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1、(10)申请公布号 CN 104328061 A (43)申请公布日 2015.02.04 CN 104328061 A (21)申请号 201410588693.0 (22)申请日 2014.10.28 CCTCC NO ： M 2014385 2014.08.20 C12N 1/19(2006.01) C12N 15/53(2006.01) C12N 15/81(2006.01) C12P 7/06(2006.01) C12R 1/865(2006.01) (71)申请人 华南理工大学 地址 510006 广东省广州市番禺区广州大学 城华南理工大学 (72)发明人 朱明军 区健发 谢文化 。
2、(74)专利代理机构 广州市华学知识产权代理有 限公司 44245 代理人 苏运贞 裘晖 (54) 发明名称 利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌及 制备方法与应用 (57) 摘要 本发明公开一种利用木糖进行乙醇发酵的酿 酒酵母工程菌及制备方法与应用。该菌株含有如 下核苷酸序列 ： 木糖还原酶基因、 木糖醇脱氢酶 基因和木酮糖激酶基因 ； 其中， 木酮糖激酶基因 过表达。 本发明通过同源重组， 将组成型强启动子 整合到酿酒酵母出发菌株基因组上木酮糖激酶基 因上游， 得到木酮糖激酶过表达的菌株 ； 再转化 入从萄牙假丝酵母获得木糖还原酶基因和木糖醇 脱氢酶基因， 得到利用木糖进行乙醇发酵的酿酒 。
3、酵母工程菌。该酿酒酵母工程菌能够以木糖为唯 一碳源生长， 为后续构建木糖和葡萄糖共发酵产 乙醇的菌株奠定了基础 ； 并可以该工程菌株为基 础进一步筛选和改造， 使其以木质纤维素为原料 生产乙醇， 从而大大降低乙醇的生产成本。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 4 页 说明书 11 页 序列表 13 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书4页 说明书11页 序列表13页 附图4页 (10)申请公布号 CN 104328061 A CN 104328061 A 1/4 页 2 1. 一种利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌，。
4、 其特征在于含有如下核苷酸序列 ： 如SEQ ID NO.1所示的木糖还原酶基因、 如SEQ ID NO.2所示的木糖醇脱氢酶基因和如SEQ ID NO.3 所示的木酮糖激酶基因。 2. 根据权利要求 1 所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌， 其特征在于 ： 所述 的木酮糖激酶基因在所述的利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌中过表达。 3. 根据权利要求 1 所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌， 其特征在于含有如 下核苷酸序列 ： 启动子 1+ 如 SEQ ID NO.1 所示的木糖还原酶基因 + 终止子 1、 启动子 2+ 如 SEQ ID NO.2 所示的木糖醇脱氢酶基因 + 。
5、终止子 2 和启动子 3+SEQ ID NO.3 所示的木酮糖 激酶基因 + 终止子 3。 4. 根据权利要求 1 所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌， 其特征在于 ： 所述 的启动子 1 为磷酸丙糖异构酶启动子 ； 所述的终止子 1 为磷酸丙糖异构酶终止子 ； 所述的启动子 2 为己糖转运蛋白 HXT7 的启动子 ； 所述的终止子 2 为 CYC1 终止子 ； 所述的启动子 3 为磷酸甘油激酶启动子 ； 所述的终止子 3 为木酮糖激酶终止子。 5. 根据权利要求 1 所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌， 其特征在于 ： 所述 的核苷酸序列为整合到所述酿酒酵母工程菌的染色体上。 6。
