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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410852003.8 (22)申请日 2014.12.30 CCTCC NO: M 2014640 2014.12.10 A23B 7/155(2006.01) (71)申请人 华南师范大学 地址 510631 广东省广州市天河区石牌中山 大道西 55 号 (72)发明人 李淑彬 张芮宁 周仁超 (74)专利代理机构 广州市华学知识产权代理有 限公司 44245 代理人 郭炜绵 (54) 发明名称 解淀粉芽孢杆菌菌株 B014 在果蔬采后保鲜 中的应用 (57) 摘要 本发明公开了解淀粉芽孢杆菌菌株 B014 在 果蔬采后保鲜中的。
2、应用， 其包括以下步骤 ： 按 5.0的体积比将菌株 B014 种子液接种到大量 发酵培养基中， 180rpm 发酵培养 ； 发酵完成后将 发酵物离心、 收集沉淀 ； 将沉淀重悬后得到生物 保鲜菌剂 ； 将生物保鲜菌剂喷洒到采摘后的果 蔬上， 实现保鲜。本发明的生物保鲜运用了菌株 B014 产生 ACC 脱氨酶的特性， 拓宽了微生物资源 在生物保鲜剂开发中的应用， 为克服化学保鲜剂 品种少、 具有潜在毒性的缺陷提供新途径。 本发明 方法的保鲜效果显著， 可使采后果蔬在常温下的 保鲜期延长 1.5 倍以上。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (1。
3、2)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 (10)申请公布号 CN 104430834 A (43)申请公布日 2015.03.25 CN 104430834 A 1/1 页 2 1. 解淀粉芽孢杆菌菌株 B014 在果蔬采后保鲜中的应用。 2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌株B014在果蔬采后保鲜中的应用， 其特征 在于包括以下步骤 ： (1) 制备生物保鲜菌剂 ： 将解淀粉芽孢杆菌菌株 B014 接种于 LB 液体培养基中， 30 摇床振荡培养 18h， 得到种子液 ； 按 5.0的体积比将培养好的种子液接种到大量发酵培养 基， 180rpm发酵培养， 发酵完成后将发酵物5000。
4、g离心30min， 收集沉淀， 将沉淀用无菌水 重悬并用无菌水稀释 10000 倍， 即得到生物保鲜菌剂， 即为生物保鲜菌剂 ； 其中所述的大量发酵培养基组成为黄豆粉 2 (W/V)、 麦麸 2 (W/V)、 玉米粉 1 (W/ V)、 葡萄糖 0.2 (W/V)、 磷酸二氢钾 0.1 (W/V)、 氯化钙 0.1 (W/V)、 硫酸镁 0.05 (W/ V)， 余量为水， 初始 pH 值 7.2 ； (2) 将生物保鲜菌剂喷洒到采摘后的果蔬上， 喷施量以果蔬表面完全湿润即可， 实现保 鲜。 3.根据权利要求2所述的解淀粉芽孢杆菌菌株B014在果蔬采后保鲜中的应用， 其特征 在于 ： 所述的发。
5、酵培养， 培养温度为 302， 培养时间为 305h。 权 利 要 求 书 CN 104430834 A 2 1/7 页 3 解淀粉芽孢杆菌菌株 B014 在果蔬采后保鲜中的应用 技术领域 0001 本发明属于食品保鲜领域， 具体涉及解淀粉芽孢杆菌 B014 在果蔬采后保鲜中的 应用。 背景技术 0002 在果蔬采后生理性衰腐中， 乙烯扮演着重要角色， 它诱导果实的后熟， 加速果实软 化进程， 降低果蔬的储存时间。据美国农业部估计， 果蔬采后损失约 30是乙烯作用所造 成。因此， 抑制内源乙烯的合成和阻止乙烯作用的研究已成为果蔬采后延衰保鲜技术研究 的重要内容。 0003 基于乙烯调控的果蔬采。
