配有AxioCam HRM的Zeiss Axiovert Zoom Axiovision 3.1，分析数据。

实施例3

统计分析

对于行为和组织学实验，使用在单个任务上的每只小鼠的值计算每组的平均值±S.E.M。使用未配对的双尾t检验或单向ANOVA，对比平均值。由此图基氏检验是对比ANOVA检验后的所有平均值(GraphPad Prism，San Diego，CA)。

实施例4

合成的甾基葡糖苷暴露后腿伸反射的渐进性减退

给3个月龄雄性CD-1小鼠饲喂100mg/天的合成的BSSG 15周，然后饲喂正常的实验室食物来生长。从实验开始，每周测量腿伸展。结果显示在图1中。如Wilson等人，2004和Wilson等人，2005所述，进行测试。非线性回归分析证实了对照小鼠和BSSG饲喂的小鼠的数据的显著性差异，^*＝p＜0.0001(从0-32周绘图)。甚至在BSSG暴露停止后，BSSG饲喂的小鼠的腿伸反射减退在实验期间继续进行。

腿伸反射实验用作运动神经元功能障碍的度量(Barneoud和Curet，1999)。改变该实验，以辨别更精细的行为，建立0-4的等级。该分级的实验证实了功能的渐进性丧失，因为正常的反射通常渐进地恶化成震颤，然后恶化成完全收缩。该等级允许以连续方式随时间度量进展。如下基于小鼠表现出的响应，给出0-4的评分：

4：双腿完全伸展(正常)。

3：双腿伸展，一条腿有些震颤和/或punching。

2：一条腿伸展，一条腿收缩，或双腿震颤。

1：一条腿收缩，其它腿震颤。

0：双腿收缩。

实施例5

合成的甾基葡糖苷暴露后开放场地运动活动的渐进性减少

使用实施例4中暴露于BSSG的相同小鼠，分析开放场地运动活动。^*＝p＜0.05(Student T-检验)。结果显示在图2中。在第28周通过穿过网格测得，与对照组相比，BSSG饲喂的小鼠表现出显著减少的运动。在BSSG暴露停止后，观察到开放场地运动活动的减少随时间进展。

对于开放场地运动活动分析，将小鼠放置在圆形开放场地(2m直径)中5分钟，使用摄像机记录运动，以测量易动情绪和探查(自发性运动活动)(Karl等人，2003)。在电视上重放视频，在电视屏幕上覆盖圆形格网。记录穿过网格。

实施例6

10周暴露于合成的甾基葡糖苷后运动神经元的渐进性丧失

给6个月龄雄性CD-1小鼠饲喂不同剂量的合成的BSSG 10周，然后饲喂正常食物生长1个月，再处死(参见图3，图A-C)。通过Nissl染色和胆碱乙酰基转移酶(ChAT)免疫组织化学(IHC)，定量腰索中的运动神经元，如图3A所示。定量运动皮质中的运动神经元，其中通过针对CTIP2(在皮质脊髓运动神经元中大量表达)的IHC，检测神经元，如图3C所示。通过IHC检测腰脊髓(腹角)中激活的胱天蛋白酶-3，如图3B所示。Nissl染色后，定量在BSSG停止后生长5个月的动物的腰脊髓中的运动神经元，如图3D所示(^*P＜0.01，ANOVA)。当在没有进一步的BSSG暴露下使小鼠生长时，观察到运动神经元的渐进性丧失。

用甲酚紫对腰脊髓切片染色，在40X物镜下对腹角运动神经元计数。视野中的所有运动神经元都包含在结果中。使用来自每只小鼠的多个切片(N＝6)。在间隔至少150μm的脊髓切片上(在嘴尾平面(rostral-caudal plane)中)进行计数，确保没有运动神经元计数2次。另外，计数包括所有明显的运动神经元，包括可能已经表现出萎缩或损伤的运动神经元。

如下进行有活性的胱天蛋白酶-3(Promega，Madison，WI)标记。通过基于以前工作的免疫组织化学(Schulz等人，2003；Wilson等人，2005)，鉴定有活性的胱天蛋白酶-3水平。简而言之，将载玻片固定的切片在封闭溶液中温育2小时，然后用第一抗体(Casp-3 1∶250，来自兔子)在室温温育过夜。冲洗切片，在荧光第二抗体(抗-兔子IgG1∶200，Vector laboratories Inc.，Burlingame，CA)中温育2小时。使用荧光显微镜检查，观察切片。使用含有DAPI的固定介质(Vector Laboratories，Inc.，Burlingame，CA)对所有细胞核复染色。

行为测试后，用氟烷麻醉所有动物，通过心脏穿刺灌注法，灌注冷冻的PBS和4％多聚甲醛(PFA)。然后将脑和脊髓样品浸入4％PFA中2天，在20％蔗糖、0.5％叠氮化钠溶液中冷冻保护1天，并冷冻，直到切片用于免疫组织化学。通过本领域已知的任意免疫组织化学染色方法，可以进行该试验。

实施例7

用于检测正常小鼠脑干中颗粒体蛋白前体表达的原位杂交

在切成矢状切面的石蜡包埋的正常成年小鼠脑上，进行使用颗粒体蛋白前体特异性的反义核糖核酸探针的ISH。在具有神经元形态学的大细胞中检测到高水平的颗粒体蛋白前体表达，10X放大率如图4A所示，40X放大率如图5A所示。图4B和图5B分别显示了用有义探针温育的在10X放大率和40X放大率的对照切片。

实施例8

用于检测正常小鼠颈脊髓的

前角细胞中颗粒体蛋白前体表达的原位杂交

在切成横切面的冷冻的正常成年小鼠脊髓切片上，进行使用颗粒体蛋白前体特异性的反义核糖核酸探针的ISH。在前角运动神经元中检测到高水平的颗粒体蛋白前体表达，如图6A所示，对照切片如图6B所示，用有义探针温育。

