乳酸乳球菌在治疗肠道肿瘤中的一种应用方法.pdf

本发明属生物医药技术领域，具体涉及乳酸乳球菌在治疗肠道肿瘤中的一种应用方法。主要用于治疗肠道肿瘤；本实验证明了乳酸乳球菌能够有效减轻或改善肠道菌群的失调，控制肠道内环境的正常，对肠内环境具有保护作用，在治疗肠道疾病中，特别是在肠道肿瘤的治疗中具有较好的效果。

权利要求书
1.  乳酸乳球菌在治疗肠道肿瘤中的一种应用方法。

2.  根据权利要求1所述的乳酸乳球菌在治疗肠道肿瘤中的一种应用方法。其特征在于：乳酸乳球菌在治疗肠道肿瘤中能够有效减轻或改善肠道菌群的失调，控制肠道内环境的正常，对肠内环境具有保护作用，在治疗肠道疾病中，特别是在肠道肿瘤的治疗中具有较好的效果。治疗方法为口服咀嚼乳酸菌素片，4.8克/次，每天三次。

说明书乳酸乳球菌在治疗肠道肿瘤中的一种应用方法
技术领域
本发明公开了乳酸乳球菌在治疗肠道肿瘤中的一种应用方法，属于生物医药领域。
背景技术
乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)是一类长期应用于食品发酵业的有益微生物，这种食品级微生物能 经受胃肠液考验并在人体内存活2～3天，其本身不攻击肠黏膜并且不引起强的免疫反应，其中最有前景 的应用即是乳酸乳球菌作为活载体将治疗性蛋白或抗原传递至黏膜表面，继而同时诱导黏膜免疫和系统免 疫。乳酸乳球菌以其生长迅速、易于操作等优点成为表达外源蛋白、作为活载体疫苗传递抗原的理想选择。 乳酸乳球菌不属于人和动物的正常微生物群，不会定植于口腔或胃肠道，在一定程度上避免了因为长期刺 激形成的免疫耐受。
肠道作为一个免疫器官，起着阻隔细菌和内毒素的屏障作用。正常情况下，胃肠道中绝大多数细菌是 对人体有益的，我们称之为“益生菌”，可帮我们消化乳糖、降解并排泄多余胆固醇；为我们的机体提供 多种维生素；刺激我们的免疫器官发育，并促使其功能不断地演进、完善，有益人体健康。益生菌与我们 的胃肠道粘膜共同筑成了一道生态屏障，抵御和抗击各种外来的病原微生物，但在某些特定的情况下，如 严重疾病、营养不良、过度疲劳或外来刺激时，机体的抵抗力会下降，一些原本无害的细菌可能会乘虚而 入，对机体造成伤害，引起肠粘膜屏障功能下降。乳酸乳球菌是位于胃肠道中的益生菌，因此非常适合治 疗肠道疾病如肠道肿瘤等疾病。乳酸乳球菌能够诱导表达白细胞介素-12(interleukin 12,IL-12)，IL-12 主要由B细胞、T细胞、单核巨噬细胞产生的一种具有多种功能的细胞因子。它能够促进NK细胞、T细胞 的增殖和杀伤活性，诱导γ-干扰素等细胞因子的产生，调节TH1细胞的发育，具有良好的临床应用前景。 目前已经进入抗肿瘤、抗病毒性疾病和治疗哮喘的Ⅰ期和Ⅱ期临床试验阶段。人重组IL-12的临床试验提 示人重组IL-12在治疗肿瘤中具有肯定的效果。
发明内容：
本发明公开了乳酸乳球菌在治疗肠道肿瘤中的一种应用方法，属于生物医药领域。用于治疗肠道肿瘤 等疾病。
本发明通过以下实验证明乳酸乳球菌在治疗肠道肿瘤中的一种应用方法：用Nsi I和EcoR I双酶切 pGEM-IL-12质粒后，与经同样酶切的含有乳链杆菌肽A(nisA)启动子的pSEC-E7质粒连接，从而构建成 pSEC-IL-12质粒；经电击转化，将重组质粒转入乳酸乳球菌NZ9000中，转化子在含有氯霉素的脑心浸液 培养基上培养。用乳链杆菌肽(nisin)诱导IL-12表达，SDS-PACE、Western blot鉴定表达产物；用酶 联免疫吸附测定(ELISA)检测IL-12的量。可建立IL-12乳酸菌基因表达系统。在nisin的诱导下，NZ9000 能够产生并分泌IL-12约80ng/L。实验结果证明乳酸乳球菌能够表达一定数量的IL-12，对肠道肿瘤具有 一定的治疗作用。
具体实施方式
下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。
1质粒、菌株及培养条件：乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000和pSEC-E7质粒为法国农业 科学院Luis教授赠送，大肠杆菌DH5α、pGEM-IL-12载体为本实验室保存；其中大肠杆菌DH5α用于质粒 pSEC-E及其衍生质粒保存或扩增的标准菌株，乳酸乳球菌NZ9000用作IL-12基因重组表达质粒pGEC-IL-12 的表达菌株。大肠杆菌用LB培养基、乳酸乳球菌及其电穿孔转化子用脑心浸液培养基培养。氨苄青霉素 使用浓度为100mg/L，氯霉素使用浓度大肠杆菌为10mg/L、乳酸乳球菌为5mg/L。
2重组质粒的构建及转化：用NSI I和EcoR I双酶切pGEM-IL-12质粒后，与经同样酶切的含有nisA 启动子的pSEC-E7质粒连接，从而构建成pSEC-IL-12质粒，pSEC-IL-12质粒含有Usp45信号肽。乳酸乳 球菌转化采用电穿孔转化法(脉冲参数为1.25kV/mm,25μF和200欧姆)。重组质粒经电击转化乳酸乳球 菌NZ9000，转化子在含有氯霉素的脑心浸液琼脂糖平板上生长。再从重组乳酸乳球菌中提取质粒 pSEC-IL-12，进行电泳鉴定。在DH5α和NZ9000中提抽到的质粒DNA分子(条带1和2)与转化前的 pSEC-IL-12(条带1)在Marker的对照下，条带处于同一位置高度，说明转化是成功的。本实验成功重组 了能够表达具有生物活性IL-12乳酸乳球菌，鉴于乳酸乳球菌为存在于胃肠道中的益生菌，因此非常适合 于治疗肠道疾病如肠炎、肠道肿瘤等疾病。
3血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)是基因在乳酸乳球菌中的诱导表达：含重组质粒 pSEC-IL-12的乳酸乳球菌NZ9000在脑心浸液培养基中30℃静置培养过夜，用新鲜培养基1:50稀释，培 养后加入诱导物Nisin至终浓度10mg/L，继续培养3h。终止培养后，取2ml培养菌液，4℃、8000～10000r/min 离心5～8min，上清液浓缩50倍后经电泳分离后，通过Bio-Rad印迹仪转移至硝酸纤维素膜上作 Western-blot，以空载体Lactococcus lactis为对照，取1ml培养菌液测定IL-12的产量。由于NICE表 达系统具有食品级的诱导物和宿主菌、严谨性高、本底表达水平低、诱导效率高及表达产量高等优点，所 以被广泛地用于外源性基因在乳酸乳球菌中表达。
实例一
临床上，肠道肿瘤也是威胁人体健康的杀手，乳酸乳球菌能够有效减轻或改善肠道菌群的失调，控制 肠道内环境的正常，对肠内环境具有保护作用，在治疗肠道疾病中，特别是在肠道肿瘤的治疗中具有较好 的效果。治疗方法为口服咀嚼乳酸菌素片，4.8克/次，每天三次。