制备异叶地锦提取物的方法及抗骨质疏松药物.pdf

本发明公开了一种制备异叶地锦提取物的方法及抗骨质疏松药物，该方法包括：(1)将异叶地锦原料进行粉碎，以便得到原料粉末；(2)将所述原料粉末进行加醇提取；(3)将步骤(2)得到的产物进行过滤，以便得到提取液；(4)将所述提取液进行第一减压蒸馏，以便得到粗提取物；以及(5)将所述粗提取物进行纯化，以便获得所述异叶地锦提取物。该方法可以有效从天然异叶地锦原料中分离得到异叶地锦提取物，进而可以制备得到安全性高且不具有肝毒性的抗骨质疏松药物，从而为骨质疏松的治疗提供有效途径。

权利要求书
1.  一种制备异叶地锦提取物的方法，其特征在于，包括：
(1)将异叶地锦原料进行粉碎，以便得到原料粉末；
(2)将所述原料粉末进行加醇提取；
(3)将步骤(2)得到的产物进行过滤，以便得到提取液；
(4)将所述提取液进行第一减压蒸馏，以便得到粗提取物；以及
(5)将所述粗提取物进行纯化，以便获得所述异叶地锦提取物。

2.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)进一步包括：
将所述原料粉末用6～8倍重量的75～95体积％的醇进行加热回流提取1～6次，每次2-3小时，并将分别获得的产物进行合并。

3.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述第一减压蒸馏是在40～60摄氏度的温度下进行的。

4.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)进一步包括：
将所述粗提取物加水稀释，以便得到含有提取物的水溶液；
依次采用石油醚、氯仿和乙酸乙酯对所述含有提取物的水溶液进行萃取，以便分别得到石油醚萃取液、氯仿萃取液和乙酸乙酯萃取液；以及
分别将所述石油醚萃取液、所述氯仿萃取液、所述乙酸乙酯萃取液和萃取后剩余的水溶液进行第二减压蒸馏，以便分别得到石油醚相异叶地锦提取物、氯仿相异叶地锦提取物、乙酸乙酯相异叶地锦提取物和水相异叶地锦提取物。

5.  根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第二减压蒸馏是在20～30摄氏度的温度下进行的。

6.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述异叶地锦原料为异叶地锦的茎。

7.  一种抗骨质疏松药物，其特征在于，包括：
异叶地锦提取物，所述异叶地锦提取物是根据权利要求1～6任一项所述的方法制备的。

8.  根据权利要求7所述的药物，其特征在于，进一步包括辅料。

9.  根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述辅料为选自溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂、粘合剂、润滑剂、润湿剂、增稠剂、增溶剂和基质中的至少一种。

10.  根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述药物呈散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、注射剂、吸入剂或凝胶剂。

