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1、(10)申请公布号 CN 104328078 A (43)申请公布日 2015.02.04 CN 104328078 A (21)申请号 201410668536.0 (22)申请日 2014.11.20 CGMCC No. 8717 2014.01.10 C12N 1/20(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 黑龙江省科学院微生物研究所 地址 150010 黑龙江省哈尔滨市道里区兆麟 街 68 号 (72)发明人 殷博 曹亚彬 孙宇峰 郭丽姝 安琦 樊川 王慧民 张欣 迟君道 吴皓琼 牛彦波 杨旭升 刘雷明 王玉文 (74)专利代理机构 哈尔滨市文洋专利代。
2、理事务 所 ( 普通合伙 ) 23210 代理人 何强 (54) 发明名称 一株产中性蛋白酶的波茨坦短芽孢杆菌 (57) 摘要 一株产中性蛋白酶的波茨坦短芽孢杆菌， 它 涉及一株产蛋白酶的波茨坦短芽孢杆菌。本发明 提供了一株产中性蛋白酶的波茨坦短芽孢杆菌。 本发明产中性蛋白酶的波茨坦短芽孢杆菌为波茨 坦短芽孢杆菌 (Brevibacillus borstelensis) HWyb1312， 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心， 保藏号为 CGMCC No.8717。 本 发 明 波 茨 坦 短 芽 孢 杆 菌 (Brevibacillus borstelensis)HWyb13。
3、12 具 有 耐 高 温 特 性， 在 70条件下仍能存活， 并能代谢出中性蛋白酶。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104328078 A CN 104328078 A 1/1 页 2 1. 一株产中性蛋白酶的波茨坦短芽孢杆菌， 其为波茨坦短芽孢杆菌 (Brevibacillus borstelensis)HWyb1312， 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号 为 CGMCC No.。
4、8717。 权 利 要 求 书 CN 104328078 A 2 1/4 页 3 一株产中性蛋白酶的波茨坦短芽孢杆菌 技术领域 0001 本发明涉及一株产蛋白酶的波茨坦短芽孢杆菌。 背景技术 0002 中性蛋白酶一般是由枯草芽孢杆菌经发酵提取而得的， 属于一种内切酶， 可用于 各种蛋白质水解处理。在一定温度 ( 最适温度 ： 45 50 )、 pH 值 ( 稳定 pH ： 5.5 8.5) 下， 中性蛋白酶能将大分子蛋白质水解为氨基酸等产物， 可用于动植物蛋白的水解。 由于中 性蛋白酶能够将动、 植物的大分子蛋白质水解成小分子肽或氨基酸， 以利于蛋白质的有效 吸收和利用， 其水解液 AN高， 。
5、水解度高， 风味佳， 主要用于生产高级调味品和食品营养强 化剂， 以及各种动物来源性抽提物生产功能性骨、 肉提取物 ( 骨素 )、 水产提取物、 蛋白胨、 肽等。除此之外中性蛋白酶在焙烤行业、 啤酒工业、 医药工业、 纺织工业、 皮革工业、 大豆分 离蛋白领域、 酵母抽提物、 酵母浸膏的生产领域也都被广泛应用 ； 而且， 还作为饲料成分被 使用。 发明内容 0003 本发明提供一株产中性蛋白酶的波茨坦短芽孢杆菌， 增加了中性蛋白酶的获得来 源。 0004 本发明产中性蛋白酶的波茨坦短芽孢杆菌为波茨坦短芽孢杆菌 (Brevibacillus borstelensis)HWyb1312， 保藏于中。
6、国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号 为 CGMCC No.8717。 0005 本发明波茨坦短芽孢杆菌 (Brevibacillus borstelensis)HWyb1312 为革兰氏阳 性菌， 菌体的形态特征为短杆状， 细胞大小为 (0.3m 0.4m)(2m 7m)， 有明显 的凹陷， 周生鞭毛， 中生芽孢， 运动， 如图 1 所示 ； 菌落呈圆形， 颜色为乳白色， 表面光滑， 不 透明， 不凸起， 如图 2 所示。 0006 本发明波茨坦短芽孢杆菌 (Brevibacillus borstelensis)HWyb1312 的最适生长 温度为 50 60， 最适合生长环境。
7、的 pH 值为 6.5 7.0。 0007 本发明波茨坦短芽孢杆菌 (Brevibacillus borstelensis)HWyb1312 氧化酶反应 呈阴性， 明胶实验结果呈阳性， 淀粉水解实验结果呈阴性， 硝酸盐还原反应呈阳性， V-P 反应 呈阴性， 葡萄糖反应呈阳性， 柠檬酸盐反应呈阳性， 阿拉伯糖反应呈阴性， 木糖反应呈阴性。 0008 采用梅里埃VITEK 2Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统的GN板对波茨坦短 芽孢杆菌 (Brevibacillus borstelensis)HWyb1312 的生化反应进行了鉴定。波茨坦短芽 孢杆菌 (Brevibacillus bor。
8、stelensis)HWyb1312 的生化反应结果如表 1 所示。 0009 表 1 0010 BXYL-LysA-AspA+LeuA+ 说 明 书 CN 104328078 A 3 2/4 页 4 PheA+BGAL-PyrA-AGAL- AlaA+TyrA+APPA-CDEX- dGAL-GLYG-INO-ELLM- MdX-AMAN-MTE-GIyA+ dMNE-dMLZ-NAG-PLE- IRHA-BMAN-PHC+PVATE- AGLU-dTAG-dTRE-INU- dGLU-dRIB-PSCNa-NaCl 6.5- KAN+OLD-ESC+TTZ- POLYB_R-ProA-BN。