实施例9

洗过的苏铁粉饲喂的小鼠的运动皮质中减少的颗粒体蛋白前体表达

给成年雄性CD-1小鼠饲喂正常食物或含有1g/天洗过的苏铁粉的食物。饲喂10周后，杀死小鼠，在冷冻的运动皮质切片上，进行使用颗粒体蛋白前体特异性的核糖核酸探针的ISH。使用反义探针，在对照小鼠皮质的第4-5层中检测到高水平的颗粒体蛋白前体表达(图7A)。相反，使用反义探针，苏铁饲喂的小鼠的皮质表现出钝化的颗粒体蛋白前体表达，如图7B所示。在按照单个细胞的基础上，在来自苏铁饲喂的小鼠的组织中，存在减少的颗粒体蛋白前体表达。没有证据表明，苏铁治疗后，皮质的结构完全破裂。图7C显示了用有义探针温育的对照切片(放大率10X)。在图8A-C中，在更高的放大率(放大率40X)，描绘了在图7中显示的相同切片。

实施例10

暴露于合成的BSSG导致颈脊髓中减少的颗粒体蛋白前体表达

给成年雄性CD-1小鼠饲喂正常食物或含有1000μg/天的合成BSSG的食物。用含有BSSG的食物饲喂10周、并用正常的实验室食物另外1个月后，杀死小鼠，在切成横切面的冷冻的颈脊髓切片上，进行使用颗粒体蛋白前体特异性的反义核糖核酸探针的ISH。在对照小鼠的前角细胞中检测到高水平的颗粒体蛋白前体表达，如图9A中的切片所示。在BSSG处理的小鼠(切片显示在图9B中)中，颗粒体蛋白前体表达的强度降低，且在更少的前角细胞中观察到。阴性对照切片显示在图9C中，用有义探针温育。

实施例11

增加的BSSG暴露导致更显著的

神经病理学和颈脊髓中颗粒体蛋白前体表达的丧失

给成年雄性CD-1小鼠饲喂含有10、100或1000μg/天的合成BSSG的食物。用含有BSSG的食物饲喂10周、并用正常的实验室食物另外1个月后，杀死小鼠，在切成横切面的冷冻的颈脊髓切片上，进行使用颗粒体蛋白前体特异性的核糖核酸探针的ISH。更显著的神经病理学与增加的BSSG暴露一起出现。表达颗粒体蛋白前体且表现出运动神经元形态学的细胞的渐进性丧失与增加的BSSG暴露有关。另外，随着BSSG暴露增加，每个细胞存在更显著的颗粒体蛋白前体表达的丧失。在图9和10中评判的小鼠与在实施例3中分析的小鼠相同，在后者中观察到腰脊髓中运动神经元健康的剂量依赖性的丧失(参见图3，图A，B，和D)。

实施例12

斑马鱼中颗粒体蛋白前体表达的敲低导致腹角细胞的丧失

斑马鱼品系和饲养

野生型斑马鱼(zdr品系)购自Aquatica Tropicals Inc.(Plant City FL)，在28.5℃，在实验室水族箱(Allantown Aquaneering，Allantown，NJ)中，维持14h/10h光照/黑暗周期。每天喂鱼2次，如别处(Mullins等人，1994)所述进行繁殖。从罐收集用于发育研究的胚胎，并根据常规标准(Kimmel等人，1995)和受精后小时数(hpf)分阶段。

胚胎显微注射

在25ng/uL的浓度，将Morpholinos(Gene Tools LLC，Philomath OR)重新悬浮于100uL无菌水中。包含由1-15ng/nL的在Danieu缓冲液(58mM NaCl，0.7mM KCl，0.4mM MgSO₄，0.6mM Ca(NO₃)₂，5.0mMHEPES；pH7.6)中稀释的Morpholinos(MO)和0.05％酚磺酞组成的注射溶液，作为视觉示踪剂(Nasevicius等人，2000)。以1-15ng MO/胚胎，注射在1-和2-细胞阶段的斑马鱼胚胎。用于靶向斑马鱼pgrn-a的5′UTR的Morpholinos和对照组如下：

MO2-UTR，5’-GAGCAGGTGGATTTGTGAACAGCGG-3’

MO2-错配，5’-GAACACGTGGATTTCTGAAGAGAGG-3’

乱序，5’-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3’。

15ng/胚胎(7.5ng/nl)的浓度视作上限，因为乱序的对照组在该浓度生成一致的少数非特异性的发育缺陷。使胚胎在28.5℃发育，直到在不同的发育阶段收获用于分子分析。

全固定免疫荧光

为了Zn8免疫染色，使用在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的4％多聚甲醛(PFA)在室温固定胚胎2小时，然后在-20℃在100％甲醇中储存。用PBST(100mM Na₂HPO₄，20mM KH₂PO₄，137mM NaCl，27mM KCl，0.1％吐温-20，pH 7.4)再水合胚胎，并通过用10μg/ml蛋白酶K消化20分钟进行透化，随后在4％PFA/PBS中后固定20分钟。几次PBST洗涤后，在含有5％小牛血清的PBST中封闭胚胎。3小时后，以1∶1000稀释度加入第一抗体单克隆抗-Zn8(ZIRC，Eugene OR)，在4℃温育过夜。在PBST中充分洗涤后，在含有5％小牛血清的PBST中，以1∶200用Alexa488缀合的抗-小鼠(Invitrogen)温育胚胎2小时。用配有GFP滤光片的Leica MZ FLIII立体显微镜观察荧光。

如图11所示，斑马鱼中颗粒体蛋白前体表达的敲低导致颅面畸形发生、心包水肿和内脏肠膨胀的形态学现象。另外，尽管在照片中不可见，观察到运动神经元的丧失。

实施例13

NSC34细胞培养

除非另有说明，在含有10％胎牛血清的DMEM中维持NSC34细胞系[参见Cashman等人，Dev Dyn.194：209-21(1992)]。为了稳定转染，使用Lipofectamine(Invitrogen)，用人颗粒体蛋白前体(pcDNA-Pgrn)或空载体(pcDNA)转染NSC34细胞，根据生产商的说明书，用G418选择1个月。使用200,000细胞/孔，在6-孔平板中进行血清剥夺试验，在4ml RPMI(含有谷氨酰胺)中培养3、6、9、12和15天，不加入或更换新鲜培养基。对于每个时点，使用Olympus相差显微镜，在10X放大率，对于每个孔在6个视野中测定平均细胞数(图14，图A)。

