基于氧化石墨烯材料的造影剂及其制备方法.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201310435341.7 (22)申请日 2013.09.23 A61K 49/14(2006.01) A61K 49/12(2006.01) A61K 49/10(2006.01) A61K 49/08(2006.01) A61K 49/00(2006.01) A61K 47/42(2006.01) A61K 47/36(2006.01) A61K 47/34(2006.01) A61K 47/04(2006.01) (71)申请人 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿 生研究所 地址 215123 江苏省苏州市苏州工业园区若 水路 39。

2、8 号 (72)发明人 张智军 张萌欣 (74)专利代理机构 上海一平知识产权代理有限 公司 31266 代理人 祝莲君 刘真真 (54) 发明名称 基于氧化石墨烯材料的造影剂及其制备方法 (57) 摘要 本发明提供了一种基于氧化石墨烯材料的造 影剂及其制备方法， 具体地， 本发明提供了一种造 影剂， 所述的造影剂具有式I结构。 式中， A为氧化 石墨烯， R为钆金属络合物， B为桥联分子， 且A、 B、 R 之间通过化学键互相结合。本发明的造影剂具 有弛豫率高， 稳定性好， 非特异性等特征。 A-(B-R) n (I)。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)。

3、发明专利申请 权利要求书2页 说明书9页 附图4页 (10)申请公布号 CN 104436221 A (43)申请公布日 2015.03.25 CN 104436221 A 1/2 页 2 1. 一种造影剂， 其特征在于， 所述的造影剂具有式 I 结构 ： A-(B-R)n (I) 式中， A 为氧化石墨烯， 或被功能化基团修饰的氧化石墨烯 ； R 为钆金属络合物， 所述钆金属络合物由络合分子 Ra 与钆金属络合形成 ； B 为桥联分子， 所述的桥联分子通过化学键与所述的氧化石墨烯表面相连， 并通过化学 键与所述的钆金属络合物相连 ； “-“ 表示化学键 ； n 大于 1。 2. 如权利要求 。

4、1 所述的造影剂， 其特征在于， 所述的桥联分子选自下组 ： 双官能团分 子、 多官能团分子， 或其组合。 3. 如权利要求 1 所述的造影剂的制备方法， 其特征在于， 所述的方法包括以下步骤 ： (i) 提供一表面连接有桥联分子的氧化石墨烯 A-(B)m， 其中所述桥联分子 B 通过化学 键连于氧化石墨烯 A 的表面 ； (ii) 用络合分子 Ra 与所述的表面连接有桥联分子的氧化石墨烯 A-(B)m进行反应， 形 成表面连接有络合分子的、 式 Ia 所示的氧化石墨烯 ； A-(B-Ra)n (Ia) (iii)将式Ia所示的表面连接有络合分子的氧化石墨烯与钆盐和/或钆盐溶液进行络 合反应，。

5、 得到如权利要求 1 所述的式 I 所示的造影剂 ； 其中， A、 B、 R、 n 的定义如权利要求 1 所述 ； Ra 为络合分子， m 大于 1。 4. 如权利要求 3 所述的制备方法， 其特征在于， 所述的表面修饰有桥联分子的氧化石 墨烯通过包括以下步骤的方法制备 ： (a) 提供一氧化石墨烯 ； (b) 将桥联分子与所述的氧化石墨烯反应， 得到表面修饰有桥联分子的氧化石墨烯。 5. 如权利要求 3 所述的制备方法， 其特征在于， 还包括以下特征 ： 所述的钆盐为水溶性钆盐， 较佳地选自下组 ： 氯化钆、 硝酸钆， 或其组合 ； 所述的桥联分子选自下组 ： 官能团化的聚乙二醇、 官能团化。

6、的聚乙烯亚胺、 官能团化的 树状大分子、 透明质酸、 壳聚糖、 葡聚糖、 聚乳酸 - 羟基乙酸， 或其组合。 6. 一种造影剂组合物， 其特征在于， 所述的造影剂包括稀释剂以及权利要求 1 所述的 造影剂。 7. 如权利要求 6 所述的造影剂组合物， 其特征在于， 所述的组合物还包括选自下组的 药物组分 ： 治疗性药物、 示踪性分子， 或其组合 ； 和 / 或 所述组合物还包括选自下组的组分 ： 钆离子、 锰离子、 钆纳米粒子、 锰纳米粒子、 小尺寸 四氧化三铁纳米粒子， 或其组合。 8. 一种造影方法， 其特征在于， 包括步骤 ： 将权利要求 1 或权利要求 6 所述的造影剂组合物施用于待造。

