一种垂序商陆提取物及其在防治降香黄檀炭疽病上的应用.pdf

本发明公开了一种垂序商陆提取物及其在防治降香黄檀炭疽病上的应用方法。该提取物是采用乙酸乙酯提取垂序商陆得到的提取物。本发明的优势如下：1)所用的植物材料垂序商陆为入侵植物，廉价易得，不会浪费其他的植物资源；2)仅需一种植物，即单方，而非复方就能得到很好的防治效果，制备过程简单，成本低；3)有效成分是植物本身合成的化合物，能自行降解，不会导致病菌产生抗性，对环境无公害。

权利要求书
1.  一种垂序商陆提取物，其特征在于，是采用乙酸乙酯提取垂序商陆得到的提取物。

2.  根据权利要求1所述的垂序商陆提取物，其特征在于，所采用的植物材料为根、茎、叶、 花、果实或植物全株。

3.  根据权利要求1所述的垂序商陆提取物，其特征在于，采用乙酸乙酯浸泡提取，收集滤液 蒸发浓缩即得。

4.  根据权利要求3所述的垂序商陆提取物，其特征在于，以乙酸乙酯作为提取溶剂，料液比 为1g:8-12mL，室温下浸泡2-4次，每次浸泡时间2-4d，收集每次滤液进行旋转蒸发至溶剂 挥发完全，得到的浸膏即为乙酸乙酯提取物。

5.  根据权利要求,4所述的垂序商陆提取物，其特征在于，以乙酸乙酯作为提取溶剂，料液比 为1g:10mL，室温下浸泡3次，每次浸泡时间3d，收集每次滤液进行旋转蒸发至溶剂挥发完 全，得到的浸膏即为乙酸乙酯提取物。

6.  根据权利要求1所述的垂序商陆提取物，其特征在于，提取前将垂序商陆洗净后置于干燥 通风处阴干至恒重，粉碎，过40目筛，得到粉末置于35～45℃烘箱中24h后密封保存。

7.  权利要求1-6任一项所述的垂序商陆提取物的应用方法，其特征在于，用于防治降香黄檀 炭疽病。

8.  根据权利要求7所述的垂序商陆提取物的应用方法，其特征在于，将所述的垂序商陆提取 物溶解稀释以后喷洒降香黄檀植株。

9.  根据权利要求8所述的垂序商陆提取物的应用方法，其特征在于，所述的垂序商陆提取物 加入适量乙醇溶解后加水，制备成提取物浓度为20-30mg/ml的溶液，优选25mg/ml。

10.  根据权利要求9所述的垂序商陆提取物的应用方法，其特征在于，选择阴天或晴天的早 晨8：00-10：00露水干了以后，或者下午15:00-17:00，均匀喷洒在植株的叶面上，使叶片上 形成雾滴，将要形成液滴而未滴下，8月上旬开始每隔10-15天喷一次药，进行3-4次；如遇 大雨天气则需补充喷药。

