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1、10申请公布号CN102006782A43申请公布日20110406CN102006782ACN102006782A21申请号200980113745622申请日2009041608155067520080424EP61/046,20620080418USA23J1/00200601A23J3/34200601A23K1/00200601A23K1/16200601A23L1/305200601C07K1/30200601C05C11/00200601C05G3/00200601A23J1/10200601A23K1/10200601C05F1/0020060171申请人欧加农股份有限公司地址。
2、荷兰奥斯72发明人TJ海登GM库尔兹74专利代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所11038代理人于巧玲54发明名称蛋白水解物的纯化及得到的产品57摘要本发明涉及酶促消化肝素衍生的蛋白水解物蛋白胨的纯化方法，包括将该蛋白胨在约室温到约130的温度和约常压到约360PSI的压力下通过纳米过滤器得到蛋白胨浓缩物的步骤。30优先权数据85PCT申请进入国家阶段日2010101886PCT申请的申请数据PCT/EP2009/0545672009041687PCT申请的公布数据WO2009/144091EN2009120351INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页。
3、说明书11页附图1页CN102006795A1/1页21一种纯化酶促消化肝素衍生的蛋白水解物蛋白胨的方法，其包括将所述蛋白胨在温度为约室温到约130，压力为约常压到约360PSI下通过纳米过滤器得到蛋白胨浓缩物的步骤。2如权利要求1所述的方法，包括蒸发所述蛋白胨浓缩物到所需水分百分比的后续步骤。3如权利要求1所述的方法，包括如下步骤A酸化所述蛋白胨至PH值为约4到约7，得到包含脂肪和/或絮凝成分的污泥层和水层，B将所述污泥层与所述水层分离，C在温度为约室温到约130，压力为约常压到约360PSI下使所述水层通过纳米过滤器，得到蛋白胨浓缩物1。4如上述权利要求任一项所述的方法，其中所述纳米过滤器。
4、具有允许150300道尔顿截留分子量的孔径。5如上述权利要求任一项所述的方法，其中在后续步骤中，从所述纳米过滤步骤中回收渗透物并且使其再次通过纳米过滤器，得到蛋白胨浓缩物2。6如权利要求5所述的方法，其中所述纳米过滤器具有允许小于150道尔顿截留分子量的孔径。7如上述权利要求任一项所述的方法，其中在蛋白胨浓缩物，例如蛋白胨浓缩物1中加入软水，得到的组合物再次通过纳米过滤器，得到蛋白胨浓缩物4。8如权利要求5或6所述的方法，其中蛋白胨浓缩物，例如蛋白胨浓缩物1，与蛋白胨浓缩物2结合得到蛋白胨浓缩物3，在蛋白胨浓缩物3中加入软水并且得到的组合物再次通过纳米过滤器，得到蛋白胨浓缩物4。9由上述任一项。
5、权利要求的方法制得的纯化的酶促消化肝素衍生的蛋白水解物，其含有蛋白胨浓缩物。10如权利要求9所述的纯化的蛋白水解物，其另外包含脂肪和/或絮凝成分。11纯化的酶促消化肝素衍生的蛋白水解物，包含1小于12,000PPM的硫2小于21,000PPM的钠3大于120,000PPM的氨基酸480或更少的水分具有的硫与总氮比率为05或更小且钠与总氮比率为10或更小。12如权利要求11所述的纯化的蛋白水解物，其中所述硫与总氮比率小于04。13如权利要求11所述的纯化的蛋白水解物，其中所述钠与总氮比率少于09。14如权利要求11所述的纯化的蛋白水解物，其另外包含脂肪和/或絮凝成分。15权利要求9到14任一项所。
6、述的纯化的蛋白水解物用作食品或肥料的用途。16如权利要求15所述的用途，其作为动物饲料添加剂/补充剂，动物饲料，肥料或者肥料浓缩物。17包含权利要求9到14任一项所述的纯化的蛋白水解物的食品。18包含权利要求9到14任一项所述的纯化的蛋白水解物的肥料产品。权利要求书CN102006782ACN102006795A1/11页3蛋白水解物的纯化及得到的产品技术领域0001本发明涉及纯化蛋白水解物蛋白胨的方法。本发明还涉及所获得的纯化的蛋白水解物蛋白胨浓缩物及其在食品和肥料中的应用。背景技术0002蛋白水解物含有包括氨基酸和来源于各种动物和植物蛋白水解产生的短链肽的混合物。例如，蛋白水解物是来自从猪。