7、影的对象或样品， 并进行 造影。 9. 一种药物组合物， 其特征在于， 所述的药物组合物包括 ： (i) 如权利要求 1 所述的造影剂， 所述造影剂作为药物载体 ； 权 利 要 求 书 CN 104436221 A 2 2/2 页 3 (ii) 负载于所述造影剂上的药物活性成分 ； 和 (iii) 药学上可接受的其他载体。 10. 如权利要求 9 所述的药物组合物， 其特征在于， 所述的药物活性成分选自下组 ： 治 疗性药物、 示踪性分子， 或其组合。 11. 一种造影剂中间体， 其特征在于， 所述的造影剂具有式 Ia 结构 ： A-(B-Ra)n (Ia) 式中， A 为氧化石墨烯， 或被功。

8、能化基团修饰的氧化石墨烯 ； Ra 为络合分子， 所述络合分子可与钆金属形成络合物 ； B 为桥联分子， 所述的桥联分子通过化学键与所述的石墨烯表面相连， 并通过化学键与 所述的络合分子相连 ； “-“ 表示化学键 ； n 大于 1。 12.一种权利要求11所述的造影剂中间体的用途， 其特征在于， 用于制备权利要求1所 述的造影剂。 权 利 要 求 书 CN 104436221 A 3 1/9 页 4 基于氧化石墨烯材料的造影剂及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及医用纳米材料领域， 具体地， 本发明涉及一种具有优越磁共振造影性 能的功能化氧化石墨烯材料， 及其制备方法。 背景技术 00。

9、02 石墨烯由碳原子以 sp2杂化连接的单原子层构成， 其基本结构单元为有机材料中 最稳定的苯六元环。近两年来石墨烯在生物医学领域的研究发展迅速。特别是石墨烯最重 要的衍生物之一， 氧化石墨烯， 由于其良好的生物相容性， 超高的比表面积， 能够化学功能 化修饰， 在生物医学上可广泛应用于靶向药物输运、 细胞成像、 生物检测、 肿瘤治疗等方面 (Liu,Z.;Robinson,J.T.;Sun,X.;Dai,H.J.Am.Chem.Soc.2008,130,10876.Zhang,L.;Xia, J.;Zhao,Q.;Liu,L.;Zhang,Z.Small.2010,6,537.G.;Vila。

10、,M.;Portols,M.T .;Vallet-Regi,M.;Gracio,J.;Marques,P.A.Adv.Healthcare Mater.2013,2,1072.)。 0003 磁共振成像是利用磁共振现象， 借助计算机技术和二维图像重建方法进行成像， 是一种无创的影像手段。其具有无电离辐射、 可实现多核、 多参数成像等优点。医学临床上 需要得到精确的诊断学图像和数据， 但人体的某些病变组织有时与正常组织之间的信号差 异不大， 故需要使用造影剂帮助得到对比度清晰的磁共振图像。有报告显示至 2009 年全球 各类造影剂销售额已超过 180 亿美元， 且以每年 6-8% 的速度在全球范。

11、围内增长。根据有关 数据显示， 在中国国内医药市场上， 各种造影剂每年以 25-30% 的速率递增。 0004 目前市场上的造影剂主要是 DTPA-Gd， 但其存在着弛豫率偏低， 在体内代谢快， 存 留时间短， 稳定性差等问题。因此， 本领域尚缺乏一种弛豫率高， 体内代谢慢， 存留时间长， 稳定性好的造影剂。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种弛豫率高， 稳定性好的造影剂及其制备方法。 0006 在本发明的第一方面， 提供了一种造影剂， 所述的造影剂具有式 I 结构 ： 0007 A-(B-R)n (I) 0008 式中， A 为氧化石墨烯， 或被功能化基团修饰的氧化石墨烯 ； 000。

12、9 R 为钆金属络合物， 所述钆金属络合物由络合分子 Ra 与钆金属络合形成 ； 0010 B 为桥联分子， 所述的桥联分子通过化学键与所述的氧化石墨烯表面相连， 并通过 化学键与所述的钆金属络合物相连 ； 0011 “-“ 表示化学键 ； 0012 n 大于 1。 0013 在另一优选例中， 所述的功能化基团选自下组 ： 羧基、 磺酸基、 羟基、 叶酸等基团或 分子， 或其组合。 0014 在另一优选例中， 所述的钆金属络合物包括络合分子和与所述的络合分子络合的 钆离子。 说 明 书 CN 104436221 A 4 2/9 页 5 0015 在另一优选例中， 所述的氧化石墨烯包括经修饰的或。

