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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410820824.3 (22)申请日 2014.12.25 C07K 14/47(2006.01) C07K 1/107(2006.01) A23L 1/305(2006.01) A61K 8/64(2006.01) A61K 38/17(2006.01) A61P 37/04(2006.01) (71)申请人 天津科技大学 地址 300457 天津市滨海新区经济技术开发 区十三大街 29 号 (72)发明人 刘安军 刘昊雨 郑国强 郑捷 索佳丽 徐晓明 (74)专利代理机构 天津盛理知识产权代理有限 公司 12209 代理人 赵。
2、瑶瑶 (54) 发明名称 亚硒酸化 - 乳球蛋白及制备方法和应用 (57) 摘要 本发明涉及一种亚硒酸化 - 乳球蛋白的合 成制备方法及应用， 以 - 乳球蛋白和 SeO2 为原 料， 通过氧化-还原法向-乳球蛋白中导入亚硒 酸基团， 制备一种新的有机硒源。制备过程包括 ： 亚硒酸的制备 ； 含有亚硒酸的 - 乳球蛋白液体 的制备 ； 亚硒酸根的导入 ； 过滤、 离心沉淀 ； 冷冻 干燥， 得到纯品亚硒酸化-乳球蛋白。 本发明得 到的亚硒酸化 - 乳球蛋白营养价值高、 性质稳 定， 具有抗癌、 抗衰老效果， 是优质的有机硒源。 本 研究不仅对有机硒化蛋白的研制具有重大理论意 义， 而且对 “健。
3、康老龄化” 具有重大的社会现实意 义。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图6页 (10)申请公布号 CN 104479003 A (43)申请公布日 2015.04.01 CN 104479003 A 1/1 页 2 1.一种亚硒酸化 - 乳球蛋白， 其特征在于 ： 在 - 乳球蛋白的精氨酸胍基的亚胺基 团上导入亚硒酸根， 形成亚硒酸化 - 乳球蛋白。 2.一种亚硒酸化 - 乳球蛋白的制备方法， 其特征在于 ： 步骤如下 制备亚硒酸 ； 将 - 乳球蛋白加入到亚硒酸溶液中 ； 亚硒酸根的导入 ： 将步骤的溶液加入。
4、氧化剂， 在真空， 35-45， 反应 3-8h， 将亚硒 酸导入 - 乳球蛋白上的精氨酸残基， 生成亚硒酸化 - 乳球蛋白 ； 将亚硒酸化 - 乳球蛋白分离、 洗涤后获得亚硒酸化 - 乳球蛋白产物。 3.根据权利要求 2 所述的亚硒酸化 - 乳球蛋白的制备方法， 其特征在于 ： 当步骤 反应结束后溶液中有剩余的强氧化剂或亚硒酸根时， 用分子量 3000Da-7000Da 的超滤膜将 上步分子量较小的强氧化剂以及未能导入的亚硒酸根过滤除去。 4.根据权利要求 2 所述的亚硒酸化 - 乳球蛋白的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 用乙醇沉淀离心得到亚硒酸化 - 乳球蛋白， 将沉淀用乙醇洗涤 2。