6、后保鲜主要包括如下 2 条途径 ： 1) 物理方法， 如低温、 气调 等 ； 2) 外源施用可阻止果蔬内源乙烯合成和阻止乙烯作用的化学药剂， 如含银化合物硫代 硫酸银、 1-甲基环丙烯(1-MCP)等。 尽管乙烯调控在果蔬采后保鲜中意义重大， 但目前该类 技术仍存在一些缺陷， 如物理方法受设备场地的限制， 化学合成的乙烯调控剂具有潜在的 毒性和环境污染问题。 此外， 由于采后乙烯的合成是一个持续的过程， 因而化学保鲜剂仍需 辅以物理方法。 0004 实现果蔬采后 “完全无害保鲜” 是国际社会果蔬保鲜发展的必然趋势。有益微生 物及其代谢产物具有来源广、 易于培养、 生产周期短、 在植物内由于能增。
7、殖而能持续发挥作 用等特点， 在果蔬生物保鲜研究领域备受关注。 0005 尽管利用有益微生物对果蔬采后保鲜已有大量研究， 但目前研究主要见于利用菌 株的抗菌物质对果蔬采后病害的抑制。 利用微生物调控果蔬采后生理以延缓其生理性衰腐 相关研究极少。 0006 1- 氨基环丙烷 -1- 羧酸 (ACC) 是植物体内乙烯合成的前体。1- 氨基 - 环丙 烷 -1- 羧酸脱氨酶 (ACC 脱氨酶 ) 能够将 ACC 分解为 - 丁酮酸和氨 , 从而抑制乙烯合成， 该酶目前在植物体内尚未发现。一些植物内生细菌能够分泌 ACC 脱氨酶， 研究表明， 苗期回 接产 ACC 脱氨酶的细菌可提高植物抗旱、 涝、 。
8、盐、 抗病和抗重金 属等能力。 0007 在果蔬采后保鲜方面， 已有研究者尝试利用转 ACC 脱氨酶基因于农作物中以延长 果蔬采后保鲜时间， 该类技术现仅处于试验室研究阶段。 0008 ACC 脱氨酶产生菌直接用于果蔬采后保鲜不仅可克服化学保鲜剂品种少、 具有潜 在毒性的缺陷， 也可避免基因工程生物保鲜过程中标记抗生素在果蔬中的存在所带来的健 康、 环境不利影响， 可为实现果蔬采后 “完全无害保鲜” 提供新的途径。目前 ACC 脱氨酶产 生菌直接用于果蔬采后保鲜国内外尚无相关研究报导。 发明内容 0009 针对目前延缓果蔬采后自身生理性衰腐单纯依赖于物理方法或化学保鲜剂的缺 陷， 本发明利用解。
9、淀粉芽孢杆菌菌株 B014 能合成 ACC 脱氨酶的特性， 将其应用到果蔬采后 保鲜中， 克服了现有技术的缺陷。 说 明 书 CN 104430834 A 3 2/7 页 4 0010 解淀粉芽孢杆菌菌株B014能够在以ACC为唯一碳源的培养基中稳定传代， 其菌体 中 ACC 脱氨酶酶比活力高达 32.8mol- 丁酮酸量 /g 菌体 h。将菌株 B014 的发酵液喷 洒到采后果蔬上， 可降低供试果蔬中 ACC 含量及乙烯含量， 且明显延长内源乙烯合成的峰 值出现时间， 提高了果蔬的保质期。 0011 本发明的目的通过下述技术方案实现 ： 0012 解淀粉芽孢杆菌菌株 B014 在果蔬采后保鲜。
10、中的应用 ； 0013 具体地， 包括以下步骤 ： 0014 (1) 制备生物保鲜菌剂 ： 将解淀粉芽孢杆菌菌株 B014 接种于 LB 液体培养基中， 30摇床振荡培养18h， 得到种子液 ； 按5.0的体积比将菌株B014种子液接种到大量发酵 培养基中， 180rpm 发酵培养 ； 发酵完成后将发酵物 5000g 离心 30min， 收集沉淀 ； 将沉淀 用无菌水重悬并用无菌水稀释 10000 倍， 即得到生物保鲜菌剂 ； 0015 所述的大量发酵培养基组成为黄豆粉 2 (W/V)、 麦麸 2 (W/V)、 玉米粉 1 (W/ V)、 葡萄糖 0.2 (W/V)、 磷酸二氢钾 0.1 (W。