7、碎内脏或者肠粘膜的提取物血抗凝剂肝素的通常副产品。0003由于经济和环境的原因，生产使用现在形成的因屠宰动物，例如家畜，而产生的废物百分比正在不断增加。家畜废物或者其他副产品主要用途是生产血抗凝剂肝素。小肠原料在屠宰场被收集并且通过在防腐剂典型的为焦亚硫酸钠或液体亚硫酸氢钠中搅拌保存。亚硫酸氢钠是保存含有肝素原料的工业标准，虽然其他防腐剂，例如磷酸，乳酸或者各种各样的过氧化物已经被测试并且发现至少在某种程度上有效，纵然是成本高昂。肝素生产包括增加原料的PH值至碱性，加入蛋白水解酶以消化原料，必要时，通过加入酸或者碱分离溶液的脂肪成分，并使用离子交换树脂从得到的水溶液去除肝素。在离子交换树脂吸附。
8、肝素之后，然后通过筛网过滤收集，剩下的水解产物水溶液本领域中也被称作蛋白胨过去被用作肥料或者饲料添加剂。0004来自蛋白水解物的纯化蛋白产品可能有许多潜在用途，例如化妆品添加剂，食品和饮料的营养成分，起泡剂，阻塞苦味的药物化合物添加剂，氨基酸来源，婴儿配方奶的添加剂和替代品，以及用于经口服、体内、非肠道或静脉地服用的人造营养素。0005本发明特别感兴趣的是纯化的蛋白水解物作为家畜饲料成分的使用。纯化的蛋白水解物的营养用途还包括作为用于小牛、仔猪和其它断奶期哺乳动物的牛奶替代物的专业饲料，动物饲料的蛋白质增补剂，氨基酸补充剂，和人类食品和宠物食物的风味剂或蛋白质增强剂。0006使用这些材料用作饲。
9、料添加剂时的典型问题是防腐剂的存在，其由于在利用蒸发的干燥操作中从胨中除去水分因而是浓缩的。例如，水分含量从约82正如在很多市售的作为肝素生产副产品的蛋白水解物中发现的那样降低到55或者更低的含水量，亚硫酸钠含量也被浓缩。例如，亚硫酸盐在18固体重量的液体蛋白水解物中的通常含量为25到35。然而，同样18固体重量蛋白水解物通过水分蒸发被浓缩至55的含水量时，浓缩产品中的亚硫酸盐浓度增加到625到875。这一亚硫酸盐水平被发现被很多终端产品用户不欢迎以及更多用户完全不接受。例如，用于宠物食物市场时，高水平亚硫酸盐的存在，当作为潜在营养素源的蛋白水解物变得不适口。此外，美国饲料管理协会AAFCO在。
10、官方出版物的第196197页限制了亚硫酸盐在肉和维生素BI源中的使用。而且，这些处理需要相当数量的能量。已经有通过化合物处理并沉淀防腐性盐来去除防腐剂的尝试，但是这些方法效率低，因此成本高昂US5,607,840和US6,051,687。0007降低盐水平的一种方法是在US6,051,687中披露过的膜过滤。一种原料是由肝说明书CN102006782ACN102006795A2/11页4素提取获得的18固体重量的液体蛋白水解物和另一种是由18固体重量的液体蛋白水解物制得的低脂肪原料。由于考虑到脂肪成分会于扰膜过滤的关系，使用低脂肪原料。然而，被指出两种原料之间几乎没有差别。研究显示，该想法能起。
11、作用，尽管有一些缺点，例如10的粗蛋白损失，其可能通过使用不同类型的膜得到解决。不过，没有更进一步测试报导。0008尽管对从来源于动物组织中肝素提取产生的蛋白水解物副产品替代应用的兴趣不断增强，但如何用有效的方式降低蛋白水解物中的盐浓度在过去一直不了解。本发明提供蛋白水解物的纯化方法。当该水解物被浓缩时，得到盐浓度显著降低的蛋白产品。此外，如何从这一蛋白水解物中除去亚硫酸盐或者硫酸盐还不了解，因此当该水解产物用有效方法浓缩时，使得亚硫酸盐和硫酸盐浓度的显著降低。0009发明概述0010本发明涉及纯化的酶促消化肝素衍生的蛋白水解物蛋白胨的方法，包括将该蛋白胨在约室温到约130的温度和约常压到约3。
12、60PSI的压力下通过纳米过滤器得到蛋白胨浓缩物的步骤。0011可以通过纳米过滤蛋白胨同时去除水分和一大部分防腐性盐，解决了采用节能的方法去除蛋白胨中水分时防腐剂浓缩的问题。与之前测试的其他方法相反，使用纳米过滤大部分防腐剂被清除，而蛋白胨的营养质量被高水平的保持。此外，它允许工厂在整个生产过程期间保持稳定的产品。0012一旦防腐剂被清除，被浓缩蛋白胨可以用于进一步浓缩，用水稀释并再次浓缩，或者与之前从蛋白胨中分离出的级分结合。一旦取得期望的终产品，即，纯化的酶促消化肝素衍生的蛋白水解物，其能被用作家畜饲料或者饲料添加剂/补充剂，宠物食品添加剂/补充剂，作为人或者动物添加剂/补充剂，或者肥料或。