说明书一种垂序商陆提取物及其在防治降香黄檀炭疽病上的应用
技术领域
本发明涉及一种对降香黄檀炭疽病病原菌有抑制作用的植物提取物及其应用方法。本发 明属于植物提取物及其抗菌活性领域。
背景技术
降香黄檀又名黄花梨，濒危种，海南特产，豆科蝶形花亚科的常绿乔木。炭疽病是降香 黄檀最主要病害之一，导致叶片逐渐干枯或穿孔，直至脱落，严重影响植株光合作用，以及 芯材的形成，且常大面积爆发。国内目前降香黄檀炭疽病的防治主要是化学防治技术，如刘 洪湾等人综述了利用80％炭疽福美、75％百菌清或波尔多液的防治方法。长期使用化学药剂 不仅容易导致病菌产生抗性，还易导致严重的环境污染。植物源农药是从植物中提取有杀虫 或抗菌作用的活性物质，直接或间接加工合成的新型农药，其优点是对环境影响较小，残留 少等。
目前国内外研究者越来越重视植物源农药的研究与开发，Aruzzellahe Balte对多种香精杀 菌活性系统的测试发现，多种植物香精油能抑制真菌的生长。Mohamed等人用24个科的58种 植物的乙醇提取物测试了对辣椒炭疽等7种病原物的抗菌活性，其中两种胡椒对所有供试菌具 强烈抗菌活性，其它的34种植物表现出选择性抗菌活性，21种植物无抗菌活性。李重九等从 韭菜中分离出多种具有蔡酚结构骨架的抑菌活性化合物。梁剑平等成功地分离并用化学合成 方法制得茜草的一种抗菌成分，定名为六茜素，其具较强的抗菌作用。孟昭礼等从银杏中分 离出对植物病原菌有很高活性的化合物，成功开发出“绿帝”农用杀菌剂系列产品。但针对降 香黄檀炭疽病的生物源药剂还未见报道。
基于以上背景，发明人以有害入侵植物垂序商陆为原料，开展了具有抑制降香黄檀炭疽 病病原菌作用的提取物的提取方法和抑菌作用的研究。以下为本发明的具体内容。
发明内容：
本发明目的是提供一种抑制降香黄檀炭疽病病原菌的植物提取物及其应用方法。
为实现上述目的，本发明包括以下技术方案：
一种垂序商陆提取物，是采用乙酸乙酯提取垂序商陆得到的提取物。
所采用的植物材料为根、茎、叶、花、果实或植物全株。
所述的提取物采用乙酸乙酯浸泡提取，收集滤液蒸发浓缩即得。具体是以乙酸乙酯作为 提取溶剂，料液比为1g:8-12mL，室温下浸泡2-4次，每次浸泡时间2-4d，收集每次滤液进 行旋转蒸发至溶剂挥发完全，得到的浸膏即为乙酸乙酯提取物。
上述方法优选以乙酸乙酯作为提取溶剂，料液比为1g:10mL，室温下浸泡3次，每次浸 泡时间3d，收集每次滤液进行旋转蒸发至溶剂挥发完全，得到的浸膏即为乙酸乙酯提取物。
上述方法提取前将垂序商陆洗净后置于干燥通风处阴干至恒重，粉碎，过40目筛，得到 粉末置于35～45℃烘箱中24h后密封保存。
所述的垂序商陆提取物的应用方法，用于防治降香黄檀炭疽病。使用时将所述的垂序商 陆提取物溶解稀释以后喷洒降香黄檀植株。具体是将所述的垂序商陆提取物的加入适量乙醇 溶解后加水，制备成提取物浓度为20-30mg/ml的溶液，优选25mg/ml。
选择阴天或晴天的早晨露水干了以后(8：00-10：00)或者下午温度稍微低点的时候 (15:00-17:00)，均匀喷洒在植株的叶面上，喷洒药剂在叶片上形成雾滴，将要形成液滴而未 滴下为宜。8月上旬开始每隔10-15天喷一次药，进行3-4次，把病原菌量控制在一个较低的 水平。如遇大雨天气则需补充喷药。
本发明的有益效果
1、本发明中所用的植物材料为入侵植物，廉价易得，不会浪费其他的植物资源；
2、本发明仅需一种植物，即单方，而非复方就能得到很好的防治效果，制备过程简单， 成本低；
3、有效成分是植物本身合成的化合物，能自行降解，不会导致病菌产生抗性，对环境无 公害。
附图说明
图1为本发明垂序商陆乙酸乙酯提取物对炭疽病病原菌生长量的影响。
具体实施方式
为了使本发明的基本原理和应用过程易于明白了解，下面结合实例进一步阐述本发明。 这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1：
将垂序商陆洗净后置于干燥通风处阴干至恒重，放入粉碎机中粉碎，过40目筛。得到粉 末置于40℃烘箱中24h后密封保存。以乙酸乙酯作为提取溶剂，料液比为1g:10ml，室温下 浸泡3次，每次浸泡时间3d，收集3次滤液进行旋转蒸发，浓缩成浸膏状至恒重，获得乙酸 乙酯提取物。
称取一定量垂序商陆乙酸乙酯提取物，加入适量无水乙醇溶解，再加蒸馏水，使乙醇浓 度为10％，提取物浓度为100mg/ml。
将适量100mg/ml垂序商陆乙酸乙酯提取物加入到已灭菌的55℃PDA培养基中，制成提 取物浓度分别为3.125mg/ml、6.25mg/ml、12.5mg/ml、25mg/ml、50mg/ml的含毒培养基， 以等体积的10％乙醇溶液为对照，每处理重复3个培养皿。用6mm打孔器在培养4d后的病 原菌菌落边缘切取菌饼，接入含毒培养基中于28℃培养箱中培养5d后，用十字交叉法测量 菌落直径，计算菌丝生长抑制率，并进行毒力分析，计算EC50。
实验结果：不同浓度垂序商陆乙酸乙酯提取物对降香黄檀炭疽病病原菌的抑制作用结果 见表1和表2。
表1 不同浓度垂序商陆乙酸乙酯提取物抑菌作用
提取物浓度(mg/mL) 抑菌率(％) 3.125 48.82c 6.25 86.09b 12.5 96.06a 25 100.00a 50 100.00a
其中：同列数字后面字母不同说明在0.05水平差异显著。
表2 垂序商陆乙酸乙酯提取物对炭疽病病原菌的毒力分析

