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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410758132.0 (22)申请日 2014.12.10 A61L 27/20(2006.01) A61L 27/56(2006.01) A61L 27/54(2006.01) (71)申请人 武汉理工大学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区珞狮路 122 号 (72)发明人 徐海星 张凌溪 许沛虎 郑芙蓉 金鸣 李安召 汪志辉 (74)专利代理机构 湖北武汉永嘉专利代理有限 公司 42102 代理人 乔宇 (54) 发明名称 一种神经生长因子可注射原位水凝胶、 制备 及其应用 (57) 摘要 本发明涉及神经生长因子原位可注。
2、射水凝 胶、 制备及其应用。 它是在透明质酸和壳聚糖盐酸 盐的水溶液体系中加入EDC和NHS， 在酸性条件下 使透明质酸在 EDC/NHS 作用下生成 HA-NHS- 活性 酯中间体后， 再加入神经生长因子得到的。该水 凝胶具有 pH 敏感特性， 能在人体生理条件下完成 溶液 - 凝胶的转变过程， 其注射到神经组织后， 会 在神经受损部位受体内 pH 的作用下原位固化， 避 免外科手术的创伤性。之后利用该水凝胶的环境 敏感特性， 可以实现 NGF 在体内缓慢释放， 有效解 决 NGF 因半衰期短、 扩散或降解过快所造成的活 性降低、 突释等问题， 保持 NGF 较好的生物活性， 促进神经轴突延。
3、伸和髓鞘化， 从而达到修复神经 的目的。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 附图3页 (10)申请公布号 CN 104399118 A (43)申请公布日 2015.03.11 CN 104399118 A 1/1 页 2 1. 一种神经生长因子原位可注射水凝胶， 其特征在于 ： 它是在透明质酸和壳聚糖盐 酸盐的水溶液体系中加入 EDC 和 NHS， 在酸性条件下使透明质酸在 EDC/NHS 作用下生成 HA-NHS- 活性酯中间体后， 再加入 NGF 而得到的。 2. 根据权利要求 1 所述的神经生长因子原位可注射。
4、水凝胶， 其特征在于 ： 所述的酸性 条件为调节体系 pH 为 4.7-6.0。 3. 根据权利要求 1 所述的神经生长因子原位可注射水凝胶， 其特征在于 ： 所述壳聚糖 盐酸盐和透明质酸的质量比为 0.5-2.5 ： 1。 4. 根据权利要求 1 所述的神经生长因子原位可注射水凝胶， 其特征在于 ： 神经生长因 子原位可注射水凝胶在人体生理环境下通过 HA-NHS- 活性酯中间体与壳聚糖盐酸盐中的 NH2基团进行酰胺反应完全转变为凝胶。 5. 根据权利要求 1 所述的神经生长因子原位可注射水凝胶， 其特征在于 ： 所述神经生 长因子原位可注射水凝胶转变得到的凝胶的孔径范围为 0.5-10 微。
5、米。 6. 一种神经生长因子原位可注射水凝胶的制备方法， 其特征在于 ： 步骤如下 ： (1) 在透明质酸的水溶液中逐渐加入壳聚糖盐酸盐， 磁力搅拌使其混合均匀后将 pH 调 至 4.7-6.0， 然后称取一定质量的 EDC 和 NHS 于上述反应液， 使体系中 EDC 和 NHS 的摩尔质 量分别为 1070mM 和 1070mM， 反应 16 小时后即得 HA-CS 溶胶体系 ； (2) 在步骤 (1) 中制得的 HA-CS 溶胶体系中加入 NGF， 搅拌使其混合均匀即得。 7. 根据权利要求 6 所述的神经生长因子原位可注射水凝胶的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （1） 的搅拌温度。