6、. 根据权利要求 1 所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌， 其特征在于 ： 所 述的利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌的出发菌株为酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae CICC 1917。 7. 根据权利要求 1 所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌， 其特征在于 ： 所述的利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌为名称为酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)004-PGK 的菌株， 其于 2014 年 8 月 20 日保藏在位于中国武汉武汉大学内的中 国典型培养物保藏中心、 保藏号为 CCTCC NO ： M 2014385。 8. 权利。
7、要求 1 7 任一项所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌的制备方法， 其特征在于包含如下步骤 ： (1) 设计如下引物， 引物方向均为 5-3 ： 3sites oligo dT ： GAGCGGATAACAATTTCACACAGGTTTTTTTTTTTTTTTT ； XYL1-DEG-F ： ATGCTATTAAAGTAGGTTATAGATTATTYGAYGGNGC ； XYL1-DEG-R ： ATTAAATGTGGTTGTTGTAAATATGGRTGRTGYTC ； XYL2-DEG-F ： GTTATAGTTGAAGTTAAGAAAACTGGNATHTGYGG ； XYL2-DEG。
8、-R ： CAGCTAATAAACCAACTGGACCNGCNCCRAA ； xyl1 3sites F ： CTTGAACCTCGAGTACCTTG ； xyl2 3sites F ： CCACATCCAAAGAAGGCGAAC ； 3sites Adaptor ： GAGCGGATAACAATTTCACACAGG ； 5sites Tri-G ： AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG ； xyl1 5sites R ： AAGTCGCTCAATGTCTTGTCC ； xyl2 5sites R ： TGGTCTGGCAACTTAACCAA ； 权 利 要 求 书 C。
9、N 104328061 A 2 2/4 页 3 5sites Adaptor ： AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC ； xyl1-cDNA-F ： GCTTTCCCGATGACACGTTTGCGAAAAT ； xyl1-cDNA-R ： AATATGACTAATAGAAGGTAATTTT ； xyl2-cDNA-F ： CCACCTCAAGGTATGAGCCTAT ； xyl2-cDNA-R ： AACGGAGAAGAAAACCATTAGCTTT ； pXKS1-F ： GGGCCCGAATTCAGCCCGACGGATATACCACTTATGT ； pXKS1-R ： GGG。
10、CCCGGTACCTAAAGTACTAATCTCATCCTCCTTT ； pPGK1-F ： GGGCCCGGTACCAAGAAATTACCGTCGCTCGTG ； pPGK1-R ： GGGCCCGGATCCTGTTTTATATTTGTTGTAAA ； XKS1 ORF-F ： GGGCCCGGATCCATGTTGTGTTCAGTAATTCA ； XKS1 ORF-R ： GGGCCCGTCGACTTAGATGAGAGTCTTTTCCA ； XKS1-ext-R ： GCGCTAATTTGATTTGTCT ； pTPI1-F ： GGGCCCACTAGTCTACGTATGGTCATTTCTT。
11、C ； pTPI1-R ： GGGCCCGAATTCCTGTATGTGTTTTTTGTAGT ； xyl1-F ： GGGCCCGAATTCATGGCCACTATTAAGTTGAA ； xyl1-R ： TTTATATAATTATATTAATCGGTACCCTAGTGGAAGATTGGGATTT ； tTPI1-F ： AAATCCCAATCTTCCACTAGGGTACCGATTAATATAATTATATAAA ； tTPI1-R ： CATACCCCTCATTTCCACGGGAGCTCGCTCTTCTATATAACAGTTG ； pHXT7-F ： CAACTGTTATATAGAAGAGCG。
12、AGCTCCCGTGGAAATGAGGGGTATG ； pHXT7-R ： TGTCTGGCAATGCGCCCCACGGATCCTTTTTGATTAAAATTAAAAA ； xyl2-F ： TTTTTAATTTTAATCAAAAAGGATCCATGTCCAACCCATCTTTGGT ； xyl2-R ： GGGCCCTCTAGATTACTCAGGACCGTCAATAA ； (2) 获得木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因 提取葡萄牙假丝酵母的总 RNA， 使用引物 3sites oligo dT 进行反转录， 得到 cDNA ； 以 得 到 的 cDNA 作 为 模 板， 使 用 引 物 对 X。
