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1、(10)申请公布号 CN 104334719 A (43)申请公布日 2015.02.04 CN 104334719 A (21)申请号 201380030234.4 (22)申请日 2013.06.06 61/657160 2012.06.08 US C12N 5/071(2006.01) C12N 5/0735(2006.01) C12N 5/02(2006.01) (71)申请人 詹森生物科技公司 地址 美国宾夕法尼亚州 (72)发明人 A. 雷扎尼亚 (74)专利代理机构 中国专利代理(香港)有限公 司 72001 代理人 黄登高 彭昶 (54) 发明名称 人胚胎干细胞向胰腺内分泌细胞。
2、的分化 (57) 摘要 本发明提供促进胰腺内胚层细胞分化成胰腺 内分泌富集聚簇并增强激素表达细胞中的胰岛素 表达的方法。 (30)优先权数据 (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2014.12.08 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/US2013/044472 2013.06.06 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2013/184888 EN 2013.12.12 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 15 页 附图 8 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书15页 附图8页 (10)申请公布号 CN 1043347。
3、19 A CN 104334719 A 1/2 页 2 1. 一种在激素表达细胞中诱导胰岛素表达的方法， 所述方法包括将胰腺内胚层细胞与 肝配蛋白配体共培养。 2. 根据权利要求 2 所述的方法， 其中所述胰腺内胚层细胞与所述肝配蛋白配体共培养 也增强了 NKX6.1 的表达。 3.根据权利要求2所述的方法， 其中与未经处理的胰腺内胚层细胞中胰岛素和NKX6.1 的表达相比， 所述胰腺内胚层细胞与肝配蛋白配体共培养增强了所述胰腺内胚层细胞中胰 岛素和 NKX6.1 的表达。 4. 根据权利要求 3 所述的方法， 其中所述胰腺内胚层细胞基本上不表达 CDX2 或 SOX2。 5. 根据权利要求 。
4、4 所述的方法， 其中所述胰腺内胚层细胞表达约小于 10% 的 CDX2 或 SOX2。 6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法， 其中所述肝配蛋白配体是肝配蛋白A3或 肝配蛋白 A4。 7. 根据权利要求 6 所述的方法， 其中所述胰腺内胚层细胞通过多能干细胞的逐步分化 获得。 8. 根据权利要求 7 所述的方法， 其中所述多能干细胞是人胚胎多能干细胞。 9. 通过权利要求 1 所述的方法制备的胰岛素和 NKX6.1 表达细胞。 10. 一种通过胰腺内胚层细胞与肝配蛋白配体共培养所制备的细胞群， 其中与未经肝 配蛋白配体处理的胰腺内胚层细胞相比， 所述细胞群表达增强的胰岛素和 NKX6.1。
5、。 11.根据权利要求10所述的细胞群， 其中所述肝配蛋白配体是肝配蛋白A3或肝配蛋白 A4。 12. 一种增强激素表达细胞中生长抑素的表达的方法， 所述方法包括将胰腺内胚层细 胞培养于包含激活素 A 或激活素 C 的培养基中。 13. 根据权利要求 12 所述的方法， 其中胰岛素、 胰高血糖素和生长素释放肽的表达受 到抑制。 14. 根据权利要求 12 所述的方法， 其中经激活素 A 或激活素 C 处理的所述胰腺内胚层 细胞群表达的生长抑素比未经激活素 A 或激活素 C 处理的胰腺内胚层细胞群更多。 15. 根据权利要求 14 所述的方法， 其中与未经激活素 A 或激活素 C 处理的胰腺内胚。
6、层 细胞群中胰岛素的表达相比， 胰岛素的表达在经激活素 A 或激活素 C 处理的所述胰腺内胚 层细胞群中受到抑制。 16. 根据权利要求 12 所述的方法， 其中与未经激活素 A 或激活素 C 处理的胰腺内胚层 细胞群中胰高血糖素的表达相比， 经激活素 A 或激活素 C 处理的所述胰腺内胚层细胞群中 胰高血糖素的表达受到抑制。 17. 根据权利要求 12 所述的方法， 其中与未经激活素 A 或激活素 C 处理的胰腺内胚层 细胞群中生长素释放肽的表达相比， 所述生长素释放肽的表达在经激活素 A 或激活素 C 处 理的所述胰腺内胚层细胞群中受到抑制。 18.根据权利要求12至18中任一项所述的方法。