6、为 0-4。 8. 根据权利要求 6 所述的神经生长因子原位可注射水凝胶的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 (2) 的搅拌温度为 0-4。 9. 根据权利要求 6 所述的神经生长因子原位可注射水凝胶的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （2） 中每毫升 HA-CS 溶胶体系所需的 NGF 的用量为 25-75ng。 10. 权利要求 1 所述的神经生长因子原位可注射水凝胶在神经修复方面的应用。 权 利 要 求 书 CN 104399118 A 2 1/7 页 3 一种神经生长因子可注射原位水凝胶、 制备及其应用 技术领域 0001 本发明属于神经组织工程和再生医学领域， 具体涉及一种神经。
7、生长因子可注射原 位水凝胶、 制备及其在神经修复方面的应用。 背景技术 0002 周围神经损伤是临床上的一种常见病症。 目前， 临床上一般采用神经吻合、 自体神 经移植、 同种异体神经移植、 自体非神经组织移植、 生物材料替代等方法来进行神经修复。 其中， 将生物材料加工成管状结构的神经导管是目前研究的重点。 但是当遇到长距离， 粗大 神经的缺损时， 这类单纯由生物材料制成的导管由于缺乏生物活性物质等微环境物质的支 持， 取得的修复效果非常有限。 0003 神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)是具有神经元营养和促突触生长双重 生物学功能的一种神经细胞生长调节因子， 它。
8、对中枢及周围神经元的发育、 分化、 生长、 再 生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。然而， NGF 生物半衰期短， 不能长期有效促进 神经再生 ； 并且 NGF 易遭受化学结构破坏或被其他化学物质修饰而失去生物活性， 使其使 用受到限制。所以， 设计一种 NGF 缓控释体系以实现 NGF 在修复神经的过程中稳定持续释 放， 在促进神经轴突延伸和髓鞘化的同时， 持续发挥神经细胞营养效应， 促进受损神经的修 复， 已成为周围神经修复的研究热点。 0004 近年来， 随着智能水凝胶的发展， 可注射原位水凝胶作为一种新型水凝胶成为水 凝胶研究中的热点之一。所谓可注射原位水凝胶是指注射前为流动的液体。
9、， 通过注射器注 入皮下组织或肌肉组织后， 在注射部位原位凝胶化， 形成具有一定空间结构和强度的水凝 胶。由于其形成机制是利用高分子材料对外界剌激 ( 比如 pH 值、 温度、 离子浓度等 ) 的响 应， 使聚合物在生理条件下发生状态或构象的变化， 完成溶液向凝胶的转化过程。因此， 这 类水凝胶在生理条件下较强的实用性受到了研究者的广泛关注。在组织工程领域， 可注射 原位凝胶类材料也适应了微创伤技术发展的要求， 具有微创伤修复组织缺损或畸形、 组织 损伤小、 不破坏修复区血供、 操作简便易行等优点， 具有良好的应用前景。 0005 一种理想的可注射性原位水凝胶材料， 常需具备以下几个条件 ： 。
10、(1) 注射前能保 持低粘度溶胶状， 易于注射 ： (2) 注射后凝胶化立即发生， 并在短时间内完成 ； (3) 凝胶可生 物降解或可逐渐溶解， 降解产物是可生物吸收的 ； (4) 凝胶自身 ( 包括促使原位凝胶化的添 加剂 ) 及其降解产物都具有良好的生物相容性 ； (5) 对于药物缓释体系需满足所载药物呈 现一定的缓释规律， 而作为组织工程支架要求有良好的细胞粘附能力等。 0006 壳聚糖 (chitosan,CS) 是一种天然的碱性多糖， 具有低毒性、 良好的生物相容性 和生物降解性的特点。此外， 壳聚糖还具有抗血栓、 促进伤口愈合及软、 硬组织的重建等生 物活性， 广泛应用于生物医药领。