13、未经修饰的氧化石墨烯。 0016 在另一优选例中， 所述的经修饰的氧化石墨烯可以是表面修饰有靶向基团或靶向 分子的氧化石墨烯。 0017 在另一优选例中， 所述的靶向分子包括蛋白、 多肽、 核酸、 多糖、 小分子化合物。 0018 在另一优选例中， 所述的小分子化合物选自下组 ： 叶酸、 乳糖酸， 或其组合。 0019 在另一优选例中， 所述的靶向分子包括抗体、 配体、 叶酸。 0020 在另一优选例中， 所述的桥联分子选自下组 ： 双官能团分子、 多官能团分子， 或其 组合。 0021 在另一优选例中， 所述的双 / 多官能团分子选自下组 ： 官能团化的聚乙二醇、 官 能团化的聚乙烯亚胺、 。

14、官能团化的树状大分子、 透明质酸、 壳聚糖、 葡聚糖、 聚乳酸 - 羟基乙 酸， 或其组合 ； 和 / 或 0022 所述的络合分子选自下组 ： 二乙三胺五乙酸 (DTPA) 或其衍生物， 1,4,7,10- 四氮 杂环十二烷 -1,4,7,10- 四乙酸 (DOTA) 或其衍生物， 或其组合。 0023 在另一优选例中， 所述的官能团选自下组 ： 羟基、 氨基、 羧基、 醛基、 巯基、 叠氮基、 异氰酸基、 硅烷基、 马来酰亚胺、 琥珀酰亚胺碳酸酯、 琥珀酰亚胺乙酸酯、 琥珀酰亚胺丙酸 酯、 琥珀酰亚胺琥珀酸酯、 琥珀酰亚胺戊酸酯， 或其组合。 0024 在另一优选例中， 所述酯为与取代或未。

15、取代的 C1-C20 烷基或 C3-C20 的环烷基所 形成的酯。 0025 在另一优选例中， 所述的桥联分子是生物相容性分子。 0026 在另一优选例中， 所述的桥联分子上还修饰有能够特异性地与细胞相互作用的基 团。 0027 在另一优选例中， 所述的二乙三胺五乙酸衍生物或 1,4,7,10- 四氮杂环十二 烷 -1,4,7,10- 四乙酸衍生物选自下组 ： 二乙三胺五乙酸 - 双二甲酰胺 (DTPA-BDMA)、 二乙 三胺五乙酸 - 双 ( 异烟肼 )(DTPA-BIN)、 二乙三胺五乙酸 - 双甲酰胺 (DTPA-BMA)、 1， 4， 7， 10- 四氮杂环十二烷 -1， 4， 7-。

16、 三乙酸 (DO3A)、 10-(2- 羟丙基 )-1,4,7,10- 四氮杂环十二 烷 -1,4,7- 三乙酸 (HPDO3A)、 2- 甲基 -1,4,7,10- 四氮杂环十二烷 -1,4,7,10- 四乙酸 (MCTA)、 (, , , )- 四甲基 -1,4,7,10- 四氮杂环十二烷 -1,4,7,10- 四乙 酸 (DOTMA) 等， 或其组合。 0028 在另一优选例中， 在所述的造影剂中， 所述的桥联分子与石墨烯的质量比为 1 ： 0.2 5。 0029 在另一优选例中， 所述的造影剂是可用于细胞成像的造影剂。 0030 在另一优选例中， 所述的造影剂是非靶向性造影剂。 003。

17、1 在另一优选例中， 所述的造影剂具有以下性能 ： 0032 在 11.7T 磁场强度下， 弛豫率 r1测定为 5mM-1S-1弛豫率 r1 20mM-1S-1； 较佳地 为 8mM-1S-1弛豫率 r1 12mM-1S-1； 和 / 或 0033 在生理性溶液中无聚沉现象出现。 0034 在另一优选例中， 所述的生理性溶液选自下组 ： 胎牛血清、 DMEM 细胞培养液， 或其 组合。 0035 在另一优选例中， 所述的 “无聚沉现象” 指， 将本发明造影剂与生理性溶液混合后 说 明 书 CN 104436221 A 5 3/9 页 6 形成浓度为 0.25mM 的溶液， 在室温下放置 48 。