7、， 其中所述胰腺内胚层细胞基本上不表 达 CDX2 或 SOX2。 19. 根据权利要求 18 所述的方法， 其中所述经激活素 A 或激活素 C 处理的所述胰腺内 胚层细胞通过多能细胞的逐步分化获得。 权 利 要 求 书 CN 104334719 A 2 2/2 页 3 20. 根据权利要求 19 所述的方法， 其中所述衍生出所述胰腺内胚层细胞的所述多能细 胞是人胚胎多能细胞。 21. 一种通过在包含信号素 3a 或上皮细胞有丝分裂蛋白抗体的培养基中处理胰腺内 胚层细胞来增强 NKX6.1 的表达的方法。 22.根据权利要求21所述的方法， 其中与未经包含信号素3a或上皮细胞有丝分裂蛋白 抗体。
8、的培养基处理的胰腺内胚层细胞相比， 经包含信号素 3a 或上皮细胞有丝分裂蛋白抗 体的培养基处理的所述胰腺内胚层细胞群表达增大的量的 NKX6.1。 23.根据权利要求21所述的方法， 其中与未经包含信号素3a或上皮细胞有丝分裂蛋白 抗体的培养基处理的胰腺内胚层细胞相比， 胰岛素、 胰高血糖素和生长素释放肽的表达水 平在经包含信号素 3a 或上皮细胞有丝分裂蛋白抗体的培养基处理的胰腺内胚层细胞中未 受到影响。 24. 一种诱导内分泌聚簇的形成的方法， 所述方法包括将胰腺内分泌细胞与鞘氨醇 -1 受体激动剂共培养。 25.根据权利要求24所述的方法， 其中用于处理胰腺内分泌细胞的所述鞘氨醇-1受。
9、体 激动剂是鞘氨醇 -1- 磷酸 (S1P)。 26. 根据权利要求 24 所述的方法， 其中所述胰腺内分泌细胞通过多能干细胞的逐步分 化获得。 27. 根据权利要求 26 所述的方法， 其中所述多能干细胞是人胚胎多能干细胞。 权 利 要 求 书 CN 104334719 A 3 1/15 页 4 人胚胎干细胞向胰腺内分泌细胞的分化 0001 相关申请的交叉引用 0002 本申请要求于 2012 年 6 月 8 日提交的美国临时专利申请序列号 61/657,160 的权 益， 其全文以引用方式并入本文以用于任何目的。 技术领域 0003 本发明在细胞分化领域中。更具体地， 本发明公开了肝配蛋白。
10、配体和鞘氨 醇 -1- 磷酸作为多能干细胞向内分泌细胞分化的调节因子的用途。 背景技术 0004 用于 I 型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得注意力集 中在开发适于植入的胰岛素生成细胞或 细胞的来源上。一种方法是从多能干细胞诸如 例如胚胎干细胞产生功能性 细胞。 0005 在脊椎动物的胚胎发育中， 多能细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三个 胚层 ( 外胚层、 中胚层和内胚层 ) 的细胞群体。组织 ( 诸如甲状腺、 胸腺、 胰腺、 肠和肝脏 ) 将从内胚层经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段是定形内胚层的形成。定形内胚 层细胞表达多种标记物， 诸如 HNF3、 GA。
11、TA4、 MIXL1、 CXCR4 和 SOX17。 0006 到原肠胚形成为止， 内胚层划分成可通过一组因子的表达来识别的前 - 后域， 所 述因子唯一地标记内胚层的前、 中和后区。例如， Hhex 和 Sox2 鉴定内胚层的前区， 而 Cdx1、 2 和 4 鉴定内胚层的后半部分。 0007 内胚层组织的迁移使内胚层与不同的中胚层组织紧密接近， 这帮助肠管的区域 化。 这通过多种分泌因子诸如FGF、 Wnt、 TGF-B、 视黄酸(RA)和BMP配体及其拮抗剂来完成。 例如， FGF4 和 BMP 促进预定的后肠内胚层中的 Cdx2 表达并阻遏前基因 Hhex 和 SOX2 的表 达 (2。
12、000 Development,127:15631567)。WNT 信号传导也已显示与 FGF 信号传导平行工 作， 以促进后肠发育并抑制前肠命运 (2007 Development,134:22072217)。最后， 由间充 质分泌的视黄酸调节前肠 - 后肠边界 (2002 Curr Biol,12:12151220)。 0008 特异性转录因子的表达水平可用于指定组织的身份。 在定形内胚层转化成原肠管 的过程中， 肠管变得区域化成广泛域， 所述广泛域可通过限制性基因表达模式在分子水平 上进行观察。例如， 肠管中区域化的胰腺域显示 PDX-1 的极高表达以及 CDX2 和 SOX2 的极 低。