说明书制备异叶地锦提取物的方法及抗骨质疏松药物
技术领域
本发明属于医学领域，具体而言，本发明涉及一种制备异叶地锦提取物的方法及抗骨质疏松药物。
背景技术
异叶地锦，又称为异叶爬山虎、草叶藤、上树蛇、白花藤子，为葡萄科地锦属的植物。分布广泛，生长于海拔200米至3800米的地区，常生于山崖陡壁、山坡、山谷林中及灌丛岩石缝中。有祛风除湿，通络，止血，解毒作用。现代药理学发现葡萄科地锦属植物含有多种低聚芪类化合物，天然芪类化合物有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗血栓(抑制血小板聚集)、降压、降血脂、保肝、改善学习记忆功能、免疫调节、抗菌等作用。
骨质疏松症(osteoporosis,OP)是以骨量减少、骨的微观结构退化为特征的一种全身性代谢骨病，随着人口老龄化的加深，骨质疏松症在中老年人中的发病率也不断提高，由于其本身没有特殊的临床表现，而且此病在发展中又是个缓慢的渐进过程，因而直到病发，一直被大多数人所忽视。骨质疏松症致残率较高，极大影响着人们的生活质量，给家庭和社会带来沉重的经济负担。随着人口结构老龄化，骨质疏松的问题越来越突出。骨质疏松症是发达国家乃至发展中国家最重要公共健康问题之一，称为无声无息的流行病。
在整个生命周期中，骨质在不停的形成(成骨)和破坏(破骨)，维持着一种动态平衡。现代医学认为骨质疏松症的基本病理机制是在骨代谢过程中骨吸收和骨形成的偶联出现了失衡，导致人体内的钙磷代谢不平衡，骨密度逐渐减少而引发的临床症状。目前临床上对于骨质疏松症的治疗尚无理想的方法。
中国传统医学中虽无骨质疏松的症名，但究其临床表现、发病机制应归属于“骨痹”、“骨痿”的范畴。中医理论认为，骨质疏松症的病因病机主要是肾亏、脾虚和痰疲阻脉。治则为补肾壮骨、健脾益气和活血通络法药对骨质疏松症进行治疗，均取得良好的治疗效果。因此寻找一种安全有效的贫血症治疗药物非常有意义。
然而，目前关于异叶地锦提取物的制备方法及其用途尚无报道。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个 目的在于提出一种具有制备异叶地锦提取物的方法及抗骨质疏松药物，该方法可以有效从天然异叶地锦原料中分离得到异叶地锦提取物。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种制备异叶地锦提取物的方法，包括：
(1)将异叶地锦原料进行粉碎，以便得到原料粉末；
(2)将所述原料粉末进行加醇提取；
(3)将步骤(2)得到的产物进行过滤，以便得到提取液；
(4)将所述提取液进行第一减压蒸馏，以便得到粗提取物；以及
(5)将所述粗提取物进行纯化，以便获得所述异叶地锦提取物。
根据本发明实施例的制备异叶地锦提取物的方法可以有效从天然异叶地锦原料中分离得到异叶地锦提取物，进而可以制备得到安全性高且不具有肝毒性的抗骨质疏松药物，从而为骨质疏松的治疗提供有效途径。
另外，根据本发明上述实施例的制备异叶地锦提取物的方法还可以具有如下附加的技术特征：
在本发明的一些实施例中，步骤(2)进一步包括：将所述原料粉末用6～8倍重量的75～95体积％的醇进行加热回流提取1～6次，每次2-3小时，并将分别获得的产物进行合并。由此，可以显著提高异叶地锦提取物的分离效率。
在本发明的一些实施例中，在步骤(4)中，所述第一减压蒸馏是在40～60摄氏度的温度下进行的。由此，可以进一步提高异叶地锦提取物的分离效率。
在本发明的一些实施例中，步骤(5)进一步包括：将所述粗提取物加水稀释，以便得到含有提取物的水溶液；依次采用石油醚、氯仿和乙酸乙酯对所述含有提取物的水溶液进行萃取，以便分别得到石油醚萃取液、氯仿萃取液和乙酸乙酯萃取液；以及分别将所述石油醚萃取液、所述氯仿萃取液、所述乙酸乙酯萃取液和萃取后剩余的水溶液进行第二减压蒸馏，以便分别得到石油醚相异叶地锦提取物、氯仿相异叶地锦提取物、乙酸乙酯相异叶地锦提取物和水相异叶地锦提取物。由此，可以进一步提高异叶地锦提取物的分离效率。
在本发明的一些实施例中，所述第二减压蒸馏是在20～30摄氏度的温度下进行的。由此，可以进一步提高异叶地锦提取物的分离效率。
在本发明的一些实施例中，所述异叶地锦原料为异叶地锦的茎。
在本发明的第二个方面，本发明提出了一种抗骨质疏松药物，包括：异叶地锦提取物，所述异叶地锦提取物是上述所述的方法制备的。由此，该药物通过使用从天然的中药异叶地锦中提取到的异叶地锦提取物，使得其安全性高，不具有肝毒性，并且可以避免化学合成药物副作用大的缺点，从而为骨质疏松的治疗提供有效途径。