对于低氧试验，在50,000/孔的密度，将细胞涂布在24-孔平板中，在无血清的RPMI中饥饿24小时，随后加入新鲜的无血清的RPMI或含有5％血清的DMEM，在含有1％O₂、5％CO₂、平衡N₂的低氧室中维持72小时。将细胞在低氧环境中维持3天，用胰蛋白酶处理，并用血细胞计数器计数(图15)。

对于长期培养物，在200,000/孔的密度，将NSC34细胞涂布在6-孔平板中，并维持在无血清的RPMI培养基中。每隔10天提供新鲜的培养基，使用Olympus相差显微镜，在第20和57天拍摄10X放大率照片(图16)。

实施例14

NSC34细胞免疫荧光

在玻璃盖玻片上，在含有10％胎牛血清的DMEM中，培养NSC34细胞系和稳定的转染子。在4％PFA中固定细胞，用PBST冲洗2次，用透化缓冲液(含有0.2％Triton X-100的PBST)温育20分钟。用PBST洗涤3次后，用4％PFA后固定培养物10分钟，然后充分洗涤。在含有0.5％(w/v)膜封闭试剂(GE Healthcare)的PBST中温育固定化的细胞1小时，然后加入绵羊抗-小鼠颗粒体蛋白前体(1∶500稀释度，R&DSystems)。

在4℃继续用第一抗体温育过夜。在PBST中洗涤培养物3次，然后用驴抗-绵羊Alexa-488(1∶200，Invitrogen)和鬼笔环肽-Alexa-594缀合物(20uM)一起在室温在封闭缓冲液中温育45分钟。在PBST中洗涤细胞3次，然后在室温在黑暗中使用在PBS中的300nM 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染色5分钟。在PBST中洗涤培养物3次，用ddH₂O洗涤2次，然后使用Immu-mount(Thermo Fisher)固定在载玻片上。用配有适当荧光滤光片的Axioskop 2显微镜观察荧光。使用Adobe Photoshop 7.0，合并图像(图17)。

实施例15

细胞凋亡TUNEL试验

以200,000/孔，将NSC34细胞涂布在6-孔平板中的光蚀刻的德国玻璃盖玻片(Electron Microscopy sciences)上，在4ml RPMI(含有谷氨酰胺)中培养6天。在固定时，在PBS中洗涤细胞2次，然后使用4％PFA/PBS固定20分钟。在PBS中冲洗3次后，在透化缓冲液(含有0.2％Triton X-100的PBST)中温育细胞20分钟。随后用4％PFA/PBS后固定细胞10分钟。用PBST充分洗涤后，在4℃在无菌PBS中储存细胞。

在处理时，用PBS冲洗细胞1次，然后根据生产商说明书的指导，覆盖来自荧光素原位死亡检测试剂盒(Roche Applied Science)的反应溶液。在37℃温育细胞1小时，然后在室温在黑暗中用PBST冲洗2次。在PBST中冲洗3次后，在黑暗中用300nm DAPI复染色细胞5分钟。然后用PBST冲洗细胞2次，用ddH₂O冲洗1次，然后使用Immu-mount(Thermo Fisher)固定在载玻片上。用配有适当滤光片的Axioskop 2显微镜观察荧光，通过目检手工计数总细胞(DAPI)和凋亡细胞(FITC)(图14，图C)。

实施例16

溴脱氧尿苷(BRDU)增殖试验

以200,000/孔，将NSC34细胞涂布在6-孔平板中的光蚀刻的德国玻璃盖玻片(Electron Microscopy sciences)上，在4ml RPMI(含有谷氨酰胺)中培养6天。在固定/处理前12小时，以10uM的浓度，将BrdU标记溶液(Roche Applied Sciences)加入每个孔。在固定时，在PBS中洗涤细胞3次，以去除多余的未掺入的BrdU，然后使用4％PFA/PBS固定20分钟。在PBST中冲洗3次后，在透化缓冲液(含有0.2％TritonX-100的PBST)中温育细胞20分钟。随后用4％PFA/PBS后固定细胞10分钟。用PBST冲洗3次后，在室温在0.1M硼酸钠pH 8.5中放置细胞2分钟。

在含有0.5％(w/v)膜封闭试剂(GE Healthcare)的PBST中温育培养物1小时，随后在室温加入在封闭缓冲液中的抗-BrdU Alexa-488(1∶200，Invitrogen)45分钟。在PBST中冲洗3次后，在黑暗中用300nm DAPI复染色细胞5分钟。然后用PBST冲洗细胞2次，用ddH₂O冲洗1次，然后使用Immu-mount(Thermo Fisher)固定在载玻片上。用配有适当滤光片的Axioskop 2显微镜观察荧光，通过目检手工计数总细胞(DAPI)和增殖细胞(Alexa-488)(图14，图B)。

实施例17

初始的小鼠运动神经元

从胚胎第13天(E13)小鼠制备离解的初始运动神经元培养物，涂布在25mm或14mm盖玻片(Electron Microscopy Sciences)上，离解后生长4-7周[参见Roy等人，J.Neurosci.18：9673-9684(1998)]。使用4％PFA，在起始平板内固定培养物，用PBST冲洗2次，并用透化缓冲液(含有0.2％Triton X-100的PBST)温育20分钟。用PBST洗涤3次后，用4％PFA后固定培养物10分钟，然后充分洗涤。在含有0.5％(w/v)膜封闭试剂(GE Healthcare)与50ug/ml山羊抗-小鼠Fab(Rockland Immunochemicals)的PBST中温育固定的培养物1小时，然后加入绵羊抗-小鼠颗粒体蛋白前体(1∶500稀释度，R&D Systems)和小鼠抗-SMI 32，(1∶1000，Sternberger Monoclonals)。