18、小时后， 发生聚沉的造影剂比例 2wt ( 较 佳地 1wt )， 按造影剂的总重量计。 0036 本发明的第二方面， 提供了一种如本发明第一方面所述的造影剂的制备方法， 所 述的方法包括以下步骤 ： 0037 (i) 提供一表面连接有桥联分子的氧化石墨烯 A-(B)m， 其中所述桥联分子 B 通过 化学键连于氧化石墨烯 A 的表面 ； 0038 (ii) 用络合分子 Ra 与所述的表面连接有桥联分子的氧化石墨烯 A-(B)m进行反 应， 形成表面连接有络合分子的、 式 Ia 所示的氧化石墨烯 ； 0039 A-(B-Ra)n (Ia) 0040 (iii)将式Ia所示的表面连接有络合分子的氧。

19、化石墨烯与钆盐和/或钆盐溶液进 行络合反应， 得到如本发明第一方面所述的式 I 所示的造影剂 ； 0041 其中， A、 B、 R、 n 的定义如上文所述 ； 0042 Ra 为络合分子， m 大于 1。 0043 在另一优选例中， n m。 0044 在另一优选例中， 对所述步骤 (ii) 和 (iii) 还包括透析步骤。 0045 在另一优选例中， 所述的透析步骤用于去除未反应的钆离子、 钆金属络合物、 桥联 分子等反应物。 0046 在另一优选例中， 所述的表面修饰有桥联分子的氧化石墨烯通过包括以下步骤的 方法制备 ： 0047 (a) 提供一氧化石墨烯 ； 0048 (b) 将桥联分子。

20、与所述的氧化石墨烯反应， 得到表面修饰有桥联分子的氧化石墨 烯。 0049 在另一优选例中， 所述方法还包括以下特征 ： 0050 所述的钆盐为水溶性钆盐， 较佳地选自下组 ： 氯化钆、 硝酸钆， 或其组合 ； 0051 所述的桥联分子选自下组 ： 官能团化的聚乙二醇、 官能团化的聚乙烯亚胺、 官能团 化的树状大分子、 透明质酸、 壳聚糖、 葡聚糖、 聚乳酸 - 羟基乙酸， 或其组合。 0052 本发明的第三方面， 提供了一种造影剂组合物， 所述的造影剂包括稀释剂以及如 本发明第一方面所述的造影剂。 0053 在另一优选例中， 所述的造影剂是磁共振成像造影剂。 0054 在另一优选例中， 所述。

21、的造影剂组合物为溶液形式。 0055 在另一优选例中， 所述的组合物还包括选自下组的药物组分 ： 治疗性药物、 示踪性 分子， 或其组合 ； 和 / 或 0056 所述组合物还包括选自下组的组分 ： 钆离子、 锰离子、 钆纳米粒子、 锰纳米粒子、 小 尺寸四氧化三铁纳米粒子， 或其组合。 0057 在另一优选例中， 所述的治疗性药物选自下组 ： 阿霉素、 喜树碱、 易瑞沙、 血根碱 等， 或其组合。 0058 在另一优选例中， 所述的示踪性分子选自下组 ： 异硫氰酸荧光素、 罗丹明、 Cy 系列 染料、 AlexaFluor 系列染料、 阿霉素， 或其组合。 0059 在另一优选例中， 所述的。

22、小尺寸四氧化三铁纳米粒子的粒径 d 为 1 d 5nm。 说 明 书 CN 104436221 A 6 4/9 页 7 0060 本发明的第四方面， 提供了一种造影方法， 所述方法包括步骤 ： 0061 将本发明第一方面或本发明第三方面所述的造影剂组合物施用于待造影的对象 或样品， 并进行造影。 0062 在另一优选例中， 所述的造影方法是非诊断和非治疗性的。 0063 在另一优选例中， 所述的样品是细胞样品。 0064 在另一优选例中， 所述造影条件为在 0.5-20T 磁场强度下测定， 优选在 0.5-3T 磁 场强度下测定。 0065 本发明的第五方面， 提供了一种药物组合物， 所述的药。

23、物组合物包括 ： 0066 (i) 如本发明第一方面所述的造影剂， 所述造影剂作为药物载体 ； 0067 (ii) 负载于所述造影剂上的药物活性成分 ； 和 (iii) 药学上可接受的其他载体。 0068 在另一优选例中， 所述的造影剂为靶向性药物运载体。 0069 在另一优选例中， 所述的药物通过吸附方式与所述的造影剂结合。 0070 在另一优选例中， 所述的药物活性成分选自下组 ： 治疗性药物、 示踪性分子， 或其 组合。 0071 在另一优选例中， 所述的治疗性药物选自下组 ： 阿霉素、 喜树碱、 易瑞沙、 血根碱， 或其组合。 0072 在另一优选例中， 所述的示踪性分子选自下组 ： 。