13、表达。相似地， 高水平的 Foxe1 的存在指示食道组织 ； 在肺组织中高度表达的是 NKX2.1 ； SOX2/Odd1(OSR1) 在胃组织中高度表达 ； PROX1/Hhex/AFP 的表达在肝组织中较高 ； SOX17 在胆道结构组织中高度表达 ； PDX1、 NKX6.1/PTf1a 和 NKX2.2 在胰腺组织中高度表达 ； 并且 CDX2 的表达在肠组织中高。上文概括摘自 Dev Dyn 2009,238:2942 和 Annu Rev Cell Dev Biol 2009,25:221-251。 0009 胰腺的形成起于定形内胚层分化成胰腺内胚层 (2009 Annu Rev 。
14、Cell Dev Biol,25:221-251 ； 2009 Dev Dyn,238:29-42)。背侧和腹侧胰腺域产生自前肠上皮。前肠 也产生食道、 气管、 肺、 甲状腺、 胃、 肝、 胰腺和胆管系统。 说 明 书 CN 104334719 A 4 2/15 页 5 0010 胰腺内胚层的细胞表达胰-十二指肠同源盒基因PDX1。 在不存在Pdx1时， 胰腺形 成腹胰芽和背胰芽后不再发育。因而， Pdx1 表达标志着胰腺器官发生中的一个关键步骤。 除了其他细胞类型， 成熟的胰腺还包括外分泌组织和内分泌组织。外分泌和内分泌组织产 生自胰腺内胚层的分化。 0011 D Amour 等人描述了在高。
15、浓度激活素和低血清的存在下， 产生人胚胎干细胞 (ES) 衍生出的定形内胚层的富集培养物 (Nature Biotechnol 2005,23:1534-1541 ； 美国专利 7,704,738)。 将这些细胞移植在小鼠的肾包膜下导致分化成具有内胚层组织特征的更成熟 的细胞(美国专利7,704,738)。 在添加FGF-10和视黄酸后， 人胚胎干细胞衍生出的定形内 胚层细胞还可进一步分化成PDX1阳性细胞(美国专利公开2005/0266554A1)。 这些胰腺前 体细胞在免疫缺陷小鼠的脂肪垫中的后续移植导致在 3-4 个月成熟期后形成功能胰腺内 分泌细胞 ( 美国专利 7,993,920 和。
16、美国专利 7,534,608)。 0012 Fisk等人报道用于由人胚胎干细胞产生胰岛细胞的系统(美国专利7,033,831)。 在这种情况下， 分化途径分成三个阶段。人胚胎干细胞首先使用丁酸钠和激活素 A 的组合 而分化成内胚层(美国专利7,326,572)。 然后将细胞和与EGF或细胞素(betacellulin) 结合的 BMP 拮抗剂诸如头蛋白 (Noggin) 一起培养， 以生成 PDX1 阳性细胞。通过烟酰胺诱 导终末分化。 0013 小分子抑制剂也已用于诱导胰腺内分泌前体细胞。例如， TGF-B 受体和 BMP 受 体的小分子抑制剂 (Development 2011,138:8。
17、61-871 ； Diabetes 2011,60:239-247) 已 用于显著提高胰腺内分泌细胞的数目。另外， 小分子活化剂也已用于生成定形内胚层 细 胞 或 胰 腺 前 体 细 胞 (Curr Opin Cell Biol 2009,21:727-732 ； Nature Chem Biol 2009,5:258-265)。 0014 虽然已在由人多能干细胞产生胰腺细胞的方案方面取得重大进步， 但仍然需要建 立产生功能性内分泌细胞且尤其是 细胞的方案。在此， 我们证实一类肝配蛋白配体和鞘 氨醇 -1- 磷酸或鞘氨醇受体的激动剂增强了内分泌细胞的产生并加速内分泌激素和内分 泌前体细胞的聚簇。
18、。 发明内容 0015 在一个实施例中， 本发明涉及通过在包含肝配蛋白 A4 或肝配蛋白 A3 的培养基中 培养胰腺内胚层细胞群来增强胰岛素和 NKX6.1 的表达的方法。在一些实施例中， 胰腺内胚 层细胞群基本上不表达CDX2或SOX2。 在一些实施例中， 胰腺内胚层细胞群通过多能细胞的 逐步分化获得。在一些实施例中， 多能细胞是人胚胎多能细胞。 0016 在一个实施例中， 本发明涉及通过在包含激活素 A 或激活素 C 的培养基中培养胰 腺内胚层细胞来增强生长抑素的表达同时抑制胰岛素、 胰高血糖素和生长素释放肽的表达 的方法。在一些实施例中， 经激活素 A 或激活素 C 处理的胰腺内胚层细胞。