继续在4℃用第一抗体温育过夜。在PBST中洗涤培养物3次，然后用驴抗-绵羊Alexa 594(1∶200，Invitrogen)和山羊抗-小鼠Alexa-488(Invitrogen)在封闭缓冲液中在室温温育45分钟。在PBST中洗涤细胞3次，然后在室温在黑暗中使用在PBS中的300nM 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染色5分钟。用PBST洗涤培养物3次，用ddH₂O洗涤2次，然后使用Immu-mount(Thermo Fisher)固定在载玻片上。用配有适当荧光滤光片的Zeiss Axioskop 2显微镜观察荧光。使用Adobe Photoshop 7.0，合并图像(图12)。基于SMI32免疫反应性和细胞体大小[参见Roy等人，J Neurosci.18：9673-9684(1998)]，鉴定异质培养物中的初始运动神经元。

实施例18

小鼠脊髓冷冻切片

在免疫荧光之前，在-80℃储存OCT固定的8周龄CD-1小鼠冷冻切片。在室温融化冷冻切片，用4％PFA固定，用PBST冲洗2次，用透化缓冲液(含有0.2％Triton X-100的PBST)温育20分钟。用PBST洗涤3次后，用4％PFA后固定培养物10分钟，然后充分洗涤。在含有0.5％(w/v)膜封闭试剂(GE Healthcare)与50ug/ml山羊抗-小鼠Fab(Rockland Immunochemicals)的PBST中温育固定的切片1小时，然后加入绵羊抗-小鼠颗粒体蛋白前体，(1∶500稀释度，R&D Systems)和小鼠抗-SMI 32(1∶1000，Sternberger Monoclonals)。

继续在4℃用第一抗体温育过夜。在PBST中洗涤培养物3次，然后用驴抗-绵羊Alexa 594(1∶200，Invitrogen)和山羊抗-小鼠Alexa-488(Invitrogen)在封闭缓冲液中在室温温育45分钟。在PBST中洗涤细胞3次，然后在室温在黑暗中使用在PBS中的300nM 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染色5分钟。用PBST洗涤培养物3次，用ddH₂O洗涤2次，然后使用Immu-mount(Thermo Fisher)固定在载玻片上。用配有适当荧光滤光片的Zeiss Axioskop 2显微镜观察荧光。使用Adobe Photoshop 7.0，合并图像(图13)。基于SMI32免疫反应性和细胞体大小[参见Roy等人，J Neurosci.18：9673-9684(1998)]，鉴定组织切片中的运动神经元。

实施例19

轴突切断术

切断对照小鼠(C57bl/6)的单侧邻近L3-L5脊髓根的轴突，在轴突切断后第3或7天进行尸体解剖。在手术时小鼠是6周龄，在轴突切断后，恢复随意接近食物和水。麻醉小鼠，通过心脏灌注杀死。从运动单元起始的脊髓水平，得到石蜡切片，使用常规免疫组织化学(1∶200，R&D Systems，在4℃过夜，在沸腾的高pH TRIS-EDTA缓冲液中回收抗原7分钟；第二抗体显影使用Vector生物素化的抗-绵羊和VectastainElite ABC试剂盒和DAB显影)，对切片染色，检查颗粒体蛋白前体免疫反应性(图18)。

实施例20

针对PC12细胞中MPTP毒性的保护

在有添加了谷氨酰胺、青霉素和链霉素的10％胎牛血清(FCS)存在下，在胶原包被的96-孔平板上，在Dulbecco’s最低必需培养基(DMEM)中培养PC12细胞。涂布后1天(在60-70％汇合，约40,000个细胞/孔)，用含有4nM颗粒体蛋白前体(PGRN+)或不含有颗粒体蛋白前体(PGRN-)的低血清(2％FCS)培养基替换生长培养基(图19)。24小时后，去除培养基，在有含有1％FCS的DMEM存在下，将细胞暴露于：0、100、200、500或1000μM MPTP。培养另外24h后，去除含有MPTP的培养基，进行甲基噻唑基四唑盐(MTT)比色试验，以评判细胞生存力[参见Zheng等人，In Vitro Cell Dev Biol Anim.43(5-6)：155-158(2007)]。

实施例21

阿尔茨海默氏病的治疗

阿尔茨海默氏病的Tg2576小鼠模型在高水平表达在仓鼠蛋白酶传染性因子蛋白启动子控制下的APP的瑞典突变(APP_{K67ON，M671L})。这些小鼠产生高水平的脑Aβ，并发展渐进性的、年龄有关的淀粉状蛋白斑块形式在海马中沉积，这类似于在人中观察到的。为了评判颗粒体蛋白前体对这些斑块的发展的影响，通过单侧海马内输注编码绿荧光蛋白(GFP)或颗粒体蛋白前体(PGRN)的重组慢病毒载体，治疗8个月龄的小鼠。然后通过在12个月龄时灌注，处死动物。在自由漂浮的20μm冠状物切片上，进行Aβ沉积的免疫细胞化学分析。对于定量评判，在3个穿过海马的切片上测量被抗-Aβ免疫反应性沉积物占据的总面积。图23显示了大脑内递送表达GFP或PGRN的慢病毒后Tg2576小鼠的存活。使用PGRN慢病毒的基因治疗导致淀粉状蛋白转基因小鼠增加的存活率。

动物：研究使用20-25g雌性Tg2576小鼠。在控温环境中饲养动物，12h光照/黑暗周期，随意接近标准的食物和水。在该研究中使用的规程经过Mayo Foundation Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)的批准。

病毒载体递送：使用异氟烷(1％)麻醉动物，放在Kopf立体定位架中。为了海马转导，以0.25μl/分钟的速率，经过输注插管，将GFP或PGRN慢病毒载体在单侧注射进左海马(A.P.-1.7，M.L.-1.5，D.V.-2.3)(2μl/部位)，所述输注插管通过聚乙烯导管(50PE)连接至被哈佛泵驱动的50μl Hamilton注射器。输注后，使载体从插管扩散4分钟，然后抽出。

