摘出器官的保存、复苏和移植方法.pdf

本发明涉及摘出器官的保存、复苏和移植方法。摘出哺乳动物的器官，用灌流液将摘出的器官灌流脱血，将灌流脱血的器官在温度4-10℃、绝对压力5000-8000hPa的条件下，保存在含有二氧化碳、氧气和惰性气体的混合气体中。通过该摘出器官的保存方法，可以不将心脏、肾脏、角膜等的细胞、组织、摘出器官进行脱水干燥等复杂的操作，长期保存这些器官。

1、  摘出器官的保存方法，其特征在于，摘出哺乳动物的器官，用灌流液将摘出的器官灌流脱血，将灌流脱血的器官在温度4-10℃、相对湿度80-92％、绝对压力5000-8000hPa的条件下，在含有二氧化碳、氧气和惰性气体的混合气体的存在下保存。

2、  权利要求1所述的摘出器官的保存方法，混合气体的分压是二氧化碳50-400hPa、氧气400-2000hPa和惰性气体2600-6000hPa。

3、  权利要求1或2所述的摘出器官的保存方法，惰性气体是氦气或氩气。

4、  权利要求1或2所述的摘出器官的保存方法，哺乳动物的器官是心脏。

5、  权利要求1所述的摘出器官的保存方法，灌流液是用按照分压比计氧气为95-50％和二氧化碳为5-50％的混合气体曝气的克雷布斯-汉斯莱特溶液。

6、  权利要求5所述的摘出器官的保存方法，使用葡萄糖量是20-50mM的克雷布斯-汉斯莱特溶液。

7、  通过权利要求1至6中任一项所述的方法保存的摘出器官。

8、  器官复苏方法，其特征在于，通过将权利要求7所述的摘出器官移植到相同、同种或异种的哺乳动物中，实施摘出器官的复苏。

9、  器官移植方法，其特征在于，将权利要求7所述的摘出器官移植到相同、同种或异种的哺乳动物中。

10、  权利要求9所述的器官移植方法，移植是异位心脏移植。

摘出器官的保存、复苏和移植方法
技术领域
本发明涉及哺乳动物的摘出器官的保存、复苏和移植方法。更详细的，涉及摘出哺乳动物的器官，在固定期限保存后，将其移植复苏的方法。
背景技术
心脏、肾脏、肝脏等一旦出现机能衰竭，即使实施药物治疗、手术治疗、人工透析治疗，如果症状加重，则这些处治都不能解决。因此，即使移植他人的器官，实施所谓的临床移植治疗，由于器官提供者(供体)不足，对于器官接受者(受体)不能充分供给器官。此外，由于器官移植手术后免疫调节缺乏发病，移植的器官的质量、亲和性成为重要的课题。
在现在实施的器官移植手术中使用人的移植器官的情况下，从供体中摘出到移植到受体的最大期限，例如对于心脏4小时是期限。如果可以延长它们的保存期限，由于储存摘出器官成为可能，可以期待贡献给更多的受体。
传统的动物器官的保存方法是在低温保存下保存极限为4-24小时(J.Thorac.Cardiovasc.Surg.107，460-471，1994)，使用威斯康星大学溶液(University of Winsconsin Solution)(UW溶液)的情况下，6-18小时是极限(Transplant Proc.21，1350，1989；Ann.Thorac.Surg.49，932，1990)，或使用UW溶液、全氟化碳溶液和氧的情况下，成功移植的是最长48小时，使用该保存器官的异位心脏移植后的生存期限是6周(Transplantation，59，699-701，1995)。
另一方面，在JP-A-2000-72601号公报中，记载了将浸泡在海藻糖溶液中的摘出器官用硅胶、分子筛等脱水剂脱水处理，浸泡在全氟化碳中，通过冷藏保存可以保存10-20天。此外，在WO2002/069702中，记载了通过用混合气体曝气的克雷布斯-汉斯莱特(Krebs-Henseleit，KH)溶液在摘出器官中灌流来脱血，将混合气体(氧气95％-二氧化碳5％)送入脱血的器官中脱水，直到水分除去率达到25-60％后，浸泡在全氟化碳溶液中，然后，使规定期限冰箱保存的器官复苏的方法，该方法中复苏了保存24小时的器官。