5、-4 次， 完全除去无机 硒， 真空冷冻干燥后得到亚硒酸化 - 乳球蛋白产物。 5.根据权利要求 2 所述的亚硒酸化 - 乳球蛋白的制备方法， 其特征在于 ： 所述氧化 剂为氯酸、 氯酸盐、 次氯酸、 次氯酸盐或双氧水。 6.一种权利要求 1 所述的亚硒酸化 - 乳球蛋白作为保健品的应用。 7.一种权利要求 1 所述的亚硒酸化 - 乳球蛋白作为化妆品的应用。 8.一种权利要求1所述的亚硒酸化-乳球蛋白作为制备提高机体免疫力的药品的应 用。 权 利 要 求 书 CN 104479003 A 2 1/4 页 3 亚硒酸化 - 乳球蛋白及制备方法和应用 技术领域 0001 本发明属于食品科学技术、 。
6、有机化学以及生物制药领域等多学科交叉的领域， 提 供是一种亚硒酸化 - 乳球蛋白及合成制备方法和应用。 背景技术 0002 硒是生物机体必不可少的微量元素， 是体内重要的抗氧化剂。硒通过调节硒蛋白 或硒酶 ( 谷胱甘肽过氧化物酶与磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶 ) 影响生物体的自由基代谢、 抗氧化功能、 免疫功能、 生殖功能和细胞凋亡等。国内外大量的研究表明， 硒与机体的衰老 密切相关。硒作为脑功能的调节者， 参与多种伴随增龄出现的神经退行。 0003 土壤硒是生物体所需的主要硒源， 然而硒在地壳中的丰度极低， 其分布也极不均 衡， 全球有 40 多个国家和地区不同程度的缺硒， 由此导致了许多地方性。
7、硒缺乏性疾病的发 生， 如克山病、 大骨节病等。我国是世界上严重缺硒的国家之一， 大约 72的地域面积处于 不同程度的缺硒状态。 日常饮食无法满足人体的生理需要， 因此， 维持人体正常的生理机能 有赖于外源硒的摄取。 然而， 无机硒的治疗剂量和中毒剂量的范围非常狭窄， 而硒的抗氧化 作用等往往依赖于较高的剂量。 有机硒的毒性比无机硒小， 生物利用率高， 在激发免疫反应 上也比无机硒显著。因此， 高效低毒的有机硒源的合成与功能研究对于维持人体正常生理 机能、 延缓衰老有重要意义。 0004 - 乳球蛋白 (-lactoglobulin， -Lg) 是一种重要的乳清蛋白， 约占牛乳乳清 蛋白总量的。
8、50。 乳清一度被认为是乳品工业中乳酪、 干酪等乳制品加工的废弃物， 只将其 进行简单加工制成乳清粉或浓缩乳清蛋白等低附加值产品。 随着国民经济的发展和人们生 活水平的提高， 乳品工业发展迅速， 已成为我国食品工业重要的支柱产业之一。 乳清副产品 的开发利用备受人们关注。 乳清蛋白主要成分-乳球蛋白分子量约为18kDa， 由162个氨 基酸残基组成， 含有多种必需氨基酸， 其中含有 3 个精氨酸残基， 氨基酸比例合理， 是一种 天然优质蛋白。由于每个 - 乳球蛋白分子含有三个精氨酸残基， 能够结合三个亚硒酸根， 如果每人每日摄取 10 克 - 乳球蛋白， 同时就能摄入 0.07 毫克左右的硒，。
9、 正好在硒摄取量 的正常范围 0.05-0.1 毫克之间， 所以利用 - 乳球蛋白进行硒化， 有利于 - 乳球蛋白和 硒的共同开发利用。- 乳球蛋白真空调控硒化技术及硒化 - 乳球蛋白抗衰老分子机制 的研究对于其它新型有机硒化蛋白的开发研制及硒蛋白调控抗衰老功能性研究具有重大 理论意义， 并具有实际应用价值。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种亚硒酸化 - 乳球蛋白及制备方法和应用。本发明通 过氧化 - 还原法将亚硒酸根导入到 - 乳球蛋白精氨酸胍基的亚胺基团上生成亚硒酸化 - 乳球蛋白， 本合成制备方法工艺简单， 产品收率高。 0006 本发明的目的是这样实现的 ： 0007 一种。