免疫组织化学：通过经心脏灌注0.9％盐水，处死小鼠，取出脑，在4％多聚甲醛中后固定，用于免疫组织化学分析。在恒冷切片机上切割对称的20μm厚的冠状物切片，在Millonigs溶液中保存。在37℃，用在Triton X-100/Tris-缓冲盐水[TB St]中的70％甲酰胺预处理自由漂浮的切片30分钟，在TBSt中冲洗。然后在含有1％H₂O₂的TBSt中温育切片30分钟，在TBSt中冲洗，并在室温在封闭溶液(5％山羊血清/100mM赖氨酸/0.3％TBSt)中温育1小时，随后在室温用Aβ第一抗体(MM-27 33.1.1；1∶2000)温育过夜。然后使用Vectastain Elite试剂盒，在生物素化的第二抗体中、随后在抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物中温育切片。将切片固定在明胶包被的载玻片上，覆盖Entallen盖玻片(图20，图A)。

定量分析：在取自背海马的切片中，在100X视野中观测Aβ沉积。为了定量评判，在3个前-后水平测量被抗-Aβ免疫反应性沉积物占据的总面积。将淀粉状蛋白负荷计算为被反应产物占据的测量视野的总面积。为每个切片中包含的整个海马区域计算测量值(图20，图B)。使用计算机辅助的图像分析系统和Zeiss Axiovision 4.7图像分析软件，得到无偏的立体测量值。研究人员不知道治疗条件。

统计分析：使用方差分析，分析数据。当得到显著的F-值时，使用Newman-Keuls进行有计划的逐对对比。当p＜0.05时，认为差异是统计上显著的。

实施例22

帕金森病的治疗

经单侧黑质内输注编码绿荧光蛋白(GFP)或颗粒体蛋白前体(PGRN)的慢病毒载体，通过治疗C57/BL6小鼠，测定颗粒体蛋白前体对1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)-诱导的帕金森病小鼠模型中多巴胺能神经元细胞丧失的影响。3周后，给动物每天注射MPTP(20mg/kg，腹腔内)，持续5天，然后在最后一次注射后10天，通过灌注进行处死。在自由漂浮的20μm冠状物切片上，进行TH的免疫标记。对于定量评判，在3个穿过SNc的切片上计数TH⁺细胞的总数。

动物：研究使用20-25g雄性C57/Bl6小鼠。在控温环境中饲养动物，12h光照/黑暗周期，随意接近标准的食物和水。在该研究中使用的规程经过动物保护协会委员会的批准。

病毒载体递送：使用异氟烷(1％)麻醉动物，放在Kopf立体定位架中。为了黑质内转导，以0.25μl/分钟的速率，经过输注插管，将GFP或PGRN LV载体在单侧注射进左SNc(A.P.-2.8，M.L.-1.3，D.V.-4.5)(2μl/部位)，所述输注插管通过聚乙烯导管(50PE)连接至被哈佛泵驱动的50μl Hamilton注射器。输注后，使载体从插管扩散4分钟，然后抽出。

免疫组织化学：通过经心脏灌注0.9％盐水，处死小鼠，取出脑，在4％多聚甲醛中后固定，用于免疫组织化学分析。在恒冷切片机上切割对称的20μm厚的冠状物切片，在Millonigs溶液中保存。在37℃，用在Triton X-100/Tris-缓冲盐水[TBSt]中的70％甲酰胺预处理自由漂浮的切片30分钟，在TBSt中冲洗。然后在含有1％H₂O₂的TBSt中温育切片30分钟，在TBSt中冲洗，并在室温在封闭溶液(5％山羊血清/100mM赖氨酸/0.3％TBSt)中温育1小时，随后在室温用Aβ第一抗体(MM-2733.1.1；1∶2000)温育过夜。然后使用Vectastain Elite试剂盒，在生物素化的第二抗体中、随后在抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物中温育切片。将切片固定在明胶包被的载玻片上，覆盖Entallen盖玻片(图21，图A)。

细胞计数：由不清楚治疗历史的观察人员计数免疫阳性的细胞体的数目。使用计算机辅助的图像分析系统和Zeiss Axiovision 4.7图像分析软件，得到无偏的立体测量细胞计数。为了计数黑质的细胞，通过在一组用于描绘SNc的清楚的解剖学标志/边界内的TH-阳性细胞的分布，定义致密层区域。使用含有视觉格网的20X物镜(取样框面积90,000μm²)，计数免疫阳性的细胞。将计数框放置在计数区域上，然后系统地在X-Y方向移动，直到对整个描绘的区域取样。在每只动物的4个切片上计数免疫阳性细胞的数目，对每只动物总计(图21，图B)。

统计分析：使用具有单独方差的双尾Student t检验，分析数据，置信区间为95％。当p＜0.05时，认为差异是统计上显著的。

实施例23

用颗粒体蛋白上皮肽模块(GEMs)温育永生的运动神经元细胞系会影响细胞增殖/存活

使用100ul DMEM/10％FBS，在96孔平板中涂布NSC 34细胞(5000细胞/孔)。次日，去除培养基，替换为100ul RPMI(没有血清)，其含有：0、50或100ng/ml grn D或grn F。将培养物温育13天，然后使用CyQUANTNF(试剂盒#C35006)试验，测定细胞增殖/存活。

CyQUANTNF试验的基础是，通过荧光染料结合，测量细胞DNA含量。通过对比用GEMs(50和100ng)处理过的NSC-34细胞和未处理的对照组(0ng)的荧光强度，测定增殖/存活的程度。

按照生产商的说明书，该方案包括，抽吸生长培养基，替换为100ul染料结合溶液/孔，温育30分钟，然后使用在～485nm激发且在～530nm发射检测的荧光微板读数器，测量每个样品的荧光强度(图22)。永生的运动神经元细胞系(NSC-34)对grn F和grn D温育的应答是增殖/存活(grn F)或无作用(grn D)，类似于在有这些GEMs存在下温育的其它神经元细胞的应答(描述在：Tolkatchev D.等人，Protein Sci.17：711-724，2008)。

实施例24

表达颗粒体蛋白前体的慢病毒保护BSSG攻击的小鼠

图24显示了PGRN慢病毒治疗的小鼠中的脊运动神经元计数和胆碱乙酰转移酶活性。通过Nissl染色评判运动神经元计数。与对照(盐水治疗的)BSSG暴露的小鼠相比，BSSG暴露的PGRN-慢病毒治疗的小鼠中的运动神经元计数更正常，0.068的P值(Student t检验)接近显著性。胆碱乙酰转移酶(ChAT)的免疫组织化学评判表明，与所有其它治疗组相比，盐水治疗的BSSG暴露的小鼠的前角细胞中的该运动神经元标记的活性降低(图24中图(B)的右上角图)。对于Nissl染色，在对照(盐水治疗的)BSSG暴露的小鼠中的ChAT阳性的运动神经元数目显得减少(图24，图C)。