另外，根据本发明上述实施例的抗骨质疏松药物还可以具有如下附加的技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述抗骨质疏松药物进一步包括辅料。
在本发明的一些实施例中，所述辅料为选自溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂、粘合剂、润滑剂、润湿剂、增稠剂、增溶剂和基质中的至少一种。
在本发明的一些实施例中，所述药物呈散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、注射剂、吸入剂或凝胶剂。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1是根据本发明一个实施例的制备异叶地锦提取物的方法流程示意图；
图2是本发明实施例的异叶地锦提取物对骨密度影响谱图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种制备异叶地锦提取物的方法。下面参考图1对本发明实施例的制备异叶地锦提取物的方法进行详细描述。根据本发明的实施例，该方法包括：
S100：将异叶地锦原料进行粉碎
根据本发明的实施例，将异叶地锦原料进行粉碎，从而可以得到原料粉末。根据本发明的实施例，异叶地锦原料并不受特别限制，根据本发明的具体实施例，异叶地锦原料可以为异叶地锦的茎。该步骤中，具体的，首先将异叶地锦的茎烘干后在进行粉碎。
S200：将原料粉末进行加醇提取
根据本发明的实施例，将上述得到的原料粉末加醇提取，从而可以将原料粉末中的异叶地锦提取物溶解于醇中。
该步骤中，具体的，将原料粉末用6～8倍重量的75～95体积％的醇进行加热回流提取1～6次，每次2-3小时，并将分别获得的产物进行合并。发明人发现，该条件下可以较其他条件显著提高异叶地锦提取物的分离效率。需要说明的是，该步骤使用的醇可以为甲醇或 乙醇。
S300：将上述得到产物进行过滤
根据本发明的实施例，将S200得到的产物进行过滤，从而可以得到提取液。由此，可以实现不溶物与提取液的有效分离。
S400：将提取液进行第一减压蒸馏
根据本发明的实施例，将上述得到的提取液进行第一减压蒸馏，从而可以得到粗提取物。具体的，将上述得到的提取液进行蒸馏，直至得到浸膏状粗提取物。
根据本发明的实施例，第一减压蒸馏的条件并不受特别限制，根据本发明的具体实施例，第一减压蒸馏可以在40～60摄氏度的温度下进行。发明人发现，该条件下可以显著提高异叶地锦提取物的分离效率。
S500：将粗提取物进行纯化
根据本发明的实施例，将上述得到的粗提取物进行纯化，从而可以获得异叶地锦提取物。由此，可以显著提高异叶地锦提取物的纯度。
该步骤中，具体的，首先将粗提取物进行加水稀释，得到含有提取物的水溶液；然后依次采用石油醚、氯仿和乙酸乙酯对含有提取物的水溶液进行萃取，分别得到石油醚萃取液、氯仿萃取液和乙酸乙酯萃取液；以及分别将石油醚萃取液、氯仿萃取液、乙酸乙酯萃取液和萃取后剩余的水溶液进行第二减压蒸馏，直至萃取液浓缩至浸膏状，即可分别得到石油醚相异叶地锦提取物、氯仿相异叶地锦提取物、乙酸乙酯相异叶地锦提取物和水相异叶地锦提取物。。由此，可以进一步提高异叶地锦提取物的分离效率。
根据本发明的实施例，第二减压蒸馏的条件并不受特别限制，根据本发明的具体实施例，第二减压蒸馏可以在20～30摄氏度的温度下进行。发明人发现，该条件下可以显著提高异叶地锦提取物的分离效率，从而得到纯度较高的异叶地锦提取物。
根据本发明实施例的制备异叶地锦提取物的方法可以有效从天然异叶地锦原料中分离得到异叶地锦提取物，进而可以制备得到安全性高且不具有肝毒性的抗骨质疏松药物，从而为骨质疏松的治疗提供有效途径。
在本发明的第二个方面，本发明提出了一种抗骨质疏松药物。根据本发明的实施例，该药物包括异叶地锦提取物，根据本发明的具体实施例，该异叶地锦提取物是采用上述制备异叶地锦提取物的方法制备得到的。发明人发现，该药物通过使用从天然的中药异叶地锦中提取到的异叶地锦提取物，使得其安全性高，不具有肝毒性，并且可以避免化学合成药物副作用大的缺点，从而为骨质疏松的治疗提供有效途径。