11、/V)、 氯化钙 0.1 (W/V)、 硫酸镁 0.05 (W/ V)， 余量为水， 初始 pH 值 7.2 ； 0016 所述的发酵培养， 培养温度为 302， 培养时间为 305h ； 0017 (2) 将生物保鲜菌剂喷洒到采摘后的果蔬上， 喷施量以果蔬表面完全湿润即可， 实 现保鲜 ； 0018 采摘后果蔬的后熟是由乙烯诱导的， 这已是公知常识 ； 本发明的菌株 B014 能够合 成 ACC 脱氨酶， 那么其自然可以应用于所有果蔬的采后保鲜， 不因本发明实施例个数的限 制而缩小了适用果蔬的范围 ； 本发明实施例重点证明了用解淀粉芽孢杆菌 B014 制成的生 物保鲜菌剂处理香蕉、 青椒、 。
12、荔枝等果蔬后， 可使其在常温下的保鲜期明显延长。 0019 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果 ： 0020 1、 本发明的生物保鲜运用了菌株B014产生ACC脱氨酶的特性， 这是有益微生物应 用于生物保鲜领域的一种新机理， 本发明可拓宽微生物资源在生物保鲜剂开发中的应用， 为克服化学保鲜剂品种少、 具有潜在毒性的缺陷提供新途径。将产生 ACC 脱氨酶的菌株直 接用于果蔬保鲜也可避免基因工程生物保鲜过程中标记抗生素在果蔬中的存在所带来的 健康、 环境不利影响。 0021 2、 本发明方法的保鲜效果显著， 可使采后果蔬在常温下的保鲜期延长 1.5 倍以 上。 0022 3、 解淀粉芽孢杆菌。
13、是一种公认的非致病菌， 已被农业部批准为饲料添加剂允许使 用的益生菌。因此， 由解淀粉芽孢杆菌所研发的生物保鲜产品具有生物安全性， 其制备简 单， 不含有毒、 有害添加， 使用具有无毒、 无污染、 无残留的优点， 符合我国生产绿色食品的 要求。 具体实施方式 0023 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述， 但本发明的实施方式不限于此。 0024 实施例 1 0025 解淀粉芽孢杆菌 B014ACC 脱氨酶分泌能力的测定 0026 解淀粉芽孢杆菌菌株 B014 是本申请发明人从植物中分离的一株植物内生细菌， 说 明 书 CN 104430834 A 4 3/7 页 5 于 2014 年 1。
14、2 月 10 日在中国典型培养物保藏中心 ( 武汉大学保藏中心 ) 进行了保藏， 保藏 地址为 ： 湖北武汉大学中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCC NO ： M 2014640， 分类 命名为解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens B014。 0027 此 外， 发 明 人 在 先 发 表 的 文 章 (Li Shu-Bin,Fang Mao,Zhou Ren-Chao,et al.Characterization and evaluation of the endophyte Bacillus B014as a potential biocontr。
15、ol agent for the control of Xanthomonas axonopodis pv.dieffenbachiae-Induced blight of AnthuriumJ.Biological Control 63(2012):9-16.) 也已经公开了该菌株， 但是该文章并未涉及该菌株有 ACC 脱氨酶能力的 记载。 0028 配制无氮培养基 (DF 培养基， 其每 L 含 ： 磷酸二氢钾 4g， 磷酸氢二钠 6g， 七水硫酸 镁0.2g， 葡萄糖2g， 柠檬酸2g， 葡萄糖酸钠2g， 琼脂20g， 余量为水， pH值为7.2)， 121灭菌 20min 后， 向培养。
