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1、10申请公布号CN101991575A43申请公布日20110330CN101991575ACN101991575A21申请号201010536658622申请日20101105A61K31/519200601A61P35/00200601A61P37/02200601A61P29/00200601A61P19/02200601A61P19/04200601A61P11/06200601A61P13/1220060171申请人中国人民解放军第三军医大学第三附属医院地址400042重庆市渝中区大坪长江支路10号72发明人梁华平张醇范霞王希杨雪74专利代理机构北京华科联合专利事务所11130代理人。
2、王为54发明名称吴茱萸碱在制备抑制芳香烃受体的药物中的应用57摘要本发明涉及吴茱萸碱在制备抑制芳香烃受体的药物中的应用，本发明所述抑制芳香烃受体的药物是通过抑制芳香烃受体具有抗肿瘤以及免疫调节作用的药物，其中所述肿瘤是乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌等；其中所述免疫调节是各种炎症性相关疾病如脓毒症、脓毒性休克、风湿性关节炎、类风湿性关节炎、哮喘、急慢性肾小球性肾炎、系统性红斑狼疮，本发明所述的应用，其中所述吴茱萸碱是中药吴茱萸成分中生物碱成分，分子式如下C19H17N3O，分子量3034DA，不溶于水，可溶于二甲基亚砜、乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂，熔点为278279。51。
3、INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图1页CN101991577A1/1页21吴茱萸碱在制备抑制芳香烃受体的药物中的应用。2权利要求1所述的应用，其中所述抑制芳香烃受体的药物是通过抑制芳香烃受体具有抗肿瘤以及免疫调节作用的药物。3权利要求1所述的应用，其中所述肿瘤是乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌等；其中所述免疫调节是各种炎症性相关疾病。4权利要求1所述的应用，其中所述炎症性相关疾病是脓毒症、脓毒性休克、风湿性关节炎、类风湿性关节炎、哮喘、急慢性肾小球性肾炎、系统性红斑狼疮。5权利要求1所述的应用，其中所述吴茱萸碱是中药吴茱。
4、萸成分中生物碱成分。6权利要求1所述的应用，其中所述药物是含有吴茱萸碱的药物组合物。7权利要求1所述的应用，其中所述药物组合物含有药物可接受的载体。8权利要求1所述的应用，其中所述所述药物组合物以任何形式的药物制剂形式存在。9权利要求1所述的应用，其中所述药物组合物是注射剂。10权利要求1所述的应用，其中所述药物组合物是冷冻干燥注射剂。权利要求书CN101991575ACN101991577A1/4页3吴茱萸碱在制备抑制芳香烃受体的药物中的应用技术领域0001本发明涉及一种可抑制芳香烃受体核移位及其后续生物学效应的新型抑制剂，该抑制剂为中药单体吴茱萸碱。背景技术0002芳香烃类是一类含苯环的化。
5、学致癌物，常见有多环芳香烃类和卤代芳香烃类。芳香烃类物质通过与其受体，即芳香烃受体ARYLHYDROCARBONRECEPTOR，AHR相结合，使该受体激活，从而引起一系列下游基因的表达和代谢酶的活化。芳香烃受体AHR，是一个配体依赖性激活的转录因子，由805个氨基酸构成。该分子具有几个功能结构域位于AHR分子N末端的碱性螺旋环螺旋BASICHELIXLOOPHELIX，BHLH结构，对蛋白质分子二聚化及DNA结合是必需的，其中B区决定结合DNA序列的特异性，BHLH区则是蛋白质二聚化的界面。0003芳香烃受体依赖于配体而激活，在众多报道中，使用最多的配体是环境中的的有毒物质2，3，7，8TE。