根据本发明的实施例，抗骨质疏松药物可以进一步包括辅料。根据本发明的具体实施例，辅料可以为选自溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂、粘合剂、润滑剂、润湿剂、 增稠剂、增溶剂和基质中的至少一种。
根据本发明的实施例，药物可以呈散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、注射剂、吸入剂或凝胶剂。由此，可以进一步为骨质疏松的治疗提供有效途径。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
实施例1
将异叶地锦的茎烘干并粉碎成粉末，将所得原料粉末用6～8倍重量的95体积％的甲醇加热回流提取3次，每次2-3小时，并将分别的产物合并，接着将得到的产物进行过滤，得到提取液，然后将提取液在40～60摄氏度下进行减压蒸馏，以便得到浸膏状粗提取物，接着向粗提取物进行加水稀释，得到含有提取物的水溶液，然后依次采用石油醚、氯仿和乙酸乙酯对含有提取物的水溶液进行萃取，分别得到石油醚萃取液、氯仿萃取液和乙酸乙酯萃取液，然后分别将石油醚萃取液、氯仿萃取液、乙酸乙酯萃取液和萃取后剩余的水溶液在20～30摄氏度下进行减压蒸馏，直至萃取液浓缩至浸膏状并真空干燥，即可分别得到石油醚相异叶地锦提取物、氯仿相异叶地锦提取物、乙酸乙酯相异叶地锦提取物和水相异叶地锦提取物。
实施例2
将异叶地锦的茎烘干并粉碎成粉末，将所得原料粉末用6～8倍重量的95％的乙醇加热回流提取4次，每次2-3小时，并将分别的产物合并，接着将得到的产物进行过滤，得到提取液，然后将提取液在40～60摄氏度下进行减压蒸馏，以便得到浸膏状粗提取物，接着向粗提取物进行加水稀释，得到含有提取物的水溶液，然后依次采用石油醚、氯仿和乙酸乙酯对含有提取物的水溶液进行萃取，分别得到石油醚萃取液、氯仿萃取液和乙酸乙酯萃取液，然后分别将石油醚萃取液、氯仿萃取液、乙酸乙酯萃取液和萃取后剩余的水溶液在20～30摄氏度下进行减压蒸馏，直至萃取液浓缩至浸膏状并真空干燥，即可分别得到石油醚相异叶地锦提取物、氯仿相异叶地锦提取物、乙酸乙酯相异叶地锦提取物和水相异叶地锦提取物。
实施例3
将异叶地锦的茎烘干并粉碎成粉末，将所得原料粉末用6～8倍重量的75％的乙醇加热回流提取6次，每次2-3小时，并将分别的产物合并，接着将得到的产物进行过滤，得到提取液，然后将提取液在40～60摄氏度下进行减压蒸馏，以便得到浸膏状粗提取物，接着向粗提取物进行加水稀释，得到含有提取物的水溶液，然后依次采用石油醚、氯仿和乙酸乙酯对含有提取物的水溶液进行萃取，分别得到石油醚萃取液、氯仿萃取液和乙酸乙酯萃 取液，然后分别将石油醚萃取液、氯仿萃取液、乙酸乙酯萃取液和萃取后剩余的水溶液在20～30摄氏度下进行减压蒸馏，直至萃取液浓缩至浸膏状并真空干燥，即可分别得到石油醚相异叶地锦提取物、氯仿相异叶地锦提取物、乙酸乙酯相异叶地锦提取物和水相异叶地锦提取物。
评价：
1、分别对实施例1-3所得粗提取物、石油醚相异叶地锦提取物、氯仿相异叶地锦提取物、乙酸乙酯相异叶地锦提取物和水相异叶地锦提取物对骨细胞增殖影响和体内药效进行评价；
2、评价指标和测试方法：
A、异叶地锦提取物对骨细胞增殖影响
1)实验药品：
分别使用磷酸盐缓冲溶液(PBS)将实施例1-3所得粗提取物、石油醚相异叶地锦提取物、氯仿相异叶地锦提取物、乙酸乙酯相异叶地锦提取物和水相异叶地锦提取物配制成10mg/ml储备液，临用前分别将其稀释成100μg/ml，50μg/ml，25μg/ml；
2)实验步骤：
取原代培养的鼠成骨细胞(OB)以2×104个/mL接种于96孔板，每孔体积90μL，在CO2培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，加入l0μL提取物的PBS溶液，并且使提取物的终浓度分别保持在100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，待培养48h后，每孔加入l0μLMTT溶液(5mg/mL)，继续在培养箱中孵育4h，然后倾去上清液，每孔加入DMSO l00μL，振荡后用酶标仪于570nm处测定各孔吸光度值，同时设定空白组(以同体积的PBS代替提取物)，根据下面公式计算细胞存活率(Cell viability)＝(提取物组OD值/空白组OD值)×100％，实验结果如表1所示。
3)结果：
表1实施例1-3提取物对骨细胞增殖影响对比(n＝8,)