10、亚硒酸化 - 乳球蛋白， 在 - 乳球蛋白的精氨酸胍基的亚胺基团上导入亚 说 明 书 CN 104479003 A 3 2/4 页 4 硒酸根， 形成亚硒酸化 - 乳球蛋白。 0008 一种亚硒酸化 - 乳球蛋白的制备方法， 步骤如下 0009 制备亚硒酸 ； 0010 将 - 乳球蛋白加入到亚硒酸溶液中 ； 0011 亚硒酸根的导入 ： 将步骤的溶液加入氧化剂， 在真空， 35-45， 反应 3-8h， 将 亚硒酸导入 - 乳球蛋白上的精氨酸残基， 生成亚硒酸化 - 乳球蛋白 ； 0012 将亚硒酸化 - 乳球蛋白分离、 洗涤后获得亚硒酸化 - 乳球蛋白产物。 0013 而且， 当步骤反应结。
11、束后溶液中有剩余的强氧化剂或亚硒酸根时， 用分子量 3000Da-7000Da 的超滤膜将上步分子量较小的强氧化剂以及未能导入的亚硒酸根过滤除 去。 0014 而且， 所述步骤用乙醇沉淀离心得到亚硒酸化 - 乳球蛋白， 将沉淀用乙醇洗 涤 2-4 次， 完全除去无机硒， 真空冷冻干燥后得到亚硒酸化 - 乳球蛋白产物。 0015 而且， 所述氧化剂为氯酸、 氯酸盐、 次氯酸、 次氯酸盐或双氧水。 0016 亚硒酸化 - 乳球蛋白作为保健品的应用。 0017 亚硒酸化 - 乳球蛋白作为化妆品的应用。 0018 亚硒酸化 - 乳球蛋白作为制备提高机体免疫力的药品的应用。 0019 本发明的优点和积极。
12、效果是 ： 0020 1、 本发明的原料 - 乳球蛋白来源于工业废料乳清， 在充分利用了废弃资源的同 时又降低了成本， 且 - 乳球蛋白是一种营养价值高的天然优质乳源性蛋白质， 在其中导 入亚硒酸根得到的亚硒酸化 - 乳球蛋白在补充硒的同时还能提供丰富的营养， 是优质的 有机硒源。 0021 2、 该亚硒酸化 - 乳球蛋白的制备技术是利用生物界中常见的氧化 - 还原现象 实现了 - 乳球蛋白的亚硒酸化， 在本制备方法当中， 可以使用来源广泛的氧化 - 还原剂， 如氯酸及其氯酸盐、 次氯酸及其次氯酸盐、 双氧水和高锰酸钾等均能够使亚硒酸结合到 - 乳球蛋白上， 氧化 - 还原剂的浓度可以是任一浓。
13、度。 0022 3、 本发明亚硒酸化 - 乳球蛋白的制备工艺相对简单， 并且产品得率高 ； 获得的 产品性质稳定， 它的稳定性远远高于二氧化硒、 亚硒酸及其化合物 ； 并能以粉末状的形态保 存， 易于储存， 可以制作成片剂、 胶囊等形式的保健品。 0023 4、 本发明将亚硒酸根的导入使得 - 乳球蛋白的高级结构发生改变， 使更多的基 团得以暴露， 增加了其溶解度， 从而更易于促进机体的吸收。 0024 5、 本发明提供的亚硒酸化 - 乳球蛋白对于血癌细胞 K562 具有显著杀伤作用， 通过实验证实在 100-300ug/ml 浓度下培养 24-72h 对 K562 细胞的抑制率可达到 50-。
14、90， K562 细胞出现典型的凋亡特征。 0025 6、 本发明提供的亚硒酸化 - 乳球蛋白具有低毒高效性。小鼠口服灌胃该亚硒酸 化 - 乳球蛋白每天 50-100mg/kg， 未见任何异常， 其毒性明显低于 SeO2。 附图说明 0026 图 1 为本发明亚硒酸化 - 乳球蛋白结构 ； 0027 图 2 为本发明 - 乳球蛋白的亚硒酸化反应， 图 2-1 是反应式， 图 2-2 是亚硒酸化 说 明 书 CN 104479003 A 4 3/4 页 5 - 乳球蛋白的氨基酸式 ； 0028 图 3 为本发明 - 乳球蛋白精氨酸胍基与亚硒酸结合的结构式 ； 0029 图 4 为本发明亚硒酸化 。