11、域。壳聚糖作为 NGF 的载体或直接用于周围神经缺损的修 复， 均取得了一定的成功。 透明质酸(hyaluronic acid,HA)是一种天然聚阴离子聚合物， 同 时也是细胞外基质的重要成分之一， 广泛存在于人体的大部分器官和组织中， 对细胞增殖、 分化以及稳定细胞与组织的表型等， 均有重要作用。目前已有大量研究证明 HA 凝胶对神经 说 明 书 CN 104399118 A 3 2/7 页 4 轴突的生长有促进作用。同时， 高浓度、 高分子量的 HA 还具有抑制淋巴细胞、 单核细胞和成 纤维细胞的迁移， 减轻炎症反应， 形成免疫屏障的作用， 具有很高的利用价值。 0007 虽然将 CS 和。
12、 HA 用于组织工程有很多优势， 但将它们单独制成的水凝胶存在力学 强度较低， 在体内易出现坍塌， 也易出现炎症反应等缺点。所以， CS 或 HA 水凝胶单独作为 神经修复用支架材料存在很大的不足。 发明内容 0008 本发明所要解决的技术问题是提供一种神经生长因子原位可注射水凝胶、 制备及 其应用。该水凝胶具有 pH 敏感特性， 能在人体生理条件下完成溶液 - 凝胶的转变过程， 其 注射到神经组织后， 会在神经受损部位受体内 pH 的作用下原位固化， 避免外科手术的创伤 性。之后利用该水凝胶的环境敏感特性， 可以实现 NGF 在体内的缓慢释放， 有效解决 NGF 因 半衰期短、 扩散或降解过。
13、快所造成的活性降低、 突释等问题， 保持 NGF 较好的生物活性， 促 进神经轴突延伸和髓鞘化， 从而达到修复神经的目的。 0009 为解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案是 ： 0010 一种神经生长因子原位可注射水凝胶， 其特征在于 ： 它是在透明质酸 (HA) 和壳聚 糖盐酸盐的水溶液体系中加入EDC和NHS， 在酸性条件下使透明质酸在EDC/NHS作用下生成 HA-NHS- 活性酯中间体后， 再加入 NGF( 神经生长因子 ) 而得到的。 0011 按上述方案， 所述的酸性条件为调节体系 pH 为 4.7-6.0。 0012 按上述方案， 所述壳聚糖盐酸盐和透明质酸的质量比为 0.。
14、5-2.5 ： 1。 0013 按上述方案， 所述神经生长因子原位可注射水凝胶在人体生理环境下通过 HA-NHS- 活性酯中间体与壳聚糖盐酸盐中的 NH2 基团进行酰胺反应完全转变为凝胶。 0014 按上述方案， 所述神经生长因子原位可注射水凝胶转变得到的凝胶的孔径范围为 0.5-10 微米。 0015 一种神经生长因子原位可注射水凝胶的制备方法， 步骤如下 ： 0016 (1) 在透明质酸 (HA) 的水溶液中逐渐加入壳聚糖盐酸盐， 磁力搅拌使其混合均匀 后将 pH 调至 4.7-6.0， 然后称取一定质量的 EDC 和 NHS 于上述反应液， 使体系中 EDC 和 NHS 的摩尔质量分别为。
15、 10 70mM 和 10 70mM， 反应 1 6 小时后即得 HA-CS 溶胶体系 ； 0017 (2) 在步骤 (1) 中制得的 HA-CS 溶胶体系中加入 NGF( 神经生长因子 )， 搅拌使其 混合均匀即得。 0018 按上述方案， 所述步骤 (1) 的搅拌温度为 0-4。 0019 按上述方案， 所述步骤 (2) 的搅拌温度为 0-4。 0020 按上述方案， 所述步骤 (2) 中每毫升 HA-CS 溶胶体系所需的 NGF 的用量为 25-75ng。 0021 上述神经生长因子原位可注射水凝胶在神经修复方面的应用。 0022 本发明通过选择类细胞外基质成分壳聚糖 (CS) 盐酸盐和。
16、细胞外基质成分透明质 酸 (HA)， 利用 HA 上的修饰基团 -COOH 以及 CS 上的修饰基团 -NH2， 选择无细胞毒性且组织 相容性好的酰胺交联剂 1- 乙基 -3-(3- 二甲氨基丙基 ) 碳化二亚胺 (EDC) 和 N- 羟基琥珀 酰亚胺 (NHS) 完成原位水凝胶的制备过程。首先， 在酸性条件下， EDC/NHS 与 HA 上的修饰 基团 -COOH 合成 HA-NHS- 活性酯中间体， 之后当 pH 值逐渐升高并到达人体生理 pH 时 (7.4 说 明 书 CN 104399118 A 4 3/7 页 5 左右)， 随着HA-NHS-活性酯中间体与CS盐酸盐上的修饰基团氨基酰。