注：与对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。
结论：由表1数据可知，实施例1-3与对照组相比，粗提取物、乙酸乙酯相异叶地锦提取物、水相异叶地锦提取物在三个浓度下对OB细胞都具有明显的促增殖作用。
B、异叶地锦提取物体内药效实验
1)实验方法：
1.1剂量设计与分组：异叶地锦提取物药物按剂量分为高剂量(4g/kg)、中剂量(2g/kg)和低剂量(1g/kg)，另设计模型对照组、阳性对照组及假手术阴性对照组。
1.2大鼠造模
Wistar大鼠用3v％水合氯醛生理盐水溶液麻醉(剂量为10mg/kg)，常规方法切除双侧卵巢。取10只大鼠，分别取出子宫，暴露卵巢，但不切除，再将其放回腹腔，此组作为假手术阴性对照组。所有大鼠术后腹腔注射青霉素(160万单位/瓶青霉素溶至5mL)，0.2mL/d，连续给药7d。
1.3分组与给药
除假手术组外，其余大鼠于术后第7天按体重随机分为模型对照组，阳性对照组，实验组(实验组按药剂量分为高剂量组、中剂量组和低剂量组)，每组10只，实验组的高剂量组、中剂量组和低剂量组分别按照剂量灌胃给药，阳性对照组按2mg/kg剂量给药，假手术阴性对照组及模型对照组分别给予同等剂量的蒸馏水，至第90天处死大鼠。
2)观测指标
2.1骨密度：取股骨中段至下1/3处，采用双能X线骨密度仪测定骨密度。
2.2血清指标：末次给药结束后，腹主动脉采血分离血清，采用自动生化分析仪测定血清ALP含量。
2.3骨组织形态计量学参数：取右侧股骨，按照常规固定，脱钙，切片，HE染色，采用多功能真彩色病理图像分析仪于100倍下，在干骺端生长板下1～4mm近皮质处取视野，进行骨组织形态计量学测定，计算骨小梁个数(trabecular number，TN)、平均骨小梁厚度(mean trabecular plate thickness，MTPT)、骨小梁体积百分比(trabecular bone volume，TBV)及平均骨皮质厚度(mean cortical bone thickness，MCBT)。
3)结果
3.1骨密度测试：结果如图2所示。
结论：由图2可知，与假手术阴性对照组比较，模型对照组骨密度显著降低(P<0.01)，表明去卵巢引起的大鼠骨质疏松造模成功，与模型对照组比较，高剂量组、中剂量组、低剂量组的骨密度显著性升高(P<0.05或P<0.01)，表明异叶地锦提取物能有效防止骨质疏松大鼠的骨密度降低。
3.2血清ALP含量的测定：测试结果如表2所示。
表2异叶地锦提取物对去卵巢骨质疏松大鼠血清ALP含量的影响(n＝8，)

注：##p<0.01与对假手术组比较；**p<0.01与模型组比较
结论：由表2数据可知，与假手术阴性对照组比较，模型对照组中血清ALP含量显著增加(P<0.01)；与模型对照组比较，高剂量组、中剂量组、低剂量组和阳性对照组中血清ALP含量均显著降低，表明异叶地锦提取物可降低血清ALP水平。
3.3骨组织形态计量学测试：测试结果如表3所示。
表3异叶地锦提取物对去卵巢骨质疏松大鼠骨组织形态计量学的影响(n＝8,)

注：##p<0.01与对假手术组比较；*p<0.05与模型组比较；**p<0.01与模型组比较；
结论：由表3可知，模型对照组TN、MTPT、TBV和MCBT与假手术阴性对照组比较均有显著性差异(P<0.01)，表明异叶地锦提取物能够改善骨质疏松症模型大鼠的骨计量学指标，增加骨量，与模型对照组比较，高剂量、中剂量、低剂量和阳性对照组的骨组织形态计量学均有显著性差异，其中TN增加，MTPT增厚，TBV增大，MCBT增大，表明异 叶地锦提取物能增加骨形成参数，减少骨吸收参数，能有效防止骨量丢失。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。