慢病毒载体：在与Invitrogen Corporation(Carlsbad，CA)的合同下，设计和生产了表达颗粒体蛋白前体的慢病毒载体。通过杀稻瘟素抗性试验，确定滴度是1x10⁸TU/mL。在注射日之前，在冷冻瓶中在-80℃冷冻保存慢病毒。

动物：在22℃单个饲养从Charles River Laboratories(Wilmington，MA)得到的雄性CD-1小鼠，12∶12h光照/黑夜周期。将40只动物随机地分成4组：i)注射PGRN-LV，饲喂BSSG，ii)注射PGRN-LV，饲喂正常小鼠食物，iii)注射盐水，饲喂BSSG，和iv)注射盐水，饲喂正常小鼠食物。实验操作经过英属哥伦比亚大学动物保护委员会(University of British Columbia Committee on Animal Care)的批准。

病毒施用：在3个月龄时，使用异氟烷麻醉接受表达颗粒体蛋白前体的慢病毒的雄性CD-1小鼠和注射盐水的对照小鼠，并通过直接注射进右腓肠肌，递送慢病毒载体或盐水对照。进行5次注射，每次5μl(1x10⁸TU/ml)，以便增加转导的运动神经元的数目。

BSSG施用：在与英属哥伦比亚大学化学系的合同的基础上，合成β-谷甾醇β-D-葡糖苷(BSSG)。使用NMR(¹H和¹³C)和高分辨率质谱法，表征合成的化合物。通过HPLC，验证至少95％的纯度。为了在希望的浓度(2mg BSSG/天)制备实验颗粒，将BSSG与磨碎的小鼠饲料颗粒(Mouse Diet，Lab Diet，Richmond，IN)相混合。在肌肉内注射后，初始化饲喂范例3周。每天早晨提供处理过的颗粒，一旦动物已经摄取提供的颗粒，在下午恢复随意接近常规食物。一般而言，在BSSG组中的所有小鼠常规地吃整个颗粒。对照小鼠仅饲喂正常小鼠食物。每天进行BSSG饲喂，持续15周，然后是5周清除期。

组织学：在处死时，用氟烷麻醉动物，通过心脏穿刺冷冻的PBS和4％多聚甲醛(PFA)进行灌注。取出脊髓和脑样品，浸入4％PFA中2天，在含有30％蔗糖的0.01M磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液pH 7.4中冷冻保护1天，然后在-80℃冷冻保存，直到在Leica CM3050S(Leica Microsystems，Nussloch，Germany)驱动的恒冷切片机上切片，用于免疫组织学。以20μm，将脊髓连续切片。以冠状平面，将腰脊髓(L4-L6)切片[Wilson等人，Neuromolecular Medicine，3，105-118(2003)；Wilson等人，Neuroimage，23，336-343(2004)]。同时对所有动物的切片进行免疫组织化学。由不知道小鼠身份的观察人员，对染色的切片进行显微镜检查，并记录标记的水平。

Nissl染色：使用Nissl染色，确定运动神经元计数。如下制备0.5％甲酚紫溶液：将0.5g甲酚紫醋酸盐(Sigma-Aldrich Inc.，St.Louis，MO)加入100mL温热的ddH₂O，然后用10滴冰醋酸酸化。已经混合和冷却溶液后，通过滤纸(Whatma#1)进行过滤。首先在1X PBS中冲洗载玻片固定的切片2次各2分钟，以去除多余的O.C.T.。然后，将切片放入95％乙醇(5分钟)、70％乙醇(3分钟)和dH₂O(2分钟)。将载玻片放在0.5％甲酚紫溶液中染色3分钟。染色后，在ddH₂O中冲洗载玻片1分钟，然后在70％乙醇+1％醋酸(1.5分钟)、70％乙醇(30秒)、95％乙醇(2分钟)中脱水，2次更换100％乙醇(几次浸入)和2次更换二甲苯(几次浸入)。使载玻片干燥，然后在Clarion^TM固定介质(Sigma-Aldrich Inc.，St.Louis，MO)中固定。

免疫组织化学：使用非荧光二氨基联苯胺方法，测定胆碱乙酰转移酶(ChAT，Millipore，Billerica，MA)水平。首先在1X PBS(5分钟)中冲洗含有固定的腰脊髓切片的载玻片2次。使用在PBST(PBS+0.5％Triton X-100)中的3％过氧化氢，猝灭内源过氧化物酶活性5分钟。在1X PBS(2分钟)中冲洗切片2次，然后在室温(RT)在含有10％正常血清+1％牛血清白蛋白(BSA)的PBST中封闭1小时。在含有1％正常血清+1％BSA的PBST中稀释第一抗体。稀释度和温育时间和温度如下：ChAT(1∶100，1小时，在室温)。第一抗体温育步骤后，在1X PBS中冲洗载玻片2次，然后在室温在第二抗体(Vectastain ABC Elite试剂盒，Vector Laboratories Inc.，Burlingame，CA)中温育1小时。在1XPBS(2X 2分钟)中冲洗切片，然后在室温在Vectastain ABC Elite试剂中温育另外30分钟。再在1X PBS(2X 2分钟)中冲洗载玻片。使用Vector过氧化物酶底物试剂盒-DAB进行显色。显示希望的褐色需要1-2分钟。当达到希望的颜色时，在ddH₂O中冲洗载玻片5分钟，在0.5％甲基绿中复染色10分钟。复染色后，在dH₂O中简单地冲洗载玻片，2次更换95％乙醇和2次更换100％乙醇。使载玻片干燥，然后在固定介质中固定。

显微镜检查：使用Motic B5 Professional Series 3.0显微镜(Motic Instruments Inc.，Richmond，ON)观察切片，使用Motic Images Advanced3.0软件捕获照片。