24、异硫氰酸荧光素、 罗丹明、 Cy 系列 染料、 AlexaFluor 系列染料、 阿霉素， 或其组合。 0073 本发明的第六方面， 提供了一种造影剂中间体， 所述的造影剂中间体具有式 Ia 结 构 ： 0074 A-(B-Ra)n (Ia) 0075 式中， A 为氧化石墨烯， 或被功能化基团修饰的氧化石墨烯 ； 0076 Ra 为络合分子， 所述络合分子可与钆金属形成络合物 ； 0077 B 为桥联分子， 所述的桥联分子通过化学键与所述的石墨烯表面相连， 并通过化学 键与所述的络合分子相连 ； 0078 “-“ 表示化学键 ； 0079 n 大于 1。 0080 在另一优选例中， 所述的功。

25、能化修饰的氧化石墨烯选自下组 ： 羧基修饰的氧化石 墨烯、 磺酸基修饰的氧化石墨烯、 叶酸修饰的氧化石墨烯， 或其组合。 0081 本发明的第七方面， 提供了一种本发明第六方面所述的造影剂中间体用于制备如 本发明第一方面所述的造影剂的用途。 0082 应理解， 在本发明范围内中， 本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合， 从而构成新的或优选的技术方案。 限于篇幅， 在 此不再一一累述。 附图说明 0083 图 1 是本发明的基于氧化石墨烯的造影剂的制备示意图 ； 0084 图 2 是本发明的磁共振成像造影剂增强成像效果图 ； 0085 图 3 是本。

26、发明的磁共振成像造影剂用于细胞成像效果图 ； 说 明 书 CN 104436221 A 7 5/9 页 8 0086 图 4a 是本发明的磁共振成像造影剂用于负载药物的紫外 - 可见光谱图 ； 0087 图 4b 是本发明的磁共振成像造影剂负载药物后作用于癌细胞的细胞存活率图。 具体实施方式 0088 本发明人经过长期而深入的研究， 意外地发现， 通过在氧化石墨烯上共价修饰二 乙三胺五乙酸 - 钆， 可以制备得到非特异性的磁共振成像造影剂。所述的磁共振成像造影 剂成像效果好， 适用范围广， 稳定性好。基于上述发现， 发明人完成了本发明。 0089 术语 0090 如本文所用， 术语 “双官能团。

27、分子” 指分子内具有两个功能性基团的分子， 所述的 功能性基团是可以共价连接氧化石墨烯或二乙三胺五乙酸的基团。 所述的两个功能性基团 可相同或不同。 0091 术语 “取代” 是指基团上的氢原子被一个或多个选自下组的取代基取代 ： 卤素、 苯 基、 C1 C4 烷基 ； 其中所述的苯基包括未取代的苯基或具有 1-3 个选自羟基、 C1 C3 烷 基、 卤素的取代基的取代苯基。 0092 术语 “C1-C20 烷基” 指具有 1-20 个碳原子的直链或支链烷基， 例如甲基、 乙基、 丙 基、 异丙基、 丁基、 异丁基、 仲丁基、 叔丁基、 或类似基团。 0093 术语 “C3-C20 环烷基” 。

28、指具有 3-20 个碳原子的环烷基， 例如环丙烷基、 甲基环丙烷 基、 或类似基团。 0094 钆金属络合物 0095 如本文所用， 术语 “钆金属络合物” 指络合分子以及与所述的络合分子络合的钆离 子， 较佳地， 所述的络合是螯合形式。 0096 所述的钆金属络合物可以单独作为造影剂使用， 在本发明中， 所述的钆金属络合 物通过化学键连接方式与氧化石墨烯表面修饰的桥联分子连接。其中， 所述的化学键连接 方式包括共价键， 配位键等。 0097 特别地， 所述的钆金属络合物通过非物理吸附方式与桥联分子修饰的氧化石墨烯 连接。 0098 桥联分子 0099 如本文所用， 术语 “桥联分子” 指用于。

29、连接石墨烯表面与钆金属络合物的分子， 所 述的桥联分子通过化学键与所述的石墨烯表面相连。 0100 特别地， 所述的桥联分子通过共价结合、 配位键结合等化学键连接方式与钆金属 络合物相连。 0101 所述的桥联分子一般为具有两个或两个以上功能性基团的分子， 如双端具有官能 团的聚乙二醇分子等。 0102 在另一优选例中， 所述的桥联分子是生物相容性分子。 0103 在另一优选例中， 所述的桥联分子上还修饰有能够特异性地与细胞相互作用的基 团。如氨基酸、 肽、 抗体、 核酸、 单糖、 多糖、 维生素。 0104 磁共振成像造影剂 0105 本发明提供了一种造影剂， 所述的造影剂具有以下结构 ： 。