13、YL1-DEG-F+XYL1-DEG-R 以 及 引 物 对 XYL2-DEG-F+XYL2-DEG-R 分别进行 PCR， PCR 产物经过纯化后与 T 载体连接， 测序后证明是 木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因的部分序列 ； 3 RACE ： 以步骤得到的 cDNA 为模板， 分别使用特异引物 xyl1 3sites F 和 xyl2 3sites F 结合 3sites Adaptor 引物进行 PCR 反应， PCR 产物纯化后连接 T 载体后测序 ； 5 RACE ： 提取葡萄牙假丝酵母的总 RNA， 使用引物 3sites oligo dT 和 5sites Tri-G进行反转录， 得。
14、到cDNA ； 以该cDNA为模板， 分别使用特异引物xyl1 5sites R和xyl2 5sites R 结合 5sites Adaptor 引物进行 PCR 反应， PCR 产物纯化后连接 T 载体后测序 ； 再以步骤得到的cDNA为模板， 使用xyl1-cDNA-F和xyl1-cDNA-R为引物对， PCR得 到木糖还原酶基因 ； 使用 xyl2-cDNA-F 和 xyl2-cDNA-R 为引物对， PCR 得到木糖醇脱氢酶基 因 ； (3) 获得木酮糖激酶启动子片段、 磷酸甘油激酶启动子片段、 木酮糖激酶基因片段、 磷 酸丙糖异构酶启动子片段、 磷酸丙糖异构酶终止子片段、 葡萄糖转运。
15、蛋白 HXT7 启动子片段 以酿酒酵母基因组 DNA 为模板， 以 pXKS1-F 和 pXKS1-R 为引物对， PCR 得到木酮糖激酶 启动子片段 ； 以 pPGK1-F 和 pPGK1-R 为引物对， PCR 得到磷酸甘油激酶启动子片段 ； 以 XKS1 权 利 要 求 书 CN 104328061 A 3 3/4 页 4 ORF-F 和 XKS1 ORF-R 为引物对， PCR 得到木酮糖激酶基因片段 ； 以 pTPI1-F 和 pTPI1-R 为引 物对， PCR 得到磷酸丙糖异构酶启动子片段 ； 以 tTPI1-F 和 tTPI1-R 为引物对， PCR 得到磷 酸丙糖异构酶终止子。
16、片段 ； 以pHXT7-F和pHXT7-R为引物对， PCR得到葡萄糖转运蛋白HXT7 的启动子片段 ； (4) 重组载体的构建 I、 酿酒酵母整合型表达载体 YIplac211-dpXKS 的构建 用 BamHI-KpnI 酶切磷酸甘油激酶启动子片段， 连入 YIplac211 的 BamHI-KpnI 切口， 得 到质粒YIplac211-Pp ； 接着用KpnI-EcoRI酶切木酮糖激酶启动子片段， 连入YIplac211-Pp 的 KpnI-EcoRI 切口， 得到质粒 YIplac211-dp ； 用 SalI-BamHI 酶切木酮糖激酶基因片段， 连 入 YIplac211-dp 。
17、的 SalI-BamHI 切口， 得到质粒 YIplac211-dpXKS ； II、 质粒 pOJ04 的构建 以步骤 (2) 得到的 cDNA 为模板， 以 xyl1-F 和 xyl1-R 为引物对， 扩增得到 xyl1 基 因 ； 以步骤 (2) 得到的 cDNA 为模板， 以 xyl2-F 和 xyl2-R 为引物对， 扩增得到 xyl2 基因 ； 用SpeI-EcoRI酶切上一步骤得到的磷酸丙糖异构酶启动子片段， 连入pYES2的SpeI-EcoRI 切口， 得到质粒 pOJ01 ； 将 xyl1 基因和上一步骤得到的磷酸丙糖异构酶终止子片段等摩 尔比混合后作为模板， 使用引物对 x。
18、yl1-F+tTPI1-R 扩增得到 XYL1-tTPI1 ； 将 xyl2 基因 和上一步骤得到的葡萄糖转运蛋白 HXT7 启动子片段等摩尔比混合后作为模板， 使用引物 对 pHXT7-F+xyl2-R 扩增得到 pHXT7-XYL2 ； XYL1-tTPI1 和 pHXT7-XYL2 经纯化后， 以之作为 模板再次进行融合 PCR， 使用引物对 xyl1-F+xyl2-R， 得到 4 片段的融合产物 XYL1-t-p-2 ； XYL1-t-p-2 用 EcoRI-XbaI 酶切， 连入 pOJ01 的 EcoRI-XbaI 切口， 得到质粒 pOJ04 ； (5) 木酮糖激酶过表达的酿酒酵。