19、群表达的生长抑 素比未经激活素 A 或激活素 C 处理的胰腺内胚层细胞群更多。在一些实施例中， 与未经激 活素 A 或激活素 C 处理的胰腺内胚层细胞群中胰岛素的表达相比， 胰岛素的表达在经激活 素A或激活素C处理的胰腺内胚层细胞群中受到抑制。 在一些实施例中， 与未经激活素A或 激活素 C 处理的胰腺内胚层细胞群中胰高血糖素的表达相比， 经激活素 A 或激活素 C 处理 的胰腺内胚层细胞群中胰高血糖素的表达受到抑制。在一些实施例中， 与未经激活素 A 或 说 明 书 CN 104334719 A 5 3/15 页 6 激活素 C 处理的胰腺内胚层细胞群中生长素释放肽的表达相比， 生长素释放肽。
20、的表达在经 激活素 A 或激活素 C 处理的胰腺内胚层细胞群中受到抑制。在一些实施例中， 胰腺内胚层 细胞基本上不表达 CDX2 或 SOX2。在一些实施例中， 经激活素 A 或激活素 C 处理的胰腺内胚 层细胞通过多能细胞的逐步分化获得。在一些实施例中， 衍生出胰腺内胚层细胞的多能细 胞是人胚胎多能细胞。 0017 在一个实施例中， 本发明涉及通过在包含信号素 3a 或上皮细胞有丝分裂蛋白抗 体 (Epigen) 的培养基中处理胰腺内胚层细胞来增强 NKX6.1 的表达的方法。在一些实施例 中， 与未经包含信号素 3a 或上皮细胞有丝分裂蛋白抗体的培养基处理的胰腺内胚层细胞 相比， 经包含信。
21、号素 3a 或上皮细胞有丝分裂蛋白抗体的培养基处理的胰腺内胚层细胞群 表达增大的量的NKX6.1。 在一些实施例中， 与未经包含信号素3a或上皮细胞有丝分裂蛋白 抗体的培养基处理的胰腺内胚层细胞相比， 激素诸如胰岛素、 胰高血糖素和生长素释放肽 的表达水平在经包含信号素 3a 或上皮细胞有丝分裂蛋白抗体的培养基处理的胰腺内胚层 细胞中未受到影响。在一些实施例中， 胰腺内胚层细胞基本上不表达 CDX2 或 SOX2。在一些 实施例中， 经包含信号素 3a 或上皮细胞有丝分裂蛋白抗体的培养基处理的胰腺内胚层细 胞通过多能细胞的逐步分化获得。在一些实施例中， 衍生出胰腺内胚层细胞的多能细胞是 人胚胎。
22、多能细胞。 0018 在一些实施例中， 本发明涉及分化多能细胞的逐步方法， 该方法包括将胰腺内胚 层细胞培养于包含肝配蛋白 A4、 肝配蛋白 A3、 激活素 A、 激活素 C、 信号素 3a 或上皮细胞有 丝分裂蛋白抗体的培养基中。在一些实施例中， 胰腺内胚层细胞培养于包含肝配蛋白 A4 或 肝配蛋白 A3 的培养基中。在一些实施例中， 胰腺内胚层细胞培养于包含激活素 A 或激活素 C 的培养基中。在一些实施例中， 胰腺内胚层细胞培养于包含信号素 3a 或上皮细胞有丝分 裂蛋白抗体的培养基中。在一些实施例中， 衍生出胰腺内胚层细胞的多能干细胞是人胚胎 多能干细胞。 0019 在一个实施例中， 。
23、本发明涉及通过用鞘氨醇 -1 受体激动剂处理胰腺内分泌细胞 来诱导内分泌聚簇的表达的方法。在一些实施例中， 用于处理胰腺内分泌细胞的鞘氨醇 -1 受体激动剂是鞘氨醇 -1- 磷酸 (S1P)。 0020 还设想为本发明的实施例的是通过本发明的方法制备的细胞以及使用本发明的 细胞的方法。 附图说明 0021 图 1A 至图 1G 示出了实例 1 中所述的分化的人胚胎干细胞系 H1 的细胞中下列基 因的表达的实时 PCR 分析的数据 ： 胰岛素 ( 图 1A)、 生长抑素 ( 图 1B)、 生长素释放肽 ( 图 1C)、 胰高血糖素 ( 图 1D)、 PDX-1( 图 1E)、 NKX6.1( 图。
24、 1F) 和 NGN3( 图 1G)。 0022 图2A至图2C示出了对胰岛素免疫染色的细胞的图像。 图2A， 对照 ； 图2B， 经50ng/ mL 的肝配蛋白 A3 处理的细胞 ； 并且图 2C， 经 100ng/mL 的肝配蛋白 A3 处理的细胞， 如实例 2 中所述。 0023 图3A至图3C示出了对胰岛素免疫染色的细胞的图像。 图3A， 对照 ； 图3B， 经50ng/ mL 的肝配蛋白 A4 处理的细胞 ； 并且图 3C， 经 100ng/mL 的肝配蛋白 A4 处理的细胞， 如实例 2 中所述。 说 明 书 CN 104334719 A 6 4/15 页 7 0024 图 4A 。
25、至图 4D 示出了经鞘氨醇 -1- 磷酸 (S1P) 处理并在第 1 天 ( 图 4A)、 第 7 天 ( 图 4B) 和在 10 天两种不同放大倍率 ( 图 4C 和图 4D) 成像的细胞的 S6 培养物的相差图 像。所述图像显示， 在第 7 天， 内分泌细胞有明显的聚簇迹象， 并且在第 10 天， 所述聚簇彼 此被胰腺内胚层上皮薄层分开。 0025 图 5A 至图 5D 示出了经 S1P 处理并对 Hb9( 图 5A) 和 NKX6.1( 图 5B) 免疫染色或 对胰岛素 ( 图 5C) 和 Hb9( 图 5D) 免疫染色的细胞的图像。 0026 图 6A 和图 6B 示出了经 10M 的。