6、TRACHLORODIBENZOPDIOXINTCDD，它是AHR的高亲和力配体。AHR无活性时存在于细胞质中，与两个分子的HSP90、分子亲免蛋白XAP2结合成四聚体。当TCDD与AHR结合后，AHR构象改变，脱离四聚体游离出来，然后与芳香烃受体核转位蛋白ARNT相结合，形成异二聚体转录因子，转位到细胞核中。此过程称为芳香烃受体的核转位。0004AHR在胞核中结合相关DNA，调节相关基因的转录，产生多种异物代谢酶，参与物质代谢。报道最多的是CYP1酶CYP1A1，CYP1A2，CYP1B1，分别编码细胞色素P4501A1，P4501A2，P4501B1。AHR还调节炎症引起的谷胱甘肽S转移酶。
7、YAGSTYA和NADPH醌氧化还原酶QOR。0005AHR与细胞周期调节有关，在肝癌细胞HEPG2中发现AHR的降低导致了G0/G1到S期的降低，并伴随着细胞周期蛋白CYCLIND1、CYCLINE、CYCLINDEPENDENTKINASE2CDK2和CDK4表达降低，表现出了AHR的生长促进作用。AHR在乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌等都有过表达现象。在正常肺组织的少数微粒体中存在P4501B1CYP1B1表达，而在大多数肺癌组织中则高表达，且腺癌多于鳞癌，而CYP1B1的激活依赖AHR转录因子。大多数烟草中的多环芳香烃的致癌作用是AHR所介导的，AHR能调节烟草。
8、诱导的致癌代谢酶的表达。AHR在肝癌细胞HEPG2中有促进生长的作用。AHRMRNA和蛋白质表达水平在胃癌组织中恶化前组织无瘤组织。这些研究反应出AHR能刺激非激素依赖性肿瘤的形成。0006此外AHR能通过NFKAPPAB家族中RELB抑制环氧合酶2COX2和前列腺素产物的表达，从而抑制炎症的发生。AHR也可直接抑制巨噬细胞NFKAPPAB活性阻止炎症因子的产生，并可诱导调节性T细胞的生成。0007根据AHR与肿瘤生长的相关性，已有不少针对AHR靶点的肿瘤治疗研究。如吲哚3甲醇I3C和二吲哚基甲烷DIM能竞争性的与AHR结合，从而部分抑制AHR。肿瘤坏死因子和脂多糖能引起AHR调节的基因NAD。
9、PH醌氧化还原酶下调，使活性氧增加，从说明书CN101991575ACN101991577A2/4页4而下调AHR基因。如将SD大鼠分为抗肿瘤作用的豆类蛋白SPI饲养阳性组和阴性组，并用AHR激动剂DMBA或麻油处理，则阳性组大鼠DMBA诱导的肝CYP1A1活性、基因和蛋白表达水平，以及AHR/ARNT复合物与CYP1A1基因启动子结合能力均较阴性组降低。0008中药吴茱萸具有驱寒镇痛、止呕、止泻和舒张血管的的功效。吴茱萸碱EVODIAMINE，EVO是吴茱萸最重要生物碱成分之一，具有多种生物学活性，吴茱萸碱能引起肿瘤细胞周期的阻滞并抑制细胞的增殖；能诱导细胞发生凋亡，坏死和自噬，从而引起细胞。
10、死亡；还能抑制血管生成，阻止肿瘤细胞的侵袭和转移；并推测吴茱萸碱可能通过作用NFB等多个靶点表现其活性。其免疫调节活性是近年来研究的新发现。研究表明，吴茱萸碱能够抑制活化炎性细胞中NADP氧化酶依赖活性氧族和INOS依赖性NO产物，并通过抑制炎性细胞分泌前列腺E2、白三烯等炎性因子的合成来发挥抗炎效应，另外，吴茱萸碱还可抑制IGE诱导的变应性疾病如过敏性皮炎、鼻炎。吴茱萸碱与辣椒素有相似的生物学活性，能够竞争性结合辣椒素受体，在高剂量时显示出抗伤害性疼痛的作用，该作用是通过抗炎症反应来介导。但吴茱萸碱是否会对AHR的功能产生影响，尚未见报道。0009我们通过同源模建和柔性对接方法，预测吴茱萸碱。
11、是否可与AHR结合。分子模拟结果显示，吴茱萸碱可与AHR结合，进一步通过细胞内受体结合试验证实，二者结合的KI值为28449NM。吴茱萸碱可抑制TCDD诱导的AHR的核移位及后续CYP1A1的表达，且呈剂量依赖关系。表明吴茱萸碱是AHR的新型配基，具有拮抗活性。发明内容0010本发明的目的是提供一种新型芳香烃受体抑制剂吴茱萸碱。0011本发明意外的发现吴茱萸碱具有芳香烃受体抑制剂的作用，因此本发明提供吴茱萸碱在制备抑制芳香烃受体的药物中的应用。0012本发明所述抑制芳香烃受体的药物是通过抑制芳香烃受体具有抗肿瘤以及免疫调节作用的药物。其中所述肿瘤是乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、肝癌。