30、0106 A-(B-R)n (I) 说 明 书 CN 104436221 A 8 6/9 页 9 0107 式中， A 为氧化石墨烯， 或被功能化基团修饰的氧化石墨烯 ； 0108 R 为钆金属络合物， 所述钆金属络合物由络合分子 Ra 与钆金属络合形成 ； 0109 B 为桥联分子， 所述的桥联分子通过化学键与所述的氧化石墨烯表面相连， 并通过 化学键与所述的钆金属络合物相连 ； 0110 “-“ 表示化学键 ； 0111 n 大于 1。 0112 在另一优选例中， 在所述的造影剂中， 所述的 R 可以直接与石墨烯表面相连， 也可 以通过所述的桥联分子 B 与石墨烯表面连接， 优选通过所述的。

31、桥联分子 B 与石墨烯表面连 接。 0113 在另一优选例中， 所述的氧化石墨烯可以是表面修饰有靶向基团或靶向分子的氧 化石墨烯， 以改善造影剂与目标细胞系的结合。所述的氧化石墨烯也可以是未经修饰有靶 向基团或靶向分子的氧化石墨烯， 以得到非特异性的造影剂。 0114 所述的靶向分子可以是任何能够增加造影剂和细胞系的结合的靶向分子， 如蛋 白、 多肽、 核酸、 多糖、 小分子化合物等。 0115 在另一优选例中， 所述的靶向分子包括抗体、 配体、 叶酸。 0116 所述的络合分子可以是任意能够与钆离子络合， 且能够与桥联分子修饰的氧化石 墨烯通过化学键 ( 如配位键或共价键 ) 相连。较佳地，。

32、 所述的络合分子选自下组 ： 二乙三 胺五乙酸以及其衍生物、 1,4,7,10- 四氮杂环十二烷 -1,4,7,10- 四乙酸以及其衍生物， 或 其组合。其中， 所述的衍生物指二乙三胺五乙酸 - 双二甲酰胺 (DTPA-BDMA)、 二乙三胺五乙 酸-双(异烟肼)(DTPA-BIN)、 二乙三胺五乙酸-双甲酰胺(DTPA-BMA)、 1,4,7,10-四氮杂环 十二烷 -1,4,7- 三乙酸 (DO3A)、 10-(2- 羟丙基 )-1,4,7,10- 四氮杂环十二烷 -1,4,7- 三乙 酸(HPDO3A)、 2-甲基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(MCTA)、。

33、 (, , )- 四甲基 -1,4,7,10- 四氮杂环十二烷 -1,4,7,10- 四乙酸 (DOTMA) 等， 或其组 合。 0117 所述的造影剂可以单独作为造影剂使用， 也可以和其他组分共同作为造影剂使 用。在另一优选例中， 所述的造影剂还包括选自下组的组分 ： 钆离子、 锰离子、 钆纳米粒 子、 锰纳米粒子、 小尺寸四氧化三铁纳米粒子 , 或其组合。其中， 所述的小尺寸指粒径 d 为 1 d 5nm。 0118 特别地， 所述的造影剂可以用作细胞内造影剂， 用于进行细胞内成像和检测。 0119 在另一优选例中， 所述的造影剂还可以与其他组分共同使用， 如负载药物共同用 于人体或体外组。

34、织等。上述的药物可以是治疗性药物或示踪性分子等， 如阿霉素、 喜树碱、 易瑞沙、 血根碱、 紫杉醇、 异硫氰酸荧光素、 罗丹明、 Cy 系列染料、 AlexaFluor 系列染料等， 或其组合。 0120 所述的药物与所述的造影剂以吸附方式结合， 由于所述造影剂中， 钆金属络合物 以化学键方式与修饰的氧化石墨烯表面结合， 因此， 本发明的造影剂可以提供较大的吸附 量。在另一优选例中， 所述的药物递送载体的载药率为 50%， 较佳地为 60%， 更佳地为 70%。 0121 在另一优选例中， 所述的造影剂还可以用于制备药物组合物， 所述的药物组合物 包括 ： 说 明 书 CN 104436221。