17、胺反应的完成， 即可响 应生理 pH 实现溶液 - 凝胶转变。具体机理见图 1。 0023 本发明的有益效果 ： 0024 1. 本发明根据 “仿生” 的原理， 制备出的能在人体生理环境 (pH7.4 左右 ) 的条件 下完成溶液 - 凝胶的转变过程可注射的 HA-CS 原位水凝胶， 改善了单独运用 HA 水凝胶或者 CS水凝胶所具有的力学强度较低， 稳定性较差等缺点， 形成优势互补。 同时实现对细胞外基 质功能的模拟， 为神经再生提供良好 “微环境” 。 将该水凝胶应用于周围神经组织， 一方面可 以充分发挥其具有的原位凝胶化并缓慢释放 NGF 的优势， 另一方面也可以充分填充于复杂 形状缺损。
18、的神经组织， 避免手术的创伤性， 减少患者的痛苦、 加速愈合。为周围神经修复用 材料提供新思路。目前， 将可注射原位水凝胶作为生物载体携带神经生长因子 NGF 治疗周 围神经修复的研究至今尚未见到报道。具体地， 本发明提供的神经生长因子原位可注射水 凝胶具有以下特性 ： 0025 1) 凝胶材料组成的 “仿生” 性 0026 HA-CS-NGF 可注射原位水凝胶充分发挥了 HA 和 CS 材料本身的优点、 形成了优势 互补， 有望改善单独运用HA水凝胶或者CS水凝胶所具有的力学强度较低， 稳定性较差等缺 点。 此外， 该缓控释体系在结构组成上实现了对细胞外基质功能的模拟， 以期具有良好的生 物。
19、相容性。 0027 2) 凝胶系统形成的智能性 0028 HA-CS-NGF可注射原位水凝胶是在人体生理pH的诱导下完成的溶液-凝胶转变过 程， 具有较强的实用性。在合成过程中用到的 EDC 和 NHS 也是无细胞毒性且组织相容性好 的交联剂， 减少了体系的毒副作用， 有效避免了 NGF 易遭受化学结构破坏或被其他化学物 质修饰而失去生物活性的缺点。 0029 3)NGF 释放的控释性 0030 利用水凝胶响应于体内 pH 值发生交联、 溶胀、 降解的特点， 通过调节凝胶的结构 参数、 孔隙大小， 实现了 NGF 在体内的缓慢释放。可以有效的解决 NGF 半衰期短， 避免因扩 散过快和降解过快。
20、造成的活性降低、 突释等问题， 提高 NGF 在体内的利用率和安全性。 0031 4) 给药途径的便捷性 0032 通过将溶液注射到体内， 原位形成凝胶， 这就为 NGF 提供了一种很便捷的给药途 径。 从移植的观点看， 目前临床上常用的神经导管必须填满受损部位， 这就需知道受损部位 的几何尺寸， 然后按照该几何尺寸在体外进行支架的制作， 且需进行外科操作。相比之下， 通过注射器直接把流动态的水凝胶送入体内， 使其通过体内 pH 值的感应形成凝胶， 给药途 径非常方便。 0033 5) 神经修复的微创性 0034 和利用生物材料制成神经导管来修复神经相比， 将 HA-CS-NGF 可注射凝胶应。
21、用于 周围神经组织， 是通过注射的方法将具有一定流动性的生物材料注射到体内原位形成水凝 胶， 不需要手术的方法植入， 避免了手术的创伤性， 满足了微创伤技术发展的要求， 有利于 减少患者的痛苦， 加速愈合。 0035 6) 支架形状的可塑性 0036 HA-CS-NGF 可注射原位水凝胶可以很容易充满整个具有不规则形状的神经缺损部 说 明 书 CN 104399118 A 5 4/7 页 6 位， 以达到支架和周围受损神经组织密切接触的目的。避免了预塑型支架材料难以与修复 部位吻合的缺陷， 有助于更好的修复不规则和复杂的神经缺损， 为周围神经修复用材料提 供新思路。 0037 7) 系统制备的。