19、母菌的制备 将线性化的YIplac211-dpXKS转化入酿酒酵母感受态细胞， 涂布于含有1M山梨醇溶液 的尿嘧啶省却培养基选择性平板， 30倒置培养 ； 使用引物 pPGK1-F 和 XKS1-ext-R 通过菌 落 PCR 筛选得到阳性克隆 ； 将阳性克隆涂布于含有 5-FOA 的筛选平板上， 使用引物 pPGK1-F 和 XKS1-ext-R 再次筛选 pPGK1 正确插入到 XKS ORF 之前的转化子， 得到木酮糖激酶过表达 的酿酒酵母菌 ； (6) 表达木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因的酿酒酵母重组菌株的获得 将木酮糖激酶过表达的酿酒酵母菌处理成感受态细胞 ； 接着将线性化的 pO。
20、J04 转化入 木酮糖激酶过表达的酿酒酵母菌感受态细胞中， 涂布于含有 1M 山梨醇溶液的尿嘧啶省却 培养基选择性平板， 30倒置培养， 使用引物xyl1-F和xyl1-R进行菌落PCR， 筛选出表达木 糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因的酿酒酵母重组菌株。 9. 根据权利要求 8 所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌的制备方法， 其特征 在于 ： 步骤 (2) 中所述的葡萄牙假丝酵母为萄萄牙假丝酵母 Candida lusitaniae CICC 1461 ； 步骤(2)和中所述的PCR的体系为 ： Premix LA Taq 25L、 浓度为10mM的上游引 物 4L、 浓度为 10mM 。
21、的下游引物 4L、 模板 2L， ddH2O 补足至 50L ； 步骤 (2) 中所述的 PCR 的体系为 ： Premix LA Taq 25L、 浓度为 10mM 的特异引物 2L、 浓度为 10mM 的 3sites Adaptor 2L、 模板 2L， ddH2O 补足至 50L ； 权 利 要 求 书 CN 104328061 A 4 4/4 页 5 步骤 (2) 中所述的反转录的具体步骤如下 ： A、 将浓度 1g/L 的总 RNA2.75L 和浓度为 100M 的 3sites oligo dT 引物 1L 混合均匀， 离心后在 PCR 仪上 72温育 3min， 然后冷却至 4。
22、2处理 2min， 离心后冰浴 ； B、 往步骤 A 得到的反应液中加入浓度为 20M 的 5sites Tri-G 引物 1L， 混合均匀 ； 接着加入 Master Micture 溶液， 混合均匀 ； 42温育 90min 进行逆转录 ； 70处理 10min 终止反应 ； 加入 100L Tris-EDTA 缓冲液， 得到 cDNA ； Master Micture 溶液的组成如下 ： ddH2O0.75l、 5Buffer 2l、 浓度为 10mM 的 dNTP mixture 1l、 浓度为 20 U/l 的 RNase Inhibitor0.5l、 浓度为 100U 的 SMAR。
23、TScribe Reverse Transcriptase 1l ； 步骤 (2) 中所述的 PCR 的体系为 ： Premix LA Taq 25L、 浓度为 10mM 的特异引物 2L、 浓度为 10mM 的 5sites Adaptor 2L、 模板 2L， ddH2O 补足至 50L ； 步骤 (2) 中所述 PCR 的条件为 ： 94 1min ； 94 30s， 55 30s， 72延伸 1kb/min， 30cycles ； 72 10min ； 步骤 (3) 和步骤 (5) 中所述的酿酒酵母为酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae CICC 1917 ； 步。
24、骤(3)中所述的PCR的反应体系为 ： Premix LA Taq 25L、 浓度为10mM的上游引物 2L、 浓度为 10mM 的下游引物 2L、 模板 2L， ddH2O 补足至 50L。 10.权利要求17任一项所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌的应用， 其特 征在于 ： 所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌用于以木糖为原料生产乙醇。 权 利 要 求 书 CN 104328061 A 5 1/11 页 6 利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌及制备方法与应 用 技术领域 0001 本发明属于生物工程技术领域， 特别涉及一种利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母 工程菌及制备方法与应用。。