其中，毒力回归方程曲线横坐标为浓度的对数值，纵坐标为抑制率转换成几率值。
由表1可以看出，垂序商陆乙酸乙酯提取物对降香黄檀炭疽病病原菌有较强的抑菌作用， 浓度在25mg/ml时抑制率就已经达到100％。表2发现垂序商陆乙酸乙酯提取物的EC50为 3.4126mg/ml。
实施例2：
各提取物的制备方法同实施例1，称取一定量垂序商陆乙酸乙酯提取物，加入适量无水 乙醇溶解，再加蒸馏水，使乙醇浓度为10％，提取物浓度为100mg/ml。
将适量100mg/ml植物提取物加入到已灭菌的55℃PDA培养基中，制成提取物浓度分别 为2.5mg/ml、5mg/ml、7.5mg/ml、10mg/ml、12.5mg/ml的含毒培养基，以等体积的10％ 乙醇溶液为对照，每处理重复3个培养皿。移取0.2ml菌悬液加入含毒培养皿及对照培养皿 中，涂布均匀后，置于28℃下培养。2d后观察病原菌生长情况，不长菌的最低浓度为提取 物MIC。
将上述病原菌继续培养，5d后继续观察，不长菌的最低浓度为提取物MBC。
表3 最小抑菌浓度及最小杀菌浓度

由表3可以看出，垂序商陆提取物的MIC为2.5mg/ml，MBC为10mg/ml。
实施例3：
各提取物的制备方法同实施例1，称取一定量垂序商陆乙酸乙酯提取物，加入适量无水 乙醇溶解，再加蒸馏水，使乙醇浓度为10％，提取物浓度为100mg/ml。
取6个锥形瓶，加入等量PD培养基，灭菌后加入适量植物提取物，使最终浓度为EC50，混 匀后接种0.2ml炭疽病病原菌孢子悬液。160r/min，28℃震荡培养。分别于培养48h、60h、 72h、84h、96h、120h后取出一个锥形瓶，抽滤，得到菌体置于60℃烘箱中烘至恒重。重 复操作三次，并设不加药液空白对照组。称量菌体干重并绘制生长曲线。
由图1可以看出，降香黄檀炭疽病病原菌经历适应期在72h后进入对数生长期，96h后 进入衰亡期，含药培养基也呈现相同趋势。浓度为EC50的垂序商陆提取物在液体培养时抑制 率在50％以上。
实施例4：
各提取物的制备方法同实施例1，称取一定量垂序商陆乙酸乙酯提取物，加入适量乙醇 溶解后加水，制备成提取物浓度为25mg/ml的溶液。
用以上制备的植物提取物进行林间实验，选取长势较好、炭疽病发病较多的地块进行树 叶喷洒，设置3个实验浓度，每浓度重复3次，以喷清水为对照组，以80％醚菌脂水分散粒 剂5000倍液为阳性对照。选择阴天或晴天的早晨露水干了以后(8：00-10：00)或者下午温 度稍微低点的时候(15:00-17:00)，均匀喷洒在植株的叶面上，喷洒药剂在叶片上形成雾滴， 将要形成液滴而未滴下为宜。
分别在喷药前、5天、10天、15天后调查炭疽病病情指数，计算防治效果。
病情指数(％)＝∑(各级病叶数×相对级数值)/(调查总叶数×最高级代表值)×100
防治效果(％)＝(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数×100
表4 垂序商陆提取物对降香黄檀炭疽病的防治效果