实施例25

颗粒体蛋白前体过表达保护NSC-34细胞免受BSSG-诱导的毒性

使用添加了5％(v/v)胎牛血清(FCS)的DMEM，培养正常的NSC-34和过表达人PGRN的稳定的NSC-34转染子(NSC-34-hPGRN)NCS34。以8,000细胞/孔的密度，将细胞等分进96-孔平板中的200uL含有5％FCS的DMEM。2小时后，以0、100、250、500、1000和2500ng/mL的浓度，始终与0.1％(v/v)DMSO一起加入神经毒素β-谷甾醇葡糖苷(BSSG)，最终培养体积是250uL。作为细胞增殖/存活的阴性对照，洗涤一系列孔，将培养基替换为不含有FCS的DMEM。72小时后，使用MTT试验(Vybrant MTT细胞增殖试验；Invitrogen)，根据生产商的说明书，测量细胞生存力。

NSC-34细胞是运动神经元功能的永生模型，已经证实BSSG会在该细胞系中造成细胞毒性[Cashman等人，Dev Dyn 1992，194(3)：209-221；Tabata等人，Neuromuscular Med 2008，10(1)：24-39]。颗粒体蛋白前体(PGRN)促进许多细胞系的生长和存活，包括在血清剥夺下大鼠运动神经元增加的存活[Van Damme等人，J Cell Biol 2008，181(1)：37-41]。为了确定PGRN是否能保护NSC-34细胞对抗BSSG神经毒性，开发了稳定的转染子来组成性地过表达人PGRN。在与1000和2500ng/mL的BSSG温育72小时期间，颗粒体蛋白前体保护NSC-34细胞(图25)。另外，PGRN过表达增加了无血清培养物中的细胞存活。

实施例26

颗粒体蛋白前体蛋白能保护血清剥夺下的永生的运动神经元细胞系NSC-34

加入培养的NSC-34细胞中的人重组颗粒体蛋白前体(PGRN)蛋白，导致血清饥饿后的细胞存活增加至2.5倍(第4天)(图26)。使用添加了5％(v/v)胎牛血清(FCS)的DMEM，培养正常的NSC-34细胞。以6,000细胞/孔的密度，将细胞等分进96-孔平板中的200uL含有5％FCS的DMEM。培养2小时(以确保细胞粘附)后，去除培养基，用PBS洗涤细胞1次，给细胞加入含有或不含有hPGRN(100ng/ml)的DMEM无血清培养基。培养1天和4天后，使用Alamar Blue方法(Molecular Probes/Invitrogen)，按照生产商的说明书，检测剩余的有代谢活性的细胞。该数据指示PGRN蛋白的功能的保存。

实施例27

在体内证实部分颗粒体蛋白前体挽救斑马鱼运动系统中的发育/存活缺陷

在斑马鱼发育的第一天，将神经肌肉连接限制为3个初始的运动神经元(CaP，MiP和RoP)每个脊髓半区段，它们在这里神经支配3个生肌节区域，后者最终发育成体壁肌肉。在最初的24hpf，CaP轴突伸出，以建立共同径路。这是在图27和28中包括的发育阶段。

在26-28hpf，在全固定的胚胎中检查腹初始神经元的发育，并通过使用znp1单克隆抗体的免疫染色进行观察，所述znp1单克隆抗体标记初始运动神经元。(Cap神经元的野生型发育表现出仅超过“选择点”的分枝(图27，图F，双箭头))。

颗粒体蛋白前体-A的敲低(使用针对5′UTR的MO)产生许多morphant表型，从截短(图27，图A，B，黑色箭头)、成熟前分枝(图27，图B，黑色箭头)到完全缺失初始运动神经元(图27，图C)。颗粒体蛋白前体mRNA与颗粒体蛋白前体-A MO的共注射，产生部分挽救(图27，图D和E)。截短的神经元存在减少的发生率(P＜0.001)(图27，图D，白色箭头)，早期和晚期分枝存在增加的发生率(P＜0.001)(图27，图E，白色箭头)，如表2所示。从50个胚胎(野生型，颗粒体蛋白前体MO，颗粒体蛋白前体MO+mRNA)累积数据集。这些数据表明，分枝的腹运动神经元的发育对颗粒体蛋白前体-A过表达或低表达非常敏感。

表2.颗粒体蛋白前体敲低诱导异常的腹运动轴突/神经生长

每个受影响侧的指定运动轴突/神经缺陷的平均数(n＝50/组)

通过student-Newman-keuls多重比较检验，确定显著性

a-野生型截短与MO2的对比，p＜0.001

b-MO2截短与MO2+100pgpgrnA mRNA的对比，p＜0.001

c-野生型分枝与MO2的对比，p＜0.05

d-MO2分枝与MO2+100pgpgrnA mRNA的对比，p＜0.001

Smn1敲低导致截短的(图28，图A；黑色箭头)和分枝的运动轴突/神经(图28，图B；黑色箭头)。尽管Smn1 MO与共注射Smn1 MO和颗粒体蛋白前体-A mRNA之间的截短平均值不是统计上显著的，胚胎的每个受影响侧从0.38减小至0.18的平均值，证实截短缺陷的部分挽救(表：3，图28，图C；白色箭头)，并与图27(图C；白色箭头)和表3所示结果类似地增加分枝的轴突/神经。