25、 背景技术 0002 木质纤维素是一类丰富而廉价的可再生资源， 是生产燃料乙醇的主要材料， 经水 解后， 可得到以葡萄糖和木糖为主的发酵性糖。木糖的有效利用是木质纤维素生物转化生 产乙醇的关键环节之一。酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae 从人类有记载以来就一直 是生产乙醇的首选， 是目前在工业规模上发酵玉米淀粉和其他糖类化合物产乙醇的菌株， 耗糖迅速快、 乙醇耐受能力强， 在生物质转化中潜力具大。但酿酒酵母不能利用木糖， 鉴于 自然界缺少能高效转化木糖生产乙醇的酿酒菌种， 近年来通过基因工程技术获得了多种不 同类型的木糖发酵工程菌株， 其中酿酒酵母是主要研究对象。 但仍。
26、存在许多技术难题， 具有 进一步提升的空间。 0003 酿酒酵母工程菌株中普遍存在的问题可总结为 ： 碳源代谢抑制、 胞内戊糖代谢通 路中的氧化还原失衡、 以及底物摄取能力低下， 在整个木质纤维素的发酵过程中， 作为发酵 菌株的酿酒酵母还面临着来自环境和物料、 遗传途径、 胞内调节几方面的压力。 然而目前对 这些问题尚未有有效的解决办法， 将新型外源基因用于构建酿酒酵母木糖代谢途径， 可进 一步了解其它菌株的代谢机制， 是一种提高木糖发酵能力的有效策略， 对丰富微生物代谢 工程的认识有重要价值。 0004 根据代谢工程理论， 构建能利用木糖产乙醇的酿酒酵母工程菌株的重要途径 之一是克隆天然利用。
27、木糖的酵母菌的两个关键酶基因， 木糖还原酶基因 XYL1(xylose reductase， XR)和木糖醇脱氢酶基因XYL2(xylitol dehydrogenase,XDH)， 并使其在酿酒酵 母细胞中表达。 代谢通路中紧接着XYL1和XYL2的木酮糖激酶基因XKS(xylulokinase,XK) 也往往是酵母菌代谢木糖的瓶颈。引入外源 XYL1、 XYL2， 过表达宿主菌的 XKS， 有望得到高 效发酵木糖产乙醇的工程菌株。 发明内容 0005 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足， 提供一种利用木糖进行乙醇 发酵的酿酒酵母工程菌。该酿酒酵母工程菌可以以木糖为唯一碳源， 发酵。
28、生产乙醇。 0006 本发明的另一目的在于提供所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌的制 备方法。 0007 本发明的再一目的在于提供所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌的应 用。 0008 本发明的目的通过下述技术方案实现 ： 一种利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工 程菌， 含有如下核苷酸序列 ： 如 SEQ ID NO.1 所示的木糖还原酶基因、 如 SEQ ID NO.2 所示 说 明 书 CN 104328061 A 6 2/11 页 7 的木糖醇脱氢酶基因和如 SEQ ID NO.3 所示的木酮糖激酶基因 ； 0009 所述的木糖还原酶基因来自葡萄牙假丝酵母 ； 尚未有利用该基因。
29、的报道 ； 0010 所述的木糖醇脱氢酶基因来自葡萄牙假丝酵母 ； 尚未有利用该基因的报道 ； 0011 所述的木酮糖激酶基因在所述的利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌中过 表达 ； 0012 所述的过表达优选为使用强启动子启动木酮糖激酶基因的转录 ； 0013 所述的强启动子优选为磷酸甘油激酶启动子 ； 0014 所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌， 优选含有如下核苷酸序列 ： 启动 子 1+ 如 SEQ ID NO.1 所示的木糖还原酶基因 + 终止子 1、 启动子 2+ 如 SEQ ID NO.2 所示 的木糖醇脱氢酶基因 + 终止子 2 和启动子 3+SEQ ID NO.3 所。
30、示的木酮糖激酶基因 + 终止子 3 ； 0015 所述的启动子 1 优选为组成型启动子， 特别优选为磷酸丙糖异构酶启动子 (pTPI1)， 其来自酿酒酵母 ； 0016 所述的终止子 1 优选为磷酸丙糖异构酶终止子 (tTPI1)， 其来自酿酒酵母 ； 0017 所述的启动子 2 优选为组成型启动子， 特别优选为己糖转运蛋白 HXT7 的启动子 (pHXT7)， 其来自酿酒酵母 ； 0018 所述的终止子 2 优选为 CYC1 终止子， 其来自载体 pYES2 ； 0019 所述的启动子 3 优选为组成型强启动子， 保证了木酮糖激酶基因过表达 ； 特别优 选为磷酸甘油激酶启动子 (pPGK1)。