9、AG-MdG- dMAN-BGLU- 0011 本发明波茨坦短芽孢杆菌 (Brevibacillus borstelensis)HWyb1312 通过 16S rDNA 基因序列比对分析， 与波茨坦短芽孢杆菌 (Brevibacillus borstelensis) 的 16S rDNA 基因序列的同源性最高， 相似性为 100， 通过结合菌体形态特征、 生长条件、 生理生 化鉴定， 确定为波茨坦短芽孢杆菌 (Brevibacillus borstelensis)。 0012 本 发 明 产 中 性 蛋 白 酶 的 波 茨 坦 短 芽 孢 杆 菌 波 茨 坦 短 芽 孢 杆 菌 (Brevib。
10、acillus borstelensis)HWyb1312 具有耐高温特性， 在 70条件下仍能存活， 并能 代谢出中性蛋白酶， 55条件下， 其发酵液中中性蛋白酶的酶活力可达57U/mL。 波茨坦短芽 孢杆菌 (Brevibacillus borstelensis)HWyb1312 可用于 70的高温发酵产生中性蛋白 酶。 0013 由于本发明波茨坦短芽孢杆菌 (Brevibacillus borstelensis)HWyb1312 具有耐 高温和产中性蛋白酶的双重特性， 可用于禽畜粪便的高温堆肥、 高温污水处理等领域， 从而 高效降解其中的蛋白质。 0014 本发明波茨坦短芽孢杆菌 (Br。
11、evibacillus borstelensis)HWyb1312 为波茨坦短 芽孢杆菌 (Brevibacillus borstelensis)， 属于芽孢杆菌属 (Bacillus) ； 保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)， 保藏地址是北京市朝阳区北辰西路 1 号 院 3 号， 保藏日期为 2014 年 1 月 10 日， 保藏号为 CGMCC No.8717。 附图说明 0015 图 1 是波茨坦短芽孢杆菌 (Brevibacillus borstelensis)HWyb1312 菌体显微镜 观察图。 0016 图2是波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacil。
12、lus borstelensis)HWyb1312菌落观察图。 说 明 书 CN 104328078 A 4 3/4 页 5 具体实施方式 0017 本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式， 还包括各具体实施方式间的 任意组合。 0018 具体实施方式一 ： 本实施方式产中性蛋白酶的波茨坦短芽孢杆菌为波茨坦短芽孢 杆菌 (Brevibacillus borstelensis)HWyb1312， 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心， 保藏号为 CGMCC No.8717。 0019 本实施方式波茨坦短芽孢杆菌 (Brevibacillus borstelensis)HWyb。
13、1312 分离自 齐齐哈尔市甘南县堆肥肥料。 0020 筛选按以下步骤进行 ： 0021 称取 10.0g 堆肥肥料放入含有玻璃珠的 100ml 无菌水的三角瓶中， 于 200r/min 震荡 30min， 制成菌悬液 ； 取 1ml 悬液加入到 100mL 富集培养基中， 在 55、 180r/min 的条 件下震荡培养 18h 20h， 之后进行梯度稀释， 涂布于酪素筛选培养基上， 放于 55环境中 培养 48h， 挑选出产生透明圈的菌株， 得到本实施方式波茨坦短芽孢杆菌 (Brevibacillus borstelensis)HWyb1312。富集培养基 1000ml 中含有酪蛋白 2.。
14、0g、 酵母膏 1.0g、 葡萄糖 10g 和余量的水， pH 值为 7.0。酪素筛选培养基由蛋白胨 10.0g、 葡萄糖 1.0g、 NaCl 5.0g、 CaCl20.1g、 L-Tyr 0.1g、 酪素 5.0g、 琼脂 18.0g 和 H2O 1000ml 制成， pH 值为 7.0。 0022 可利用本实施方式波茨坦短芽孢杆菌 (Brevibacillus borstelensis)HWyb1312 生产中性蛋白酶， 其发酵培养基由牛肉膏 3.0g、 蛋白胨 10.0g、 NaCl 5.0g 和 H2O 1000ml 制 成， pH 值为 7.0。 0023 本实施方式波茨坦短芽孢杆。
15、菌 (Brevibacillus borstelensis)HWyb1312 能用于 禽畜粪便的高温堆肥， 可分解其中的大分子蛋白质。 0024 具体实施方式二 ： 本实施方式波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacillus borstelensis) HWyb1312以1的接种量接种于牛肉膏蛋白胨发酵培养基中， 在220r/min的不同温度条件 下培养72h， 之后在10000r/min、 4条件下冷冻离心30min， 收集上清液采用Folin-酚显色 法测定粗酶液的中性蛋白酶活性。 pH值为7.2条件下， 每分钟水解酪素产生1g酪氨酸为 1 个酶活单位 (U/mL)。 0025 不同温度条件下发酵培养液中中性蛋白酶的酶活如表 1 所示。 0026 表 1 0027 发酵温度 ( ) 中性蛋白酶活力 (U/mL) 5051.6 5557 6052.9 6546.3 说 明 书 CN 104328078 A 5 4/4 页 6 7038.2 0028 实验证明波茨坦短芽孢杆菌 (Brevibacillus borstelensis)HWyb1312 在 70发 酵条件下仍具有活性， 并能够产中性蛋白酶。 说 明 书 CN 104328078 A 6 1/1 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104328078 A 7 。