26、 S1P 处理并在第 6 阶段开始后三天收获的细胞的 不同放大倍率的相差图像。图 6C 和图 6D 示出了对 NKX2.2 免疫染色的细胞的图像。图 6C， 对照细胞 ； 图 6D， 经 S1P 处理的细胞。 具体实施方式 0027 为了以不受限制的方式清楚说明本公开， 将本发明的具体实施方式分成下列描述 或示出本发明某些特征、 实施例或应用的小节。 0028 定义 0029 干细胞是通过其在单细胞水平上既自我更新又分化的能力来定义的未分化细胞。 干细胞可产生子代细胞， 包括自我更新祖细胞、 非更新祖细胞和终末分化细胞。 干细胞的特 征还在于其在体外分化成来自多个胚层 ( 内胚层、 中胚层和外。
27、胚层 ) 的多种细胞谱系的功 能细胞的能力。 干细胞还在移植后产生多种胚层的组织， 并且在注射到胚泡内之后， 促成基 本上至大部分 ( 如果不是所有的话 ) 组织。 0030 干细胞通过其发育潜能分类为 ： (1) 全能的， 意指能够产生所有胚胎和胚胎外细 胞类型 ； (2) 多能的， 意指能够产生所有胚胎细胞类型 ； (3) 多潜能的， 意指能够产生细胞谱 系子类， 但全部在特定组织、 器官或生理系统内 ( 例如造血干细胞 (HSC) 可产生的后代包 括 HSC( 自我更新 )、 局限于血细胞的寡能祖细胞、 以及其为正常血液组分的所有细胞类型 和成分(例如血小板) ； (4)寡能的， 意指能。
28、够产生比多潜能干细胞更受限制的细胞谱系子 类 ； 以及 (5) 单能的， 意指能够产生单细胞谱系 ( 例如生精干细胞 )。 0031 分化是未特化的 (“未定向的” ) 或特化不足的细胞获得特化细胞 ( 诸如例如神 经细胞或肌肉细胞 ) 的特征的过程。分化的细胞或分化诱导的细胞是已在细胞谱系中占据 更特化的 (“定向的” ) 位置的细胞。当应用于分化的过程时， 术语 “定向的” 指在分化途径 中已进行到这样的点的细胞 ： 其中在正常环境下， 它继续分化成特定的细胞类型或细胞类 型子类， 并且在正常环境下， 不能分化成不同细胞类型或回复到分化程度较低的细胞类型。 “去分化” 指细胞通过其回复到在。
29、细胞谱系内特化 ( 或定向 ) 程度较低的位置的过程。本文 所用的 “细胞的谱系” 限定细胞的遗传性， 即它来自哪些细胞以及它能产生什么细胞。细胞 谱系将细胞定位于发育和分化的遗传计划内。 谱系特异性标记物指与所关注谱系的细胞的 表型明确地相关联的特征， 可用来评估未定向细胞向所关注谱系的分化。 0032 如本文所用，“标记物” 是在所关注细胞中差异表达的核酸或多肽分子。在该语境 中， 差异表达意指与未分化细胞相比阳性标记物的水平升高并且阴性标记物的水平下降。 标记物核酸或多肽的可检测水平， 在所关注细胞中充分地高于或低于在其他细胞中， 使得 可使用多种本领域已知的方法中的任何一种将所关注细胞。
30、与其他细胞鉴别和区分开来。 0033 如本文所用， 当在细胞中检测到特定标记物时， 细胞对于 “特定标记物” 是 “阳性 说 明 书 CN 104334719 A 7 5/15 页 8 的” 或是 “阳性的” 。相似地， 当在细胞中未检测到特定标记物时， 细胞对于 “特定标记物” 是 “阴性的” 或是 “阴性的” 。 0034 如本文所用，“细胞密度” 和 “接种密度” 在本文可互换使用， 并且是指每单位面积 的固体或半固体平坦或弯曲培养基所接种的细胞的数量。 0035 如本文所用，“第 1 阶段” 和 “S1” 在本文中可互换使用， 以鉴定表达定形内胚层 (DE) 特征性标记物的细胞。 00。
31、36 如本文所用，“定形内胚层” 指这样的细胞， 其具有在原肠胚形成过程中起于上胚 层的细胞的特征， 并形成胃肠道及其衍生物。定形内胚层细胞表达下述标记物中的至少一 种 ： HNF3、 GATA4、 SOX17、 CXCR4、 Cerberus、 OTX2、 goosecoid、 C-Kit、 CD99 和 MIXL1。 0037 如本文所用，“肠管” 指来源于定形内胚层的细胞， 所述细胞表达下述标记物中的 至少一种 ： HNF3-、 HNF1- 或 HNF4-。肠管细胞可产生所有内胚层器官， 例如肺、 肝、 胰 腺、 胃和肠。 0038 在本文中可互换使用的是 “第 2 阶段” 和 “S2”。