31、 ； 0020 所述的终止子 3 优选为木酮糖激酶终止子 ； 0021 所述的核苷酸序列优选为整合到所述酿酒酵母工程菌的染色体上 ； 0022 所述的利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌的出发菌株优选为酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae CICC 1917 ； 0023 所述的利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌， 优选名称为酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)004-PGK的菌株， 其于2014年8月20日保藏在位于中国武汉 武汉大学内的中国典型培养物保藏中心、 保藏号为 CCTCC NO ： M 2014385 ； 0024 所述利用木糖进。
32、行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌的制备方法， 包含如下步骤 ： 0025 (1) 设计如下引物 (5-3) 0026 表 1 0027 引物名称引物序列 (5-3， 除第一条引物外， 其他括号内为酶切位点 ) 3sites oligo dTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGTTTTTTTTTTTTTTTT(16) XYL1-DEG-FATGCTATTAAAGTAGGTTATAGATTATTYGAYGGNGC XYL1-DEG-RATTAAATGTGGTTGTTGTAAATATGGRTGRTGYTC XYL2-DEG-FGTTATAGTTGAAGTTAAGAAAACTGGNATHTGYG。
33、G 说 明 书 CN 104328061 A 7 3/11 页 8 XYL2-DEG-RCAGCTAATAAACCAACTGGACCNGCNCCRAA xyl1 3sites FCTTGAACCTCGAGTACCTTG xyl2 3sites FCCACATCCAAAGAAGGCGAAC 3sites AdaptorGAGCGGATAACAATTTCACACAGG 5sites Tri-GAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG xyl1 5sites RAAGTCGCTCAATGTCTTGTCC xyl2 5sites RTGGTCTGGCAACTTAACCAA 5sit。
34、es AdaptorAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC xyl1-cDNA-FGCTTTCCCGATGACACGTTTGCGAAAAT xyl1-cDNA-RAATATGACTAATAGAAGGTAATTTT xyl2-cDNA-FCCACCTCAAGGTATGAGCCTAT xyl2-cDNA-RAACGGAGAAGAAAACCATTAGCTTT pXKS1-FGGGCCCGAATTCAGCCCGACGGATATACCACTTATGT(EcoRI) pXKS1-RGGGCCCGGTACCTAAAGTACTAATCTCATCCTCCTTT(KpnI) pPGK1-FGGGCCC。
35、GGTACCAAGAAATTACCGTCGCTCGTG(KpnI) pPGK1-RGGGCCCGGATCCTGTTTTATATTTGTTGTAAA(BamHI) XKS1ORF-FGGGCCCGGATCCATGTTGTGTTCAGTAATTCA(BamHI) XKS1ORF-RGGGCCCGTCGACTTAGATGAGAGTCTTTTCCA(SalI) XKS1-ext-RGCGCTAATTTGATTTGTCT pTPI1-FGGGCCCACTAGTCTACGTATGGTCATTTCTTC(SpeI) pTPI1-RGGGCCCGAATTCCTGTATGTGTTTTTTGTAGT(EcoRI)。
36、 xyl1-FGGGCCCGAATTCATGGCCACTATTAAGTTGAA(EcoRI) xyl1-RTTTATATAATTATATTAATCGGTACCCTAGTGGAAGATTGGGATTT(KpnI) tTPI1-FAAATCCCAATCTTCCACTAGGGTACCGATTAATATAATTATATAAA(KpnI) 说 明 书 CN 104328061 A 8 4/11 页 9 tTPI1-RCATACCCCTCATTTCCACGGGAGCTCGCTCTTCTATATAACAGTTG(SacI) 0028 pHXT7-FCAACTGTTATATAGAAGAGCGAGCTCCCGT。