13、肥料浓缩物。在这方面废物产生将被最小化。0013附图0014图1表示根据本发明的肝素提取工艺中从猪小肠纯化蛋白水解物的一个实施方式流程图。0015详细说明0016本方法包括将蛋白胨在约室温到约130的温度和约常压到约360PSI的压力下通过纳米过滤器得到蛋白胨浓缩物的步骤。0017该蛋白胨可以是源自从猪碎内脏或肠粘膜中提取肝素的市售的液体蛋白水解物副产品。该方法还能在进行肝素提取的工厂内实施。尤其，从肝素提取工艺中消化的猪小肠原料开始，肝素通过用离子交换树脂从溶液中提取。离子交换树脂从蛋白胨中筛分出来，收集蛋白胨以进一步处理。该蛋白胨基本上不含肝素。0018蛋白胨能过通过初步纳米过滤去处一部分。
14、防腐剂和水。该蛋白胨浓缩物随后通过蒸发达到期望的水分含量。用纳米过滤去除一部分防腐剂和水分比单独蒸发更经济。然而，在一定的水分含量下，纳米过滤器开始堵塞并且降低效率使得蒸发对终浓缩来说更有效和必要。0019本发明方法的一个可选择的实施方式，包括下述步骤0020A将蛋白胨酸化至PH值为约4到约7得到包含脂肪和/或絮凝成分的污泥层和说明书CN102006782ACN102006795A3/11页5水层，0021B分离所述污泥层和所述水层，0022C将所述水层在约室温到约130的温度和约常压到约360PSI的压力下通过纳米过滤器得到蛋白胨浓缩物1。0023将蛋白胨酸化至PH值为约4到约7得到包含脂肪。
15、和/或絮凝成分的污泥层和水层。酸化对本领域技术人员众所周知。可以使用无机酸。无机酸的例子包括盐酸，磷酸，硫酸或者硝酸。优选盐酸。0024污泥层与水层的分离，优选通过滗析。0025包含蛋白胨的污泥或水层清澈的蛋白胨级分在相对低温的从约室温到大约15020到65的范围内，优选约90到约13030到55，在约常压到约360PSI1到25BAR之间，优选约100到约300PSI7到20BAR，但是通常在约250到280PSI17到19BAR的不同压力下通过纳米过滤膜，得到蛋白胨浓缩物。0026用于本发明的纳米过滤膜可以选自聚合膜和无机膜。这些纳米过滤膜的孔径尺寸允许150300道尔顿的截留分子量。00。
16、27本发明使用的典型的聚合纳米过滤膜包括，例如，聚醚砜膜，磺化聚醚砜膜，聚酯膜，聚砜膜，芳香族聚酰胺膜，聚乙烯醇膜和聚哌嗪膜及其组合。乙酸纤维膜也可以用于作本发明的纳米过滤膜。0028例如，典型的无机膜包括ZRO2和AL2O3膜。0029优选的纳米过滤膜选自磺化的聚砜膜和聚哌嗪膜。例如，有用的膜是由GEOSMONICS/GENERALELECTRICCOWATER技术生产的DESALD系列，如在DL系列内的型号，如DL4040和DL2540。在本发明中有用的纳米过滤膜可能有负电荷或正电荷。该膜可以是离子膜，即它们可以包含阳离子或者阴离子基团，但是甚至中性膜也有用。该纳米过滤膜可以选自疏水膜和亲。
17、水膜。0030纳米过滤膜的一种典型类型是平板式。膜结构也可以选自，例如，管状，螺旋卷式膜和中空纤维。“高剪切力”膜，例如振动膜和旋转膜也能使用。0031在纳米过滤步骤之前，纳米过滤膜可以进行使用清洗剂清洗的预处理，通常使用酸性洗涤剂。碱性洗涤剂或者乙醇也能使用。0032源自本发明方法的渗透物将包含水和各种各样的盐，以及一部分防腐剂盐，例如亚硫酸氢钠加上一些氨基酸。0033在一个本发明的可选择实施方式中，通过本发明的方法得到的蛋白胨浓缩物1再循环反复通过纳米过滤器直到达到期望的浓度或者直到渗透物流动停止，通常在等于或低于约7075的水分含量。0034在一个优选实施方式中，渗透物通过另一个如前述的。
18、第一纳米过滤步骤使用的同样的纳米过滤器，得到蛋白胨浓缩物2。可选地，使用具有允许150道尔顿截留分子量孔径的膜，例如，具有精细膜孔径的GEOSMONICS型号DK系列，以用来浓缩已转移到最初渗透物中的氨基酸。来自渗透物蛋白胨浓缩物2中的浓缩氨基酸可以与初浓缩物蛋白胨浓缩物1混合以得到蛋白胨浓缩物3。0035在另一实施方式中，可以对蛋白胨浓缩物1或3加入软水漂洗并且可以重新纳米过滤，以更进一步去除各种矿物质得到蛋白胨浓缩物4。说明书CN102006782ACN102006795A4/11页60036任选地，根据用于肝素提取工艺的原材料的脂肪含量，可以去除脂肪。在PH值为约6到约9，温度在约130。