32、 ， 其鉴定表达原肠管特征性标记物的 细胞。 0039 “前肠内胚层” 指产生食道、 肺、 胃、 肝、 胰腺、 胆囊和一部分十二指肠的内胚层细 胞。 0040 “后前肠” 指可产生后胃、 胰腺、 肝和一部分十二指肠的内胚层细胞。 0041 “中肠内胚层” 指可产生肠、 一部分十二指肠、 阑尾和升结肠的内胚层细胞。 0042 “后肠内胚层” 指可产生横结肠远端三分之一、 降结肠、 乙状结肠和直肠的内胚层 细胞。 0043 “第 3 阶段” 和 “S3” 可互换使用， 以鉴定表达前肠内胚层特征性标记物的细胞。如 本文所用，“表达前肠谱系特征性标记物的细胞” 指表达下述标记物中的至少一种的细胞 ： 。
33、PDX-1、 FOXA2、 CDX2、 SOX2 和 HNF4。 0044 本文可互换使用的是 “第 4 阶段” 和 “S4” ， 以鉴定表达胰腺前肠前体特征性标记物 的细胞。如本文所用，“表达胰腺前肠前体谱系特征性标记物的细胞” 指表达下述标记物中 的至少一种的细胞 ： PDX-1、 NKX6.1、 HNF6、 FOXA2、 PTF1a、 Prox1 和 HNF4。 0045 如本文所用，“第 5 阶段” 和 “S5” 可互换使用， 以鉴定表达胰腺内胚层和胰腺内 分泌前体细胞的特征性标记物的细胞。如本文所用的，“表达胰腺内胚层谱系特征性标记 物的细胞” 指表达下述标记物中的至少一种的细胞 ：。
34、 PDX1、 NKX6.1、 HNF1、 PTF1、 HNF6、 HNF4、 SOX9、 HB9 或 PROX1。表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞基本上不表达 CDX2 或 SOX2。 0046 “胰腺内分泌细胞” 或 “胰腺激素表达细胞” 或 “表达胰腺内分泌谱系特征性标记物 的细胞” 或 “第 6 阶段细胞” 或 “S6 细胞” 在本文中可互换使用， 并且是指能够表达下列激 素中的至少一种的细胞 ： 胰岛素、 胰高血糖素、 生长抑素、 生长素释放肽和胰多肽。 0047 “胰腺胰岛素阳性细胞” 是指表达胰岛素、 HB9、 NKX2.2 和 NKX6.1 的内分泌细胞群。 0048 “胰腺。
35、内分泌前体细胞” 或 “胰腺内分泌祖细胞” 指能够变成胰腺激素表达细胞的 胰腺内胚层细胞。 此类细胞可表达下列标记物中的至少一种 ： NGN3、 NKX2.2、 NeuroD、 ISL-1、 Pax4、 Pax6 或 ARX。 0049 在本文中可互换使用的是 “d1” 、“d 1”和 “第 1 天” ；“d2” 、“d 2”和 “第 2 天” ； 说 明 书 CN 104334719 A 8 6/15 页 9 “d3” 、“d 3” 和 “第 3 天” 等等。这些数字字母组合是指在本专利申请的逐步分化方案过程 中的不同阶段中温育的具体天数。 0050 “葡萄糖” 和 “D- 葡萄糖” 在本文。
36、中可互换使用， 并且指右旋糖， 在自然界中通常发 现的糖。 0051 在本文中可互换使用的是 “NeuroD” 和 “NeuroD1” ， 其鉴定在胰腺内分泌祖细胞中 表达的蛋白质及其编码基因。 0052 在本文中可互换使用的是 “LDN” 和 “LDN-193189” ， 以指示可得自美国加利福尼亚 州 Stemgent 公司 (Stemgent,CA,USA) 的 BMP 受体抑制剂。 0053 多能干细胞的分离、 扩增和培养 0054 多能干细胞可表达阶段特异性胚胎抗原 (SSEA)3 和 4 以及可用称为 Tra-1-60 和 Tra-1-81 的 抗 体 检 测 的 标 记 物 中 。
37、的 一 种 或 多 种 (Thomson 等 人， 1998,Science 282:1145-1147)。多能干细胞在体外的分化导致 SSEA-4、 Tra-1-60 和 Tra-1-81 表达的丧 失。 未分化的多能干细胞通常具有碱性磷酸酶活性， 所述碱性磷酸酶活性可通过用4多聚 甲醛固定细胞， 然后用矢量红 (Vector Red) 作为底物显色来检测， 如由制造商 ( 美国加利 福尼亚州的维克多实验室公司 (Vector Laboratories,CA,USA) 描述的。如通过 RT-PCR 检测的， 未分化的多能干细胞通常也表达 OCT4 和 TERT。 0055 增殖多能干细胞的另。