16、基中添加过滤除菌后的 ACC， 使其终浓度为 3mmol/L， 倒入灭菌的平皿中， 制成以 ACC 为唯一碳源的平板， 将菌株 B014 点接于该平板上， 30培养， 待长出菌苔后， 在 同样的平板上连续传代 3 次以上仍能生长， 证明该菌株为 ACC 脱氨酶产生阳性菌株。 0029 把菌株B014接种到DF液体培养基中， 30， 180rpm培养30h后， 离心收集菌体， 菌 体于含有 ACC( 终浓度为 3mmol/L) 的 DF 液体培养基中 30诱导培养 30h， 离心收集菌体， 用灭菌的 Tris-HCl 缓冲液 (pH 7.6) 洗涤菌体 2 次， 记录菌体重量。收集的菌体转入到灭。
17、 菌研钵， 加入 1mL 0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液 (pH 值 8.5)， 液氮条件下研磨， 上清即为粗酶 液， 取粗酶液200L加入20L底物ACC(0.5mol/L)， 混匀， 置于30水浴反应15min， 加入 1mL0.56mol/L HCl 终止反应， 12000rpm 离心 5min， 取上清测定产物 - 丁酮酸的形成量， 其方法为取上清 1mL， 加入 800L 0.56mol/L HCl 和 300L 0.2 2,4- 二硝基苯肼溶液 (2mol/L HCl)中， 30保温30min后， 加入2mL 2mol/L NaOH混匀， 测定540nm处吸光值， 制 。
18、备同样条件下 - 丁酮酸标准曲线， 从其求得 - 丁酮酸的形成量。 0030 通过上述步骤得到菌体 1.168g， 用所得的菌体制成 1mL 粗酶液， 取 0.2mL 反应 0.25h 后， 测得 580nm 光吸收值为 0.967， 从 - 丁酮酸标准曲线 【y 0.694x+0.006， 其 中， y 为光吸收值 ,x 为所用 - 丁酮酸量 (mol)】求得该反应体系 - 丁酮酸量生成 量， 通过与总酶体积、 反应时间以及菌体量的换算， 解淀粉芽孢杆菌菌体 ACC 脱氨酶比活为 32.8mol- 丁酮酸量 /g 菌体 h。据报道， 当 ACC 脱氨酶酶活不低于 20mol- 丁酮酸 /(g。
19、 h) 时 , 就可以促进植物在逆境胁迫下的 生长。由此可见， 菌株 B014 具有高的 ACC 脱 氨酶产生能力。 0031 实施例 2 0032 菌株 B014 施于果蔬后果蔬中 ACC 和乙烯含量的测定 0033 将解淀粉芽孢杆菌 B014 接种于 LB 液体培养基中， 30摇床振荡培养 30h， 得到发 酵物， 然后将发酵物 5000g 离心 30min， 收集沉淀， 将沉淀用与原发酵培养基体积相当的 无菌水重悬， 得到解淀粉芽孢杆菌 B014 菌悬液。 0034 供试果蔬 ： 香蕉， 成熟、 无机械伤口， 采收后无保鲜处理、 外观整齐、 大小均一、 无病 斑。 0035 将上述制备的。
20、解淀粉芽孢杆菌 B014 菌悬液充分摇匀后， 均匀喷洒到待处理香蕉 果， 喷施量以香蕉表面完全湿润为宜， 将果品装入普通的保鲜袋中， 于 25-30洁净处储存。 说 明 书 CN 104430834 A 5 4/7 页 6 从处理后的 0 天开始， 每 2 天测定处理供试果蔬中乙烯含量和 ACC 含量， 结果如表 1 ： 0036 乙烯含量的测定方法为 ： 取2g果肉置青霉素小瓶中,密封， 每隔0.5h测定一次乙 烯释放量 , 连续测定 3h, 每个样品设置 3 次重复。从青霉素小瓶中抽取 100L 气体 , 用 岛津 GC-7AG 气相色谱仪分析。 0037 ACC 含量的测定方法为 ： 取。