表3.Smn1 MO和100pg颗粒体蛋白前体A mRNA的共注射会减少截短和增加腹运动轴突/神经生长的分枝

通过student-Newman-keuls多重比较检验，确定显著性

a-野生型分枝与Smn1MO的对比，p＜0.001

b-野生型分枝与Smn1 MO+100pg颗粒体蛋白前体A mRNA的对比，p＜0.001

c-野生型分枝与100pg颗粒体蛋白前体A mRNA的对比，p＜0.001

鱼饲养：野生型斑马鱼购自Aquatica Tropicals(Florida)，在14h/10h光照/黑暗周期、28.5℃维持在实验室水族箱(Allentown Caging Equipment Co.Inc.，Allentown，NJ)中。每天喂鱼2次。在需要卵的前一天下午稍晚时间，将鱼转移至网，该网放置得朝向储存罐的顶部，并盖住。在早晨，在开始光照周期并已经停止产卵后，从罐底部收集已经穿过网落下的卵。收集要用于发育研究的胚胎，并按照受精后小时数(hpf)分阶段。

morpholino寡核苷酸的胚胎显微注射：从Gene Tools，Inc.(Philomath，OR)得到Morpholino寡核苷酸(MO)，并在含有0.1％酚磺酞(Nasevicius和Ekker 2000)的Danieaux缓冲液(58mM NaCl，0.7mMKCl，0.4mM MgSO₄，0.6mM Ca(NO₃)₂，5.0mM Hepes；pH7.6)中稀释。使用PLI-100显微注射系统(Harvard Apparatus，St.Laurent，QC，Canada)，将约2nL Morpholinos与0.05％FITC-葡聚糖(Sigma-Aldrich，Oakville，ON，Canada)一起注射进1-至2-细胞阶段胚胎的卵黄中。使用与Leica MZFLIII立体显微镜连接的Leica DC300F数字照相机，进行表型观察和记录，并使用Adobe Photoshop 7.0软件进行处理。PgrnAMorpholino(MO)的5′UTR区的序列是5’GAGCAGGTGGATTTGTGAACAGCGG3’。也使用针对Smn1的起始密码子AUG(5’CGACATCTTCTGCACCATTGGC3’)和Smn1UTR(5’TTTAAATATTTCCCAAGTCCAACGT)的Morpholinos。为了Morpholino注射，使用10ng PgrnA或9ng Smn1。

Pgrn mRNA的显微注射：为了Pgrn mRNA过表达和挽救试验，如下制备载体：从RZPD(Berlin，Germany)购买全长颗粒体蛋白前体-a序列，作为克隆UCDMp574E2318Q2，并亚克隆进pcDNA3.1-V5/His载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)，其中使用与起始密码子AUG重叠的正向引物和连读终止密码子的反向引物。最终的载体构建体由具有羧基末端标签(由V5表位和6x组氨酸组成)的全长颗粒体蛋白前体-A组成。针对5′UTR区设计Morpholino。由于用于mRNA显微注射的构建体不含有不翻译的5′序列，当共注射它们时，mRNA和Morpholino之间不会发生结合。使用mMessage mMachine试剂盒(Ambion，Huntingdon，England)，合成翻译增强的加帽的mRNA。为了mRNA过表达或挽救实验，使用100pg Pgrn A mRNA。

编码GFP的载体的显微注射用作对照，以证实显微注射和过表达不会固有地影响发育。首先转录克隆进pcDNA3载体中的绿荧光蛋白，每个胚胎注射高达1ng，使用Leica MZFLIII立体显微镜，在增强的GFP滤光片下观察信号。荧光GFP信号证实，mRNA是完整的，且翻译成蛋白。

免疫组织化学：给在Danieaux缓冲液中培养的胚胎(约26-28hpf)补充0.003％酪氨酸酶抑制剂1-苯基-2-硫脲(苯硫脲P-5272，Sigma-Aldrich)，以预防黑色素色素沉着的出现。手工地将分阶段的胚胎dechorionate，并在4％多聚甲醛/PBS中，在室温固定2小时或在4℃固定过夜。在PBS中洗涤几次后，在100％甲醇中保存胚胎备用。在MeOH/PBST的连续溶液中将胚胎再水化各5分钟，然后在PBST中3次。以10μg/ml的终浓度，用在PBST中稀释的蛋白酶K透化胚胎。然后在室温在4％PFA/PBS中进行后固定20分钟，然后在PBST中冲洗3次。用封闭缓冲液(5％小牛血清，1％DMSO，在PBST中)温育胚胎3-5小时。用在封闭缓冲液中稀释的znp1(ZIRC)单克隆抗体(1∶200)温育胚胎。在4℃温育过夜，然后在PBST中洗涤6次。然后在室温用在PBST中的山羊抗-小鼠AP缀合物(Calbiochem)第二抗体(用封闭缓冲液稀释至1∶200)温育胚胎2小时，然后在PBST中洗涤6次。在含有NBT和BCIP-T的染色缓冲液(100mM Tris-Hcl pH 9.5，50mM MgCl₂，100mM NaCl，0.1％吐温-20，1mM左旋咪唑)中温育胚胎。30分钟后，停止染色，在Olympus倒置相差显微镜下，观察在胚胎的躯干(排除尾巴区)内的尾部初始运动神经元(PMN)。使用OlympusDP12照相机拍摄照片，并用Adobe Photoshop 7.0软件处理。

PMN亚型生长的分析：在用Znp1单克隆抗体标记的全固定的26-28hpf胚胎中分析尾部初始运动轴突。仅对躯干PMNs(12对)打分。在24hpf，它们都已经生长得超过脊索的腹边缘，进入野生型胚胎的腹体节。当神经在脊索的腹边缘处或以上分枝时，将躯干半区段评分为“分枝的”。采用该策略来排除天然存在的分枝，它们有时在脊索腹部观察到。当神经没有生长超过水平肌隔时，也将躯干半区段评分为“截短的”。当超过一个znp1免疫标记的轴突束退出脊髓时，将这评分为“多出口”。将具有各个表型的胚胎计数，并表达为百分比。也计数每个胚胎的12对神经中有多少表现出特定缺陷。每种治疗进行至少3个实验。将值表达为平均值±平均值标准误差。使用student-Newman-keuls多重比较检验，进行统计分析。

尽管本文公开了本发明的不同实施方案，根据本领域技术人员的普通知识，可以在本发明的范围内作出许多适应和修改。这样的修改包括已知等同方案对本发明任意方面的替换，以便以基本上相同的方式达到相同的结果。数字范围包括定义范围的数字。在说明书中，词语“包含”用作开放式术语，基本上等同于短语“包括、但不限于”且词语“包括”具有对应的含义。本文对参考文献的引用不应当理解为承认，这些参考文献是本发明的现有技术。在本说明书中引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请，都通过引用并入本文，如同具体地和个别地指出每篇单独的出版物通过引用并入本文，且如同在本文中完全阐述。本发明包括基本上如前文所述并参考实施例和附图的所有实施方案和变体。