但是，在这些方法中，一旦器官的水分丧失到一定程度以上，例如对于心脏丧失30％以上时，就存在复苏率非常低下的问题，而且需要操作上也很复杂的高度技术。
发明内容
本发明的目的是提供不将心脏、肾脏、角膜等摘出器官进行脱水、干燥的复杂操作，使这些器官能够长期保存，能够移植该保存器官、使其复苏的摘出器官的保存方法。
本发明的目的是通过摘出哺乳动物的器官，用灌流液将摘出器官灌流脱血，将灌流脱血的器官在温度4-10℃，相对湿度80-92％，绝对压力5000-8000hPa的条件下，在含有二氧化碳、氧气和惰性气体的混合气体的存在下保存来实现的。
通过本发明涉及的器官保存方法，例如心脏即使在72-96小时的保存后，进行异位心脏移植的情况下，也获得了能够记录到心搏的优秀成果。
因此，由于将被保存的摘出器官移植到受体中，本发明方法可认为是开创性的方法。此外，本发明方法除了心脏以外，还可以适用于肾脏、肝脏、胰腺、肺等各种器官。
附图说明
图1颈部异位心脏移植的循环动态示意图。
具体实施方式
从哺乳动物中摘出器官的方法，可以通过一般的外科手术进行。
用于将摘出器官灌流脱血而使用的灌流液，为用混合气体曝气的克雷布斯-汉斯莱特溶液(KH溶液)，混合气体是氧气和二氧化碳的混合气体，优选的是使用氧气85-95∶二氧化碳5-15的分压比的气体。灌流液冷却到器官的保存温度4-10℃，优选的4-6℃，为了防止腐蚀，添加抗生素等防腐效果的药剂是优选的。灌流是在摘出器官的主动脉中插入导管，安装兰根道尔夫(Langendorff)式灌流装置，通过灌流5-10分钟，优选10分钟的灌流液，进行脱血。
此外，作为灌流液使用的KH溶液，优选其葡萄糖量变更成一般的10mM的2-5倍量即20-50mM，再优选的是3-4倍量即30-40mM而使用。由此维持器官的功能或在器官移植时排斥反应的抑制效果得以优化。此外，以防止血液凝固为目的，在灌流液中添加华法林是优选的。
灌流脱血或洗净的器官，在温度4-10℃，优选2-4℃，相对湿度50-92％、优选80-90％，绝对压力5000-8000hPa，优选6000-8000hPa的条件下，在含有二氧化碳、氧气和惰性气体的混合气体的存在下保存。保存在该压力下的器官，由于氧气或二氧化碳溶解在器官中，细胞内被结构化，获得了器官能够被保存复苏移植的效果。其中对于使用的惰性气体，可例举氦气、氩气等，对于混合气体，可以使用各自分压为二氧化碳50-400hPa，优选50-100hPa，氧气400-2000hPa，优选1000-2000hPa，惰性气体2600-7000hPa，优选2900-6000hPa的气体。其中，如果在比上述绝对压力低的压力下进行器官的保存，保存可能时间的期限就变为24小时以下，另一方面，如果在比它高的压力下进行保存，由于存在患低压症的原因，因此是不优选的。
被保存的器官在生理盐水中浸泡1至10分钟左右，复苏后，移植到相同、同种或异种的哺乳动物中。
关于摘出器官的存活的验证，有电生理学的方法、组织解剖学的方法、实际移植进行验证的移植方法等，例如对于心脏的情况，通过使用心电图的电生理学的方法，或通过由异位心脏移植所导致的受体大鼠的存活天数等可以确认保存期限是否合适，对于肾脏的情况下，将保存的器官移植到动物，通过测定被移植的动物的尿蛋白量，可以确认保存期限合适与否。
可以使用本发明的方法的器官，除了心脏以外还可例举肾脏、肝脏、胰腺、肺等。
实施例
以下记载了本发明的实施例，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