21、 2g 果肉加入 80乙醇 10mL， 匀浆后于 4000rpm 离心 20min， 上清液经 55真空浓缩后加入 1mL 氯仿和 5mL 蒸馏水， 振荡， 再浓缩， 然后用蒸馏 水溶解， 成为 ACC 待测液。取 0.5mL ACC 待测液于标定体积的三角瓶中 , 加入 0.1mL 25nM HgCl2溶液和 0.1mL 蒸馏水， 用橡皮塞密封 , 用注射器注入 0.5mL 5 NaOH 与饱和 NaOCl 溶液的混合液 (v/v), 于冰浴下振荡 10min, 取 1mL 气样测定乙烯 , 根据乙烯释放量换算成 ACC 含量。 0038 表 1 0039 0040 经解淀粉芽孢杆菌B014。
22、处理的香蕉在储藏中ACC和乙烯含量明显低于同样 储存 条件下的对照组香蕉， 与对照组相比， 其 ACC 和乙烯含量峰值分别降低了 83.7、 79.1， 且峰值出现的时间分别延长了 4 6 天， 说明解淀粉芽孢杆菌 B014 能通过分解供试材料中 乙烯合成直接前体 ACC， 从而减少果实中乙烯的合成量。 0041 实施例 3 0042 用解淀粉芽孢杆菌 B014 制备生物保鲜菌剂 0043 将解淀粉芽孢杆菌菌株 B014 接种于 LB 液体培养基中， 30摇床振荡培养 18h， 得 到种子液 ； 按 5.0的体积比将培养好的种子液接种到大量发酵培养基， 180rpm 发酵培养， 发酵完成后将发。
23、酵物 5000g 离心 30min， 收集沉淀， 将沉淀用无菌水重悬并用无菌水稀 释 10000 倍， 即得到生物保鲜菌剂， 即为生物保鲜菌剂， 其中所述的大量发酵培养基组成 为黄豆粉 2 (W/V)、 麦麸 2 (W/V)、 玉米粉 1 (W/V)、 葡萄糖 0.2 (W/V)、 磷酸二氢钾 0.1 (W/V)、 氯化钙 0.1 (W/V)、 硫酸镁 0.05 (W/V)， 余量为水， 初始 pH 值 7.2 ； 发酵培 养温度为 30， 培养时间为 30h。 0044 实施例 4 0045 生物保鲜菌剂对香蕉的采后保鲜效果 0046 从栽培地采收成熟、 无机械伤口、 采收后无保鲜处理、 大。
24、小均一、 无病斑的香蕉， 将 实施例 3 制备的生物保鲜菌剂充分摇匀后， 均匀喷洒到待处理水果表面， 喷施量以表面完 全湿润为宜， 处理后将果品装入普通的保鲜袋中， 同时设置喷同样体积的灭菌水作为对照 组， 处理组与对照组于同样条件下 (25-30 ) 储存， 定期观察果品的新鲜度， 按照下列标准 对其进行新鲜度分级， 计算不同时间点的保鲜率 ( 所有果品的新鲜度平均值 / 最高新鲜度 级数 )， 结果如表 2 ： 说 明 书 CN 104430834 A 6 5/7 页 7 0047 香蕉新鲜度分级标准 ： 0 级 ： 严重腐烂 ； 1 级 ： 严重塌腐， 甚至拿不起来 ； 2 级 ： 开始。
25、 腐熟 ( 果皮黄色面积 50 )， 用手就能捏得动， 果皮皱缩 ； 3 级 ： 局部转黄变软， 果实手感 硬 ； 4 级 ： 局部转黄 ( 果皮黄色面积 50 )， 颜色不均匀 ； 5 级 ： 基本正常， 果皮稍黄 ( 黄色 面积 10 ) ； 6 级 ： 果实青绿， 质地硬， 无病斑， 果肉切口白净。 0048 表 2 0049 0050 经处理的香蕉在 25-30下储存， 第 16 天内其新鲜度平均等级仍接近于最高新鲜 度级数， 即16天内保鲜率达到95以上， 而未处理的香蕉在同样的储存条件下， 第4天后其 保鲜率即降到 90以下， 说明处理的香蕉其保鲜时间延长了 3 倍以上。 0051。