由表4可以看出，垂序商陆乙酸乙酯提取物对降香黄檀炭疽病具有较好的林间防效，与 80％醚菌脂水分散粒剂5000倍液的防治效果相当。浓度为25mg/ml的垂序商陆乙酸乙酯提 取物在5天后防治效果达到67.92％，随时间推移防治效果降低，15天后防治效果为40.79％。 实施例5
将垂序商陆洗净后置于干燥通风处阴干至恒重，放入粉碎机中粉碎，过40目筛。得到粉 末置于40℃烘箱中24h后密封保存。分别以乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯作为提取溶剂，料 液比为1g:10ml，室温下浸泡3次，每次浸泡时间3d，收集3次滤液进行旋转蒸发，浓缩成 浸膏状至恒重，获得不同溶剂提取物。
分别称取一定量垂序商陆不同溶剂提取物，加入适量无水乙醇溶解，再加蒸馏水，使乙 醇浓度为10％，提取物浓度为50mg/ml。
将病原菌接种于PD培养液中，160r/min，28℃震荡培养4d后得孢子悬液。接入0.2ml 菌悬液到PDA培养基中，涂布均匀。
用打孔器将滤纸打成直径6mm的圆形纸片，灭菌后置于不同溶剂提取物中充分浸泡。 以10％乙醇溶液为对照。将浸泡后的滤纸片分别放入含菌培养皿中，28℃培养，每种药液重 复三次。2d后采用十字交叉法测量抑菌圈直径，比较抑菌效果。
抑菌圈直径(mm)＝测量直径-滤纸片直径
表5 垂序商陆不同溶剂提取物对降香黄檀炭疽病病原菌的抑菌作用
垂序商陆提取物 抑菌圈直径(mm) 乙醇提取物 - 丙酮提取物 - 甲醇提取物 - 乙酸乙酯提取物 11.00 石油醚提取物 5.17
从表5可以看出，垂序商陆乙醇、丙酮、甲醇提取物对降香黄檀炭疽病病原菌没有抑菌 效果，乙酸乙酯提取物的抑菌作用最强。
实施例6
将飞机草全株与垂序商陆全株洗净后置于干燥通风处阴干至恒重，放入粉碎机中粉碎， 过40目筛。得到粉末置于40℃烘箱中24h后密封保存。
飞机草乙醇提取物的制备：以乙醇为提取溶剂，料液比为1g:10ml，室温下浸泡3次，每 次浸泡时间3d，收集3次滤液进行旋转蒸发，干燥至恒重得到粗提物。加入适量无水乙醇溶 解，再加蒸馏水，使乙醇浓度为10％，提取物浓度为100mg/ml。
垂序商陆乙酸乙酯提取物的制备：以乙酸乙酯为提取溶剂，料液比为1g:10ml，室温下浸 泡3次，每次浸泡时间3d，收集3次滤液进行旋转蒸发，干燥至恒重得到粗提物。加入适量 无水乙醇溶解，再加蒸馏水，使乙醇浓度为10％，提取物浓度为100mg/ml。
将飞机草乙醇提取物、垂序商陆乙酸乙酯提取物按1:1、1:3、1:5、5:1、3:1的比例加入 到PDA培养基中，每处理重复3个培养皿。用6mm打孔器在培养4d后的病原菌菌落边缘 切取菌饼，接入含毒培养基中于28℃培养箱中培养5d后，用十字交叉法测量菌落直径，计 算菌丝生长抑制率。
表6 飞机草与垂序商陆复配剂的抑菌效果比较
复配比例(飞机草:垂序商陆) 抑菌率(％) 1:1 49.18 1:3 74.54 1:5 81.09 5:1 40.16 3:1 43.04
飞机草乙醇提取物 70.87 垂序商陆乙酸乙酯提取物 95.71
从表6可以看出，垂序商陆乙酸乙酯提取物与飞机草乙醇提取物进行复配时，其抑菌效 果低于垂序商陆乙酸乙酯提取物单剂。飞机草提取物里面可能含有影响垂序商陆抑菌作用的 成分，所以复配剂中含有飞机草量较少的比例抑菌效果较高。
此外，本发明还尝试将垂序商陆乙酸乙酯提取物分别复配藿香蓟、茶枯、马缨丹、丁香、 苦楝、松枝叶等的含有杀菌成分的提取物，效果均没有单独的垂序商陆乙酸乙酯提取物防治 降香黄檀炭疽病的效果好。