使用符合美国NIH的实验动物标准的、人工繁殖的雌性6周龄大鼠LEW/SsN slc(体重224g)。大鼠腹腔内施用乙醚麻醉药0.3ml，其后开胸摘出大鼠的心脏。向摘出心脏(重量1.349g)的主动脉中用肝素钠的生理盐水脱血(冲洗)后，从主动脉插入导管，通过灌流5分钟，注入在4℃的KH溶液(葡萄糖变为40mM)中添加头孢他啶0.05％、米诺环素0.05％和华法林0.5mg/500ml形成的液体作为保存液，所述KH溶液通过含有氧气85％(850hPa)和二氧化碳15％(150hPa)的混合气体曝气而形成。灌流后，将含有二氧化碳100hPa、氧气1900hPa、氦气4000hPa的混合气体导入心脏，放入相对湿度90％的高压箱中，收藏在4℃冰箱中，保存72小时。
保存时间结束后，将取出的器官(重量1.320g)在生理盐水中浸泡1分钟后，将摘出保存的心脏在受体大鼠的右侧颈部，按颈总动脉与主动脉、颈外动脉与肺动脉分别端对端的吻合的方式，实施异位心脏移植(参见图1)，再灌流开始后，用心电图记录受体大鼠的供体心脏的搏动。该结果，在心耳心房处确认了强的、波动的搏动。此外，心电图是在供体心脏的左心室和主动脉开孔处安装心电图记录用电极，通过双曲诱导使用活体放大器(NEC三荣生产的Bioview-E)连续记录的。
实施例2
在实施例1中，对体重213g的大鼠同样地进行心脏的摘出、保存和移植，在再灌流开始后确定心搏时，在心耳和心房处确定了弱的搏动。其中，摘出后的心脏重量是1.335g，保存结束后的心脏重量是1.284g。
实施例3
在实施例1中，混合气体使用二氧化碳50hPa、氧气950hPa、氦气6000hPa，对体重251g的大鼠同样地进行心脏的摘出、保存和移植，在再灌流开始后确认心搏时，在心耳和心房处确认了微弱的全搏动，即使在其后1小时也确认了尽管微弱但仍在继续搏动。其中，摘出后的心脏重量是1.323g，保存结束后的心脏重量是1.358g。
实施例4
在实施例1中，混合气体使用二氧化碳50hPa、氧气1950hPa、氦气5000hPa，对体重183g的大鼠同样地进行心脏的摘出、保存和移植，在再灌流开始后，确认心搏时，在心房的一部分确认了微弱的搏动，在其后9分钟时确定了微弱的全搏动，再在其后6分钟时确定了弱的全搏动。其中，摘出后的心脏重量是1.229g，保存结束后的心脏重量是1.074g。
实施例5
在实施例1中，混合气体使用二氧化碳100hPa、氧气900hPa、氦气6000hPa，对于体重185g的大鼠同样地进行心脏的摘出、保存和移植，在再灌流开始后，确认心搏时，确认了弱的全搏动。其中，摘出后的心脏重量是1.364g，保存结束后的心脏重量是1.070g。
实施例6
在实施例1中，混合气体使用二氧化碳100hPa、氧气900hPa、氩气6000hPa，且保存时间变更为96小时，对体重250g的大鼠同样地进行心脏的摘出、保存和移植，在再灌流开始后，确认心搏时，确认了心耳的微弱的搏动。其中，摘出后的心脏重量是1.366g，保存结束后的心脏重量是1.233g。
比较例
在实施例1中，将灌流后的心脏浸泡在绝对压力1000hPa的全氟化碳溶液(住友3M制品フロリナ一トFC77；C₈F₁₈)中，在含有氮气80％和氧气20％的标准空气中间歇曝气的状态，收藏在4℃的冰箱中，保存72小时，保存72小时后的供体心脏的搏动，在实施的5例中全部未能确认。
产业实用性
本发明涉及器官的保存方法是不将心脏、肾脏、角膜等的细胞、组织、摘出器官进行脱水、干燥的复杂操作，使保存后的器官能够长期的保存，所述器官是可实现功能的状态的摘出器官，使用本发明的保存方法保存的摘出器官，可以移植到相同、同种或异种的哺乳动物中，在器官移植医疗中非常有用。