26、 实施例 5 0052 生物保鲜菌剂对青椒的采后保鲜效果 0053 从栽培地采收成熟、 无机械伤口、 采收后无保鲜处理、 外观整齐、 大小均一、 无病斑 的青椒， 将实施例 3 制备的生物保鲜剂充分摇匀后， 均匀喷洒到待处理青椒表面， 喷施量以 表面完全湿润为宜， 处理后装入普通的保鲜袋中， 同时设置喷同样体积的灭菌水作为对照 组， 处理组与对照组于同样的条件下 (25-30 ) 储存， 定期观察供试材料的新鲜度， 按照下 列标准对其进行新鲜度分级， 计算不同时间点的保鲜率 ( 所有果品的新鲜度平均值 / 最高 新鲜度级数 )， 结果如表 3 ： 0054 青椒新鲜度分级标准 ： 0级 ： 严。
27、重腐烂 ； 1级 ： 果实严重失水， 转红(失水率80， 转红面积 80 ) ； 2 级 ： 果实失水， 转红 ( 失水率 50-80或 / 和转红面积 50-80 ) ； 3 级 ： 果实失水， 干枯， 转红 ( 失水率 30-50或 / 和转红面积 30-50 ) ； 4 级 ： 果实失水 ( 失 水率 10-20 )， 果尖转红 ； 5 级 ： 果实有轻度失水和皱缩 ( 面积低于 10 )， 局部褪绿 ( 面 积 10 ) ； 6 级 ： 整果新鲜如初， 饱满圆润、 无失 水皱缩及褪绿， 无霉斑。 0055 表 3 0056 说 明 书 CN 104430834 A 7 6/7 页 8 。
28、0057 经处理的青椒在 25-30下储存， 第 20 天其新鲜度平均等级仍接近于最高新鲜度 级数， 即20天内保鲜率达到95以上， 而未处理的青椒在同样的储存条件下， 第8天后其保 鲜率即降到 71.8， 说明处理的青椒其保鲜时间延长了 1.5 倍以上。 0058 实施例 6 0059 生物保鲜剂对荔枝的采后保鲜效果 0060 从栽培地采收成熟、 无机械伤口、 采收后无保鲜处理、 外观整齐、 大小均一、 无病斑 的荔枝， 将实施例 3 制备的生物保鲜剂充分摇匀后， 均匀喷洒到待处理荔枝表面， 喷施量以 表面完全湿润为宜， 处理后装入普通的保鲜袋中， 同时设置喷同样体积的灭菌水作为对照 组， 。
29、处理组与对照组于同样的条件下 (25-30 ) 储存， 定期观察供试材料的新鲜度， 按照下 列标准对其进行新鲜度分级， 计算不同时间点的保鲜率 ( 所有果品的新鲜度平均值 / 最高 新鲜度级数 )， 结果如表 4 ： 0061 荔枝新鲜度分级标准 ： 0 级 ： 严重腐烂 ； 1 级 ： 果实严重失水， 变黑 ( 失水率 80 或 / 和褐化面积 80 ) ； 2 级 ： 果实失水率 50-80或 / 和褐化面积 50-80 ； 3 级 ： 失水 率 30-50或 / 和褐化面积 30-50 ) ； 4 级 ： 果实失水率 10-20或 / 和褐化面积 10-20 果实失水 ； 5 级 ： 果。
30、实有轻度失水 ( 面积低于 10 )， 局部褐化 ( 面积 10 ) ； 6 级 ： 整果新 鲜如初， 饱满圆润、 无失水皱缩及褐化， 果肉洁白。 0062 表 4 0063 0064 经处理的荔枝在 25-30下储存， 第 12 天其新鲜度平均等级仍接近于最高新鲜度 级数， 12天内其保鲜率达到95以上， 而未处理的荔枝在同样的储存条件下， 第4天后其保 说 明 书 CN 104430834 A 8 7/7 页 9 鲜率即降到 71.8， 说明处理的荔枝其保鲜时间延长了 2 倍以上。 0065 上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 均应为等效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 104430834 A 9 。