37、GGAAATGAGGGGTATG(SacI) pHXT7-RTGTCTGGCAATGCGCCCCACGGATCCTTTTTGATTAAAATTAAAAA(BamHI) xyl2-FTTTTTAATTTTAATCAAAAAGGATCCATGTCCAACCCATCTTTGGT(BamHI) xyl2-RGGGCCCTCTAGATTACTCAGGACCGTCAATAA(XbaI) 0029 注 ： 引物名称中最末尾带有 F 的为上游引物， 最末尾带有 R 的为下游引物 0030 (2) 获得木糖还原酶基因 (xyl1) 和木糖醇脱氢酶基因 (xyl2) 0031 提取葡萄牙假丝酵母的总 RNA， 使。
38、用引物 3sites oligo dT 进行反转录， 得到 cDNA ； 0032 以得到的 cDNA 作为模板， 使用引物对 XYL1-DEG-F+XYL1-DEG-R 以及引物对 XYL2-DEG-F+XYL2-DEG-R 分别进行 PCR， PCR 产物经过纯化后与 T 载体连接， 测序后证明是 木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因的部分序列 ； 0033 3 RACE ： 以步骤得到的 cDNA 为模板， 分别使用特异引物 xyl1 3sites F 和 xyl2 3sites F 结合 3sites Adaptor 引物进行 PCR 反应， PCR 产物纯化后连接 T 载体后测 序 ； 00。
39、34 5 RACE ： 提取葡萄牙假丝酵母的总 RNA， 使用引物 3sites oligo dT 和 5sites Tri-G进行反转录， 得到cDNA ； 以该cDNA为模板， 分别使用特异引物xyl1 5sites R和xyl2 5sites R 结合 5sites Adaptor 引物进行 PCR 反应， PCR 产物纯化后连接 T 载体后测序 ； 0035 再以步骤得到的 cDNA 为模板， 使用 xyl1-cDNA-F 和 xyl1-cDNA-R 为引物对， PCR 得到木糖还原酶基因 ； 使用 xyl2-cDNA-F 和 xyl2-cDNA-R 为引物对， PCR 得到木糖醇脱 。
40、氢酶基因 ； 0036 (3) 获得木酮糖激酶启动子 (pXKS) 片段、 磷酸甘油激酶启动子 (pPGK1) 片段、 木 酮糖激酶基因 (XKS) 片段、 磷酸丙糖异构酶启动子 (pTPI1) 片段、 磷酸丙糖异构酶终止子 (tTPI1) 片段、 葡萄糖转运蛋白 HXT7 启动子 (pHXT7) 片段 0037 以酿酒酵母基因组 DNA 为模板， 以 pXKS1-F 和 pXKS1-R 为引物对， PCR 得到木酮糖 激酶启动子片段 ； 以 pPGK1-F 和 pPGK1-R 为引物对， PCR 得到磷酸甘油激酶启动子片段 ； 以 XKS1ORF-F 和 XKS1ORF-R 为引物对， PC。
41、R 得到木酮糖激酶基因片段 ； 以 pTPI1-F 和 pTPI1-R 为引物对， PCR 得到磷酸丙糖异构酶启动子片段 ； 以 tTPI1-F 和 tTPI1-R 为引物对， PCR 得 到磷酸丙糖异构酶终止子片段 ； 以 pHXT7-F 和 pHXT7-R 为引物对， PCR 得到葡萄糖转运蛋白 HXT7 的启动子片段 ； 0038 (4) 重组载体的构建 0039 I、 酿酒酵母整合型表达载体 YIplac211-dpXKS 的构建 0040 用 BamHI-KpnI 酶切磷酸甘油激酶启动子片段， 连入 YIplac211 的 BamHI-KpnI 切口， 得到质粒 YIplac211-。
42、Pp ； 接着用 KpnI-EcoRI 酶切木酮糖激酶启动子片段， 连入 YIplac211-Pp 的 KpnI-EcoRI 切口， 得到质粒 YIplac211-dp ； 用 SalI-BamHI 酶切木酮糖激 说 明 书 CN 104328061 A 9 5/11 页 10 酶基因片段， 连入 YIplac211-dp 的 SalI-BamHI 切口， 得到质粒 YIplac211-dpXKS ； 0041 II、 质粒 pOJ04 的构建 0042 以步骤 (2) 得到的 cDNA 为模板， 以 xyl1-F 和 xyl1-R 为引物对， 扩增得到 xyl1 基因 ； 以步骤 (2) 得。
43、到的 cDNA 为模板， 以 xyl2-F 和 xyl2-R 为引物对， 扩增得到 xyl2 基因 ； 用 SpeI-EcoRI 酶切上一步骤得到的磷酸丙糖异构酶启动子片段， 连入 pYES2 的 SpeI-EcoRI 切口， 得到质粒 pOJ01 ； 将 xyl1 基因和上一步骤得到的磷酸丙糖异构酶终 止子片段等摩尔比混合后作为模板， 使用引物对 xyl1-F+tTPI1-R 扩增得到 XYL1-tTPI1 ； 将 xyl2 基因和上一步骤得到的葡萄糖转运蛋白 HXT7 启动子片段等摩尔比混合后作为模 板， 使用引物对 pHXT7-F+xyl2-R 扩增得到 pHXT7-XYL2 ； XYL。