38、一种期望表型是分化成所有三种胚层的细胞的潜能 ： 内胚 层、 中胚层和外胚层组织。干细胞的多能性可例如通过下述加以证实 ： 将细胞注射到 SCID 小鼠内， 使用 4多聚甲醛固定所形成的畸胎瘤， 然后就来自三个胚层的细胞类型的证据对 它们进行组织学检查。另选地， 可以通过产生胚状体并评估胚状体中三个胚层相关的标记 物的存在来确定多能性。 0056 可以使用标准 G 带技术并与已公布的相应灵长类物种的核型相比较来分析增殖 的多能干细胞系的核型。希望获得具有 “正常核型” 的细胞， 其意指细胞为整倍体， 其中所 有人染色体都存在并且没有明显的改变。 多能细胞在培养物中可使用多种饲养层或通过使 用基。
39、质蛋白质涂布的容器容易地扩增。另选地， 与成分确定的培养基诸如 mTeSR1 培养基 ( 加拿大温哥华的干细胞科技公司 (StemCell Technologies,Vancouver,Canada) 组合的 化学确定的表面可用于常规细胞扩增。多能细胞可使用酶促、 机械或使用多种钙螯合剂诸 如 EDTA( 乙二胺四乙酸 ) 容易地从培养皿中取出。另选地， 多能细胞可在不存在任何基质 蛋白质或饲养层的情况下悬浮扩增。 0057 多能干细胞的来源 0058 可使用的多能干细胞的类型包括来源于妊娠后形成的组织的建立的多能细胞 系， 包括在妊娠期间的任何时间取得的胚胎前组织 ( 诸如例如胚泡 )、 胚。
40、胎组织或胎儿组 织， 所述时间通常但不一定是在约 10 至 12 周妊娠前。非限制性例子是建立的人胚胎干 细胞 (hESC) 系或人胚胎干细胞， 诸如例如人胚胎干细胞系 H1、 H7 和 H9( 美国威斯康星州 麦迪逊的 WiCell 研究所 (WiCell Research Institute,Madison,WI,USA)。另外合适 的是取自已在不存在饲养细胞的情况下培养的多能干细胞群体的细胞。另外合适的是诱 导多能细胞 (IPS) 或重新编程的多能细胞， 其可使用多种多能相关的转录因子的被迫表 达而来源于成人体细胞， 所述转录因子诸如 OCT4、 NANOG、 Sox2、 KLF4 和 。
41、ZFP42(Annu Rev Genomics Hum Genet 2011,12:165-185)。本发明的方法中使用的人胚胎干细胞也可按照 说 明 书 CN 104334719 A 9 7/15 页 10 Thomson 等人 ( 美国专利 5,843,780 ； Science,1998,282:1145-1147 ； Curr Top Dev Biol 1998,38:133-165 ； Proc Natl Acad Sci U.S.A.1995,92:7844-7848) 所述的方式制备。 0059 由多能干细胞形成表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞 0060 多能干细胞的特征是本。
42、领域技术人员众所周知的， 并且多能干细胞的另外的特 征不断被鉴定。多能干细胞标记物包括例如下述中的一种或多种的表达 ： ABCG2、 cripto、 FOXD3、 CONNEXIN43、 CONNEXIN45、 OCT4、 SOX2、 NANOG、 hTERT、 UTF1、 ZFP42、 SSEA-3、 SSEA-4、 Tra 1-60、 Tra 1-81。 0061 适用于本发明的多能干细胞包括例如人胚胎干细胞系 H9(NIH 代码 ： WA09)、 人胚 胎干细胞系 H1(NIH 代码 ： WA01)、 人胚胎干细胞系 H7(NIH 代码 ： WA07) 和人胚胎干细胞系 SA002(Ce。
43、llartis,Sweden)。还适用于本发明的是表达下述多能细胞特征性标记物中的至 少一种的细胞 ： ABCG2、 cripto、 CD9、 FOXD3、 CONNEXIN43、 CONNEXIN45、 OCT4、 SOX2、 NANOG、 hTERT、 UTF1、 ZFP42、 SSEA-3、 SSEA-4、 Tra 1-60 和 Tra 1-81。 0062 定形内胚层谱系特征性标记物选自 SOX17、 GATA4、 HNF3、 GSC、 CER1、 Nodal、 FGF8、 Brachyury、 Mix 样同源盒蛋白、 FGF4、 CD48、 脱中胚蛋白 (EOMES)、 DKK4、 。