35、 A 9 7/9 页 10 0122 (i) 如本发明第一方面所述的造影剂， 所述造影剂作为药物载体 ； 0123 (ii) 负载于所述造影剂上的药物活性成分 ； 和 0124 (iii) 药学上可接受的其他载体。 0125 在另一优选例中， 所述的造影剂为药物递送载体。 0126 在另一优选例中， 所述的药物通过吸附方式与所述的造影剂结合。 0127 所述的药物没有特别限制， 可以是阿霉素、 喜树碱、 易瑞沙、 血根碱、 紫杉醇等。 0128 造影剂的制备 0129 本发明所述的造影剂可以通过以下方法制备 ： 0130 (i) 提供一表面连接有桥联分子的氧化石墨烯 A-(B)m， 其中所述桥。

36、联分子 B 通过 化学键连于氧化石墨烯 A 的表面 ； 0131 (ii) 用络合分子 Ra 与所述的表面连接有桥联分子的氧化石墨烯 A-(B)m进行反 应， 形成表面连接有络合分子的、 式 Ia 所示的氧化石墨烯 ； 0132 A-(B-Ra)n (Ia) 0133 (iii)将式Ia所示的表面连接有络合分子的氧化石墨烯与钆盐和/或钆盐溶液进 行络合反应， 得到如本发明第一方面所述的式 I 所示的造影剂 ； 0134 其中， A、 B、 R、 n 的定义如本发明第一方面所述 ； 0135 Ra 为络合分子， m 大于 1。 0136 在另一优选例中， n m。 0137 在另一优选例中， 对。

37、所述步骤 (ii) 和 (iii) 还包括透析步骤。 0138 所述的表面修饰有桥联分子的氧化石墨烯可以通过市售途径获得， 或通过常规方 法制备。在另一优选例中， 所述的表面修饰有桥联分子的氧化石墨烯可以通过包括以下步 骤的方法制备 ： 0139 (a) 提供一氧化石墨烯 ； 0140 (b) 用桥联分子与所述的氧化石墨烯反应， 得到表面修饰有桥联分子的氧化石墨 烯。 0141 所述的钆盐为水溶性钆盐， 较佳地选自下组 ： 氯化钆、 硝酸钆， 或其组合。 0142 本发明的主要优点包括 ： 0143 (1) 提供了一种适用于制备磁共振成像造影剂的材料， 本发明所制备的磁共振成 像造影剂具有良好。

38、的生物相容性， 且与现有的同类型磁共振成像造影剂马根维显相比， 具 有更好的成像效果。 0144 (2) 相较于现有技术， 本发明的造影剂不仅显著改善了造影效果， 而且适用于多种 人体组织或细胞的成像， 不需要根据相应的组织或细胞进行特殊加工， 能够非特异性地或 广泛地适用于多种不同的人体组织或细胞。 0145 (3) 本发明的造影剂体内循环时间长， 并适合用于进行细胞内成像。 0146 (4) 本发明的造影剂易于负载药物， 且载药率高， 可达到 70% 或更高。 0147 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未。

39、注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条 件， 或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明， 否则百分比和份数按重量计算。 0148 实施例 1 磁共振成像造影剂的制备 说 明 书 CN 104436221 A 10 8/9 页 11 0149 本实施例中， 磁共振成像造影剂的制备分为三个步骤， 包括氧化石墨烯的制备， 聚 乙二醇分子修饰氧化石墨烯， 共价连接二乙三胺五乙酸以络合钆离子， 具体步骤如下 ： 0150 第一步， 氧化石墨烯的制备 ： 0151 将 1g 片状石墨、 0.5g 过硫酸钾、 0.5g 五氧化二磷溶于 1.5mL 浓硫酸中， 加热至 80反应 6 小时， 冷却到室温后， 。

40、再用水将其洗成中性， 自然干燥成粉末。将上述粉末加入 到 23mL 事先预冷至 0的浓硫酸中， 边搅拌边加入 3g 高锰酸钾， 保持温度在 20以下。将 混合物的温度升至 35， 搅拌 2h 后， 加入 46mL 三次水， 搅拌 15min。为中止氧化反应， 加入 140mL 三次水和 2mL 浓度为 30% 的过氧化氢。将混合物用 250mL10% 的盐酸离心清洗， 以除 去溶液中的金属离子。将上述氧化石墨用超声 2h， 10000 转 / 分钟离心 30min 到 1h， 上清液 即为氧化石墨烯， 进一步超声可制备出纳米尺度的氧化石墨烯。 0152 第二步， 聚乙二醇分子修饰的氧化石墨烯的。