12、、结肠癌等；其中所述免疫调节是各种炎症性相关疾病如脓毒症、脓毒性休克、风湿性关节炎、类风湿性关节炎、哮喘、急慢性肾小球性肾炎、系统性红斑狼疮。0013本发明所述的应用，其中所述吴茱萸碱是中药吴茱萸成分中生物碱成分，分子式如下C19H17N3O，分子量3034DA，不溶于水，可溶于二甲基亚砜、乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂，熔点为278279，该产品属于现有技术，可从市场上购买得到。0014本发明所述的应用，其中所述药物是含有吴茱萸碱的药物组合物。0015本发明所述的应用，其中所述药物组合物含有药物可接受的载体。0016本发明所述的应用，其中所述所述药物组合物以任何形式的药物制剂形式存在。0017本。
13、发明所述的应用，其中所述药物组合物是注射剂。0018本发明所述的应用，其中所述药物组合物是冷冻干燥注射剂。0019本发明所述的应用，包括和其他药物的合用以及制备成复方药物制剂。0020吴茱萸碱可抑制芳香烃受体核移位及其后续生物学效应，进而发挥抗肿瘤作用和免疫调节作用。有关本发明应用及效果的有关实验数据见实施例。本发明作为药物的应用在制备药物时均采用药物制剂学的常规技术。说明书CN101991575ACN101991577A3/4页5附图说明0021图1为吴茱萸碱的结构式。0022图2为吴茱萸碱对TCDD诱导的AHR在LOVO细胞中核移位的影响。0023图3为吴茱萸碱对TCDD诱导的CYP1A1。
14、蛋白表达的影响。具体实施方式0024以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。0025实施例1、吴茱萸碱的理化性质0026分子量3034DA，不溶于水，可溶于二甲基亚砜、乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂，熔点为278279。0027结构式见图1。0028实施例2、吴茱萸碱对细胞浆AHR与3HTCDD结合的影响0029以3HTCDD作为放射性配基，以WISTAR大鼠肝细胞浆作为AHR的受体作竞争性配基结合实验。0030结果显示，未标记的TCDD可抑制3HTCDD与AHR的结合，IC50值为17103NM，而吴茱萸碱也可抑制3HTCDD与AHR的结合，IC50值为44865NM，其与AHR。
15、结合的KI值为28449NM。0031实施例3、吴茱萸碱对TCDD诱导的AHR在LOVO细胞中核移位的影响0032LOVO细胞在体外细胞培养体系中分别经对照液、TCDD01M、TCDD01M吴茱萸碱60M作用4小时，然后以4多聚甲醛固定30分钟，5牛血清白蛋白封闭，兔多克隆抗AHR抗体、FITC二抗作用，DAPI染核，激光共聚焦显微镜下观察结果。0033结果显示，TCDD01M处理LOVO细胞4小时，可增加AHR的核移位。如以60M的吴茱萸碱同时处理LOVO细胞4小时，则可阻止TCDD诱导的AHR的核移位。见图2。0034实施例4、吴茱萸碱对TCDD诱导的CYP1A1MRNA及蛋白表达的影响0。
16、035LOVO细胞在体外细胞培养体系中分别经对照液DMSO、TCDD01M、吴茱萸碱1560M、TCDD01M吴茱萸碱1560M作用24小时，荧光定量PCR检测CYP1A1MRNA水平，WESTERNBLOT检测CYP1A1蛋白水平。0036结果显示，TCDD01M处理LOVO细胞24小时，可明显提高的CYP1A1MRNA水平。如以吴茱萸碱同时处理LOVO细胞24小时，则呈剂量依赖性抑制TCDD诱导的CYP1A1MRNA水平的升高。CYP1A1蛋白水平检测的结果也显示，TCDD可诱导LOVO细胞CYP1A1蛋白水平的升高，而吴茱萸碱则呈剂量依赖性抑制TCDD诱导的CYP1A1蛋白水平的升高。见表1、图20037表1吴茱萸碱对TCDD诱导LOVO细胞的CYP1A1基因表达的影响0038说明书CN101991575ACN101991577A4/4页60039与对照液DMSO组比较，BP005，CP001。0040与TCDD组比较DP005。说明书CN101991575ACN101991577A1/1页7图1图2图3说明书附图CN101991575A。