44、FGF17、 GATA6、 CXCR4、 C-Kit、 CD99 和 OTX2。适用于本发明的是表达定形内胚层谱系特征性标记物中的至 少一种的细胞。在本发明的一个方面， 表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞为原条前 体细胞。在另一方面， 表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞是中内胚层细胞。在另一 方面， 表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞是定形内胚层细胞。 0063 胰腺内胚层谱系特征性标记物选自 PDX1、 NKX6.1、 HNF1、 PTF1、 HNF6、 HNF4、 SOX9、 HB9 和 PROX1。适用于本发明的是表达胰腺内胚层谱系特征性标记物中的至少一种的 细胞。 在本发明的一个。
45、方面， 表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞是胰腺内胚层细胞， 其中 PDX-1 和 NKX6.1 的表达基本上高于 CDX2 和 SOX2 的表达。 0064 胰腺内分泌谱系特征性标记物选自 NGN3、 NEUROD、 ISL1、 PDX1、 NKX6.1、 PAX4、 ARX、 NKX2.2 和 PAX6。在一个实施例中， 胰腺内分泌细胞能够表达下述激素中的至少一种 ： 胰岛 素、 胰高血糖素、 生长抑素和胰多肽。 适用于本发明的是表达胰腺内分泌谱系特征性标记物 中的至少一种的细胞。在本发明的一个方面， 表达胰内分泌谱系特征性标记物的细胞为胰 内分泌细胞。胰腺内分泌细胞可以是表达胰腺激素的。
46、细胞。另选地， 胰腺内分泌细胞可以 是分泌胰腺激素的细胞。 0065 本发明的胰腺内分泌细胞是表达细胞谱系特征性标记物的细胞。表达细胞谱系 特征性标记物的细胞表达 PDX1 以及下列转录因子中的至少一种 ： NKX2.2、 NKX6.1、 NEUROD、 ISL1、 HNF3、 MAFA、 PAX4 和 PAX6。在本发明的一个方面， 表达细胞谱系特征性标记物的细 胞是细胞。 0066 在一个实施例中， 本发明涉及通过在包含肝配蛋白 A4 或肝配蛋白 A3 的培养基中 培养第 5 阶段细胞群来增强胰岛素和 NKX6.1 的表达的方法。在一些实施例中， 胰岛素和 NKX6.1 在细胞群中的表达增。
47、强到胰岛素和 NKX6.1 在未经处理的细胞群中的表达的至少 2 倍。在一些实施例中， 第 5 阶段细胞群基本上不表达 CDX2 或 SOX2。在一些实施例中， 第 5 阶段细胞群通过多能细胞的逐步分化获得。 在一些实施例中， 多能细胞是人胚胎多能细胞。 0067 在一个实施例中， 本发明涉及通过在包含激活素 A 或激活素 C 的培养基中培养第 5 阶段细胞来增强生长抑素的表达同时抑制胰岛素、 胰高血糖素和生长素释放肽的表达的 说 明 书 CN 104334719 A 10 8/15 页 11 方法。 在一些实施例中， 经处理的细胞群表达的生长抑素是未经处理的培养物的至少两倍。 在一些实施例中。
48、， 胰岛素的表达被抑制到未经处理培养物中胰岛素的表达的约一半。在一 些实施例中， 胰高血糖素的表达被抑制到未经处理培养物中胰高血糖素的表达的约 1/10。 在一些实施例中， 生长素释放肽的表达被抑制到未经处理培养物中生长素释放肽的表达的 约 1/3。在一些实施例中， 第 5 阶段细胞基本上不表达 CDX2 或 SOX2。在一些实施例中， 第 5 阶段细胞通过多能细胞的逐步分化获得。在一些实施例中， 多能细胞是人胚胎多能细胞。 0068 在一个实施例中， 本发明涉及通过在包含信号素 3a 或上皮细胞有丝分裂蛋白抗 体的培养基中处理第 5 阶段细胞来增强 NKX6.1 的表达的方法。在一些实施例中。
49、， 经处理的 细胞群表达的 NKX6.1 是未经处理培养物的至少两倍。在一些实施例中， 与未经处理培养物 相比， 激素的表达水平在经处理的培养物中未受到影响。在一些实施例中， 第 5 阶段细胞基 本上不表达 CDX2 或 SOX2。在一些实施例中， 第 5 阶段细胞通过多能细胞的逐步分化获得。 在一些实施例中， 多能细胞是人胚胎多能细胞。 0069 在一些实施例中， 本发明涉及分化多能细胞的逐步方法， 该方法包括将第 5 阶段 细胞培养于包含肝配蛋白 A4、 肝配蛋白 A3、 激活素 A、 激活素 C、 信号素 3a 或上皮细胞有丝 分裂蛋白抗体的培养基中。在一些实施例中， 第 5 阶段细胞培养于包含肝配蛋白 A4 或肝配 蛋白 A3 的培养基中。在一些实施例中， 第 5 阶段细胞培养于包含激活素 A 或激活素 C 的培 养基中。在一些实施例中， 第 5 阶段细胞培养于包含信号素 3a 或上皮细胞有丝分裂蛋白抗 体的培养基中。在一些实施例中， 。