41、制备 ： 0153 取第一步反应中得到的氧化石墨烯 5mL 预先超声半小时， 充分分散后， 调 pH 值约 为8， 加入聚乙二醇分子(PEG)水溶液1mL， 在室温搅拌下， 加入EDAC0.15mL， 继续搅拌， 再次 加入 EDAC0.35mL， 搅拌过夜。随后透析得到 PEG 修饰的氧化石墨烯。 0154 第三步， 氧化石墨烯 - 二乙三胺五乙酸 - 钆体系的制备及应用 ： 0155 将第二步反应中得到的聚乙二醇修饰的氧化石墨烯分散到有机相中， 取 5mL 并加 入二乙三胺五乙酸酸酐 0.1g， 再加入 EDAC1mL， 之后搅拌过夜。得到的产物经透析分散到水 相中。随后加入 GdCl3溶。

42、液， 搅拌 4 小时候除去未反应的 GdCl3， 即得到所需的造影剂。 0156 造影效果测试 ： 0157 该造影剂的制备示意图如图 1 所示， 其与市售马根维显相比， 能显著增强造影效 果 ( 图 2 所示 )， 在 11.7T 场强下约 2.4 倍， 为 10.8mM-1S-1。 0158 稳定性测试 ： 0159 该造影剂水溶液 ( 浓度为 0.5mM) 与生理性溶液 （分别为胎牛血清、 和 DMEM 细胞培 养液） 等体积比混合后， 形成浓度为 0.25mM 的溶液， 肉眼均未见明显沉淀。其中， 与胎牛血 清混合 24h 后留存在石墨烯上的钆离子浓度为该混合液的初始浓度 ( 完成混合。

43、时 ) 的 90% 以上。 0160 细胞内成像测试 ： 0161 将 HepG2 细胞接种于细胞培养皿内， 分别加入不同浓度梯度的造影剂材料， 共同 孵育24小时后， 消化收集细胞， 并用琼脂糖溶液固定细胞， 在11.7T磁场强度下进行细胞成 像测试 ( 结果如图 3 所示 )。 0162 负载药物测试 ： 0163 将阿霉素配置成浓度为 1mg/mL 的水溶液， 将其等体积加入上述制备的造影剂溶 液中， 调节溶液 pH 值， 避光搅拌约 4 小时后， 透析除去多余的阿霉素。结果显示， 本发明的 造影剂能够负载阿霉素 ( 图 4a 所示 )， 载药率可达到 70%， 并能有效地杀伤癌细胞 (。

44、 图 4b 所示 )。 0164 实施例 2 磁共振成像造影剂的制备 0165 步骤一、 步骤二同实施例 1。 0166 第三步， 氧化石墨烯 -(1,4,7,10- 四氮杂环十二烷 -1,4,7,10- 四乙酸 )- 钆体系 的制备及应用 ： 说 明 书 CN 104436221 A 11 9/9 页 12 0167 将第二步反应中得到的聚乙二醇修饰的氧化石墨烯分散到有机相中， 在 5ml 聚乙 二醇修饰的氧化石墨烯分散液中， 加入 1ml 浓度为 100mg/mL 的 1,4,7,10- 四氮杂环十二 烷 -1,4,7,10- 四乙酸溶液， 再加入 EDAC1ml， 搅拌过夜， 透析出去未。

45、反应的分子。之后加入 氯化钆盐溶液， 搅拌 4 小时后， 透析除去未反应的 Gd 离子， 即得到所需的造影剂。 0168 结果显示， 制得的造影剂与市售马根维显相比能显著增强造影效果， 在 11.7T 下 提高 2-3 倍。 0169 上述具体的制备工艺仅是作为示例给出， 其中所提到的修饰氧化石墨烯的分 子不仅仅局限于上述例子中所提到的聚乙二醇、 二乙三胺五乙酸、 钆离子， 也可以选用 其它分子， 如聚乙烯亚胺、 树状大分子、 透明质酸、 壳聚糖、 葡聚糖、 聚乳酸 - 羟基乙酸、 1,4,7,10- 四氮杂环十二烷 -1,4,7,10- 四乙酸、 锰离子、 锰纳米粒子、 小尺寸四氧化三铁纳 。

46、米粒子或其组合。 0170 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考， 就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。 说 明 书 CN 104436221 A 12 1/4 页 13 图 1 说 明 书 附 图 CN 104436221 A 13 2/4 页 14 图 2 说 明 书 附 图 CN 104436221 A 14 3/4 页 15 图 3 图 4a 说 明 书 附 图 CN 104436221 A 15 4/4 页 16 图 4b 说 明 书 附 图 CN 104436221 A 16 。