44、1-tTPI1 和 pHXT7-XYL2 经纯化 后， 以之作为模板再次进行融合 PCR， 使用引物对 xyl1-F+xyl2-R， 得到 4 片段的融合产物 XYL1-t-p-2 ； XYL1-t-p-2 用 EcoRI-XbaI 酶切， 连入 pOJ01 的 EcoRI-XbaI 切口， 得到质粒 pOJ04 ； 0043 (5) 木酮糖激酶过表达的酿酒酵母菌的制备 0044 将线性化的 YIplac211-dpXKS 转化入酿酒酵母感受态细胞， 涂布于含有 1M 山梨 醇溶液的尿嘧啶省却培养基选择性平板， 30倒置培养 ； 使用引物 pPGK1-F 和 XKS1-ext-R 通过菌落 P。
45、CR 筛选得到阳性克隆 ； 将阳性克隆涂布于含有 5-FOA 的筛选平板上， 使用引物 pPGK1-F 和 XKS1-ext-R 再次筛选 pPGK1 正确插入到 XKS ORF 之前的转化子， 得到木酮糖激 酶过表达的酿酒酵母菌 ； 0045 (6) 表达木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因的酿酒酵母重组菌株的获得 0046 将木酮糖激酶过表达的酿酒酵母菌处理成感受态细胞 ； 接着将线性化的 pOJ04 转 化入木酮糖激酶过表达的酿酒酵母菌感受态细胞中， 涂布于含有 1M 山梨醇溶液的尿嘧啶 省却培养基选择性平板， 30倒置培养， 使用引物xyl1-F和xyl1-R进行菌落PCR， 筛选出表 达。
46、木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因的酿酒酵母重组菌株。 0047 步骤 (2) 中所述的葡萄牙假丝酵母优选为萄萄牙假丝酵母 Candida lusitaniae CICC 1461 ； 0048 步骤 (2) 中所述的反转录的体系和反应条件按说明书操作 ； 0049 步骤 (2) 和中所述的 PCR 的体系优选为 ： Premix LA Taq 25L、 浓度为 10mM 的上游引物 4L、 浓度为 10mM 的下游引物 4L、 模板 2L， ddH2O 补足至 50L ； 0050 步骤(2)中所述的PCR的体系优选为 ： Premix LA Taq 25L、 浓度为10mM的特 异引物 2L。
47、、 浓度为 10mM 的 3sites Adaptor 2L、 模板 2L， ddH2O 补足至 50L ； 0051 步骤 (2) 中所述的反转录的具体步骤如下 ： 0052 A、 将浓度 1g/L 的总 RNA 2.75L 和浓度为 100M 的 3sites oligo dT 引物 1L混合均匀， 离心后在PCR仪上72温育3min， 然后冷却至42处理2min， 离心后冰浴 ； 0053 B、 往步骤 A 得到的反应液中加入浓度为 20M 的 5sites Tri-G 引物 1L， 混合 均匀 ； 接着加入 Master Micture 溶液， 混合均匀 ； 42温育 90min 进行。
48、逆转录 ； 70处理 10min终止反应 ； 加入100L Tris-EDTA缓冲液， 得到cDNA ； Master Micture溶液的组成如 下 ： ddH2O 0.75l、 5Buffer 2l、 浓度为 10mM 的 dNTP mixture 1l、 浓度为 20U/l 的RNase Inhibitor 0.5l、 浓度为100U的SMARTScribe Reverse Transcriptase 1l ； 0054 步骤(2)中所述的PCR的体系为 ： Premix LA Taq 25L、 浓度为10mM的特异引 说 明 书 CN 104328061 A 10 6/11 页 11 。
49、物 2L、 浓度为 10mM 的 5sites Adaptor 2L、 模板 2L， ddH2O 补足至 50L ； 0055 步骤(2)中所述PCR的条件为 ： 941min ； 9430s， 5530s， 72延伸1kb/min， 30cycles ； 72 10min ； 0056 步 骤 (3) 和 步 骤 (5) 中 所 述 的 酿 酒 酵 母 优 选 为 酿 酒 酵 母 Saccharomyces cerevisiae CICC 1917 ； 0057 步骤 (3) 中所述的 PCR 的反应体系优选为 ： Premix LA Taq 25L、 上游引物 (10mM)2L、 下游引物 (10mM)2L、 模板 2L， ddH2O 补足至 50L。 0058 所述利用木糖进。