15、- 乳球蛋白与 - 乳球蛋白的红外色谱图 ； 0030 图 5 为本发明亚硒酸化 - 乳球蛋白 SDS-PAGE 凝胶电泳图 ； 0031 图 6 为本发明亚硒酸化 - 乳球蛋白与 - 乳球蛋白的圆二色谱图 ； 0032 图 7 为本发明亚硒酸化 - 乳球蛋白与 - 乳球蛋白的 X- 射线衍射图 ； 0033 图 8 为本发明亚硒酸化 - 乳球蛋白 ( 图 8b) 与 - 乳球蛋白 ( 图 8a) 的示差扫 描量热图 ； 0034 图 9 为本发明亚硒酸化 - 乳球蛋白对 K562 细胞形态的影响。( 图 9a)0h ； ( 图 9b)24h ； ( 图 9c)48h ； ( 图 9d)72h。
16、， 培养浓度均为 200ug/mL。 具体实施方式 0035 下面详细叙述本发明的实施例 ； 需要说明的是， 本实施例是叙述性的， 不是限定性 的， 不能以此限定本发明的保护范围。 0036 本专利意在制备新型有机硒化蛋白， 然后验证亚硒酸化 - 乳球蛋白的抗衰老功 能， 为其在医药、 保健品、 化妆品等领域的应用提供科学依据。 0037 本发明提供的亚硒酸化 - 乳球蛋白是通过氧化 - 还原法将亚硒酸根导入到 - 乳球蛋白精氨酸胍基的亚胺基团上生成亚硒酸化 - 乳球蛋白即亚硒酸化 - 乳球 蛋白的制备方法， 本合成制备方法工艺简单， 产品收率高， 其中亚硒酸化 - 乳球蛋白是在 - 乳球蛋白。
17、的精氨酸胍基上导入性质稳定的亚硒酸根。 0038 本发明的目的还在于合成亚硒酸化 - 乳球蛋白后， 进一步研究其在抗衰老和提 高机体免疫力等方面的应用。 0039 本发明所述的亚硒酸化 - 乳球蛋白通过以下步骤完成 ： 0040 亚硒酸 H2SeO3的制备 ： 二氧化硒 SeO 2与水 H2O 反应生成亚硒酸 H2SeO3； 0041 含有亚硒酸的 - 乳球蛋白液体的制备 ： 将 - 乳球蛋白置于含有上述步骤中 制备的过量的亚硒酸溶液中， 得到含有亚硒酸的 - 乳球蛋白液体 ； 0042 亚硒酸根的导入 ： 将上述含有亚硒酸的 - 乳球蛋白液体置于含有强氧化剂的 氧化-还原的环境状态下， 真空。
18、、 35-45以下反应3-8h， 可将亚硒酸导入-乳球蛋白上的 精氨酸残基， 生成亚硒酸化 - 乳球蛋白 ； 0043 反应完毕后除去反应液中的离子 ： 用分子量 3000Da-7000Da 的超滤膜将上步分 子量较小的强氧化剂以及未能导入的亚硒酸根过滤除去 ； 0044 亚硒酸化 - 乳球蛋白的收集 ： 经过超滤纯化的亚硒酸化 - 乳球蛋白用不同 浓度的乙醇沉淀离心得到亚硒酸化-乳球蛋白， 将沉淀用乙醇洗涤2-4次， 完全除去无机 硒， 真空冷冻干燥后得到亚硒酸化 - 乳球蛋白产物。 0045 实施例 1 0046 一种亚硒酸化 - 乳球蛋白的制备方法， 步骤如下 ： 0047 取 5g 二。
19、氧化硒溶于 50mL 的水中， 制成亚硒酸溶液。 0048 取10g-乳球蛋白与上述亚硒酸溶液混合， 得到含有亚硒酸的-乳球蛋白液 体。 说 明 书 CN 104479003 A 5 4/4 页 6 0049 上述反应液中的氧化 - 还原物质采用 6的过氧化氢， 将以上反应物放入真空 反应器， 在真空条件下， 40 度搅拌 5h， 完成亚硒酸根的导入。 0050 反应完毕后除去反应液中的离子 ： 用分子量 3000Da-7000Da 的超滤膜将上步分 子量较小的强氧化剂以及未能导入的亚硒酸根过滤除去 ； 0051 向反应液中加入 100mL 乙醇， 离心， 得到产物沉淀， 依次用 20mL 乙。