19、到160下去除脂肪。脂肪成分趋于絮凝并快速漂浮至顶部。脂肪成分可以通过多种方法去除，包括通过离心、滗析、或者过滤。分离的最佳PH值根据所采用的方法而变化。肝素可以在脂肪分离之前或之后用离子交换树脂提取。0037任选地，单独的或者氨基酸组能从蛋白质水解物分离并且使用各种公知技术分离开，例如但不限于沉淀、离子交换、化学催化反应或者进一步过滤。0038浓缩蛋白胨1、3或者4通常有约55的PH值，并且由于它的PH值和较低的水分含量/活度可以被无限期储存。可以在浓缩和/或将该级分与其它原料例如在纳米过滤之前被任选去除的污泥组合之前、过程中或之后调整PH值。一个优选实施方式是纯化的蛋白水解物包括原始浓缩物。
20、蛋白胨浓缩物1，由原始渗透物纳米过滤得到的浓缩级分蛋白胨浓缩物2，以及脂肪和/或絮凝成分。该脂肪和/或絮凝成分可以从污泥层或者脂肪去除步骤中获得。纯化的蛋白水解物也可以是蛋白胨浓缩物3或4，任选地与蛋白胨浓缩物2相结合，任选地与脂肪和/或絮凝成分相结合。0039本发明所述的产品是纯化的酶促消化肝素衍生的蛋白水解物，包含00401小于12,000PPM的硫00412小于21,000PPM的钠00423大于120,000PPM的氨基酸0043480的水分或更少0044具有的硫与总氮比率为05或更小且钠与总氮比率为10或更小。0045优选地，纯化的蛋白水解物的硫与总氮比率小于04。可选地，钠与总氮比。
21、率可以小于09，优选小于08，更优选小于07，最优选小于06。0046更优选地，纯化的蛋白水解物包含脂肪和/或絮凝成分。0047下面的实施例涉及示范如何达到上述实施方式而进行的实验。它们不是用来以任何方式限制本发明。之前或以下引用的专利、期刊文章或其他出版物的所有参考文献，都据此明确地以它们的全部纳入参考。0048进一步，可理解本领域技术人员已知细小的修改，其也被理解为包括在本发明所描述和要求保护的范围之内。0049实施例1和对比实施例A0050从肝素提取工艺采集一批蛋白胨。酸化该蛋白胨并从中去除污泥得到水性初始原料。该水性初始原料在标称PH55，100120的温度，以及270PSI的标称压力。
22、下通过纳米过滤器，即，GEOSMONICS型号为DL4040的膜。0051结果见表1膜过滤操作。0052为了比较起见，如膜过滤操作那样分离出一批蛋白胨。蒸发水层以观察时钠和硫相对浓度的影响。在其浓度为213时，该溶液变得非常粘稠，蒸发操作停止。0053结果同样列于表1蒸发操作。0054表10055说明书CN102006782ACN102006795A5/11页70056表1续0057说明书CN102006782ACN102006795A6/11页80058结果评价0059在纳米过滤前当比较本发明制备的浓缩物和水性初始原料时，我们发现如下0060体积减少400X说明书CN102006782ACN。
23、102006795A7/11页90061总氮量增加174X0062硫浓度增加143X0063在钠浓度减少087X0064大多数氨基酸浓度增加约152X0065如果浓缩物中仍保留亚硫酸氢钠防腐剂，钠和硫的浓度预期增加为400X。0066来自纳米过滤步骤的渗透物有非常强的亚硫酸氢钠防腐剂气味，这一点也得到了表1中渗透物中的高钠浓度和硫浓度的支持。0067结果从蛋白水解物中去除亚硫酸氢钠使得其成为更加可口的饲料添加剂。考虑到大量亚硫酸氢钠的去除以及能捕获已转移至渗透物中大量氨基酸的渗透物的第二纳米过滤步骤的潜在机制，部分氨基酸会转移到初始渗透物是可接受的。此外，本发明的浓缩物具有相对较低的粘度也使得。
24、其比蒸发材料易于处理。0068最后，可理解用软水漂洗加入到浓缩可以重新进行纳米过滤，能够进一步去除各种矿物质，其可以使硫与总氮比率小于04，且钠与总氮比率小于09。0069在该浓缩物中加入纳米过滤之前去除的污泥，能够提供含有脂肪/絮凝成分的纯化的蛋白水解物。0070作为比较实施例的蒸发操作，在213的浓度时得到非常粘稠的溶液。对该材料进行测试，将结果转化为理论结果，该理论结果是如果我们能继续蒸发直至400的水平所能看到的。从表1的结果中可以看出，蒸发材料中的钠和硫的浓度水平得以维持并且在蒸发过程中没有丢失。0071实施例20072酸化另一批源自肝素提取工艺的蛋白胨MW2以从中去除污泥MW4。该。
25、水性起始原料MW5通过纳米过滤器，即DL2540，得到蛋白胨浓缩物1MW7。从中得到的渗透物再次通过同一纳米过滤器得到浓缩物2MW10。两种蛋白胨浓缩物1和2MW7MW10和之前去除的污泥MW4加在一起得到含脂肪/絮凝成分MW14的纯化的蛋白水解物蛋白胨浓缩物3。0073结果见表20074MW7和MW14是依据本发明的纯化的蛋白水解物。0075表20076MW2MW4MW5MW7MW10MW14参数单位铵态氮PPM8006008006008001100有机氮PPM165001700015400239001640021000总氮PPM173001760016200245001720022100磷。