20、醇洗涤沉淀， 重复三次， 沉淀真空冷冻干燥后得到亚硒酸化 - 乳球蛋白， 产物硒含量为 15.17mg/g。 0052 经过检测 ： 亚硒酸化 - 乳球蛋白的性质为 ： 0053 1、 亚硒酸化 - 乳球蛋白的水溶液呈透明， 无色， 或略带黄色 ； 0054 2、 亚硒酸化 - 乳球蛋白的溶解性 ： 碱溶、 盐溶， 微溶于水， 不溶于乙醇、 丙酮等有 机试剂。 0055 3、 亚硒酸化 - 乳球蛋白经过冷冻干燥后， 呈白色粉末 ； 0056 4、 分子量 ： 20.75KDa ； 0057 5、 硒含量 ： 15.17mg/g。 0058 实施例 2 0059 一种亚硒酸化 - 乳球蛋白的制备。
21、方法， 步骤如下 ： 0060 取 5g 二氧化硒溶于 50mL 的水中， 制成亚硒酸溶液。 0061 取20g-乳球蛋白与上述亚硒酸溶液混合， 得到含有亚硒酸的-乳球蛋白液 体。 0062 上述反应液中的氧化 - 还原物质采用 8的过氧化氢， 将以上反应物放入真空 反应器， 在真空条件下， 45 度搅拌 7h， 完成亚硒酸根的导入。 0063 反应完毕后除去反应液中的离子 ： 用分子量 3000Da-7000Da 的超滤膜将上步分 子量较小的强氧化剂以及未能导入的亚硒酸根过滤除去 ； 0064 向反应液中加入 200mL 乙醇， 离心， 得到产物沉淀， 依次用 40mL 乙醇洗涤沉淀， 重复。
22、四次， 沉淀真空冷冻干燥后得到亚硒酸化 - 乳球蛋白， 产物硒含量为 12.53mg/g。 0065 经过检测 ： 亚硒酸化 - 乳球蛋白的性质为 ： 0066 1、 亚硒酸化 - 乳球蛋白的水溶液呈透明， 无色， 或略带黄色 ； 0067 2、 亚硒酸化 - 乳球蛋白的溶解性 ： 碱溶、 盐溶， 微溶于水， 不溶于乙醇、 丙酮等有 机试剂。 0068 3、 亚硒酸化 - 乳球蛋白经过冷冻干燥后， 呈白色粉末 ； 0069 4、 分子量 ： 41.06KDa ； 0070 5、 硒含量 ： 12.53mg/g。 0071 上述实施例步骤 (4) 使用的超滤膜为的推荐型号和厂家为 1812 型卷。
23、式超滤膜由 上海摩速科学器材有限公司生产。 说 明 书 CN 104479003 A 6 1/6 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104479003 A 7 2/6 页 8 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 104479003 A 8 3/6 页 9 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 104479003 A 9 4/6 页 10 图 7 图 8a 说 明 书 附 图 CN 104479003 A 10 5/6 页 11 图 8b 图 9a 图 9b 说 明 书 附 图 CN 104479003 A 11 6/6 页 12 说 明 书 附 图 CN 104479003 A 12 。