26、P2O5PPM370075002700420034005500说明书CN102006782ACN102006795A8/11页10钾K2OPPM270022002300190023002100硫PPM1080074008900880097008300钙PPM200600100200100300镁PPM200300100200200200钠PPM186001480015400135001610020300铜PPM291406铁PPM318617631885锰PPM271324锌PPM19181347635PHNA845361765672水分811485846797838668固体18951515。
27、4203162332氨基酸丙氨酸064051046097046088ARGANINE精氨酸045061067195114118天冬氨酸069062076143084079半胱氨酸020020046038027034谷氨酸119095115206131158甘氨酸086059079142051114组氨酸022048021039032026异亮氨酸039052026032038063亮氨酸077102059060047099总赖氨酸063083059102091091蛋氨酸013022013015016015苯丙氨酸028071032032019059说明书CN102006782ACN10200。
28、6795A9/11页11脯氨酸052052058093041065丝氨酸037037041049036040苏氨酸038033043054042059色氨酸012018013011ND013酪氨酸03056023029034052缬氨酸057078048058065035ND未检出SN比率062042055036056038NAN比率108084095055094092氨基酸PPM87100100000865001395009140012080000770078实施例3和40079两种蛋白胨样品未酸化和没有物理分离被纳米过滤以去除一部分的防腐剂和水。0080结果见表30081表30082实施例。
29、3的初始原料实施例3实施例4的初始原料实施例4参数单位铵态氮PPM2100130018001900有机氮PPM930023700910021500总氮PPM11400250001090023400磷P2O5PPM320011100350011000钾K2OPPM2100400024004200硫PPM10800182001170019400钙PPM200500200600镁PPM100400100400说明书CN102006782ACN102006795A10/11页12钠PPM17300335002000036000铜PPM2525铁PPM18591962锰PPM2413锌PPM124314。
30、45PHNA8083788水分85366859654固体14734141346氨基酸丙氨酸051088058088ARGANINE精氨酸018109015075天冬氨酸019145034144半胱氨酸009027008031谷氨酸087216096228甘氨酸049095057104组氨酸016037028033异亮氨酸028063029049亮氨酸05105057086总赖氨酸051138059126蛋氨酸016033017024苯丙氨酸027051031046脯氨酸04095047092丝氨酸00903501032苏氨酸029064028054色氨酸007034008017说明书CN102006782ACN102006795A11/11页13酪氨酸010052015039缬氨酸037076043060ND未检出SN比率095073107083NAN比率152134183154氨基酸PPM553001463006400013280000830084该结果与实施例1的发现一致。0085此外，令人惊讶的是存在污泥时纳米过滤依然具有良好的效果，并且不会堵塞过滤器。说明书CN102006782ACN102006795A1/1页14图1说明书附图CN102006782A。