22、简易性 0038 本发明提供的制备方法， 方法简便， 实施条件温和， 成本较低， 环境污染少， 对组织 工程化治疗神经修复的临床开展具有重要意义。 0039 8) 系统适用的广泛性 0040 2. 本发明提供神经生长因子原位可注射水凝胶还可用于其它不同生长因子、 蛋白 质药物以及基因等， 从而进一步扩大其运用范围， 具有广泛适用性。 0041 3. 本发明提供的神经生长因子原位可注射水凝胶制备方法简单， 易于实施。 附图说明 0042 图 1 ： HA-CS 可注射原位水凝胶的形成原理示意图。 0043 图中， (a)HA与EDC/NHS在酸性条件下生成HA-NHS活性酯中间体 ； (b)HA。
23、-NHS活性 酯中间体与 CS 在人体生理条件下生成水凝胶 ； 照片分别为 HA-CS 溶胶和 HA-CS 水凝胶。 0044 图 2 ： 实施例 1 的 HA-CS 水凝胶的红外光谱图。 0045 图 3 ： 实施例 1 的 HA-CS 水凝胶的 SEM 图。 0046 图 4 ： HA-CS-NGF 原位水凝胶的体外失重率曲线图。 0047 图 5 ： NGF 的体外累计释放率曲线图。 具体实施方式 0048 为了更好地理解本发明， 下面结合实施例进一步阐明本发明的内容。但是应当理 解， 下面的实施例仅仅是作为例证的， 不应以任何方式当作对上述本发明总体的限制。 0049 实施例 1 00。
24、50 HA-CS-NGF 可注射原位水凝胶的制备 0051 (1) 在 4冰浴的条件下， 将 0.1g 的 HA 加入到 10ml 去离子水中， 磁力搅拌 50min 使其充分溶解， 再逐渐加入 0.1gCS 盐酸盐， 磁力搅拌 1h 使其混合均匀后将 pH 调至 4.7， 然 后称取一定质量的EDC和NHS于上述反应液， 使EDC和NHS的摩尔质量分别为30mM和30mM， 反应 2 小时后即得 HA-CS 溶胶。 0052 (2) 将 (1) 中制得的 HA-CS 溶胶与 0.5g/ml 的 NGF 溶液 0.5ml 在 4下混合， 并 搅拌 30min 使其混合均匀即得。 0053 HA。
25、-CS-NGF 可注射原位水凝胶的结构、 形貌表征 0054 调整上述制备的体系的 pH 至 7.4 并置于 37恒温水浴中 ( 模拟人体生理环境 )， 直至瓶中溶胶不能完全流动时， 真空冷冻干燥 12 48h 后备用。 0055 采用压片法对上述冷冻干燥后的水凝胶样品进行红外检测。取 2-3mg 干燥后的水 凝胶样品与 200-300mg 干燥的 KBr 粉末在玛瑙研钵中混匀， 充分研磨后在压模下压片。取 出压好的薄片夹在样品架上， 在红外光谱仪上检测。波数范围 ： 400-4000cm-1。红外图谱见 图 2。红外图谱表明 ： HA-CS 水凝胶的红外图谱出现了酰胺基团的特征峰， 其中 1。
26、646cm-1处 的吸收峰为酰胺 (-CONH-) 中羰基 C O 的伸缩振动峰 ( 酰胺 I 峰 )， 1566cm-1处出现的吸 说 明 书 CN 104399118 A 6 5/7 页 7 收峰为 N-H 的面内弯曲振动峰 ( 酰胺 II 峰 )。这说明 ： HA-CS 原位凝胶在形成的过程中， HA 中的 -COOH 与 CS 中的 -NH2 成功发生了交联反应形成酰胺。用扫描电镜 (SEM) 对样品横截 面微观形态进行检测， SEM 图见图 3。扫描电镜观察到水凝胶孔径较小的为 1 微米， 较大的 为 10 微米。 0056 HA-CS-NGF 可注射原位水凝胶的降解性表征 0057。
27、 取 1mL 上述 1 制备的体系置于 10mL 玻璃试管内， 调整 pH 为 7.4 后于 37水浴中 ( 模拟人体生理环境 )， 直至瓶中溶胶不能完全流动时， 形成凝胶。然后将凝胶放入 37的 PBS 溶液中， 并于水浴摇床中恒温振荡 (371， 505rpm) 降解。降解时间分别为 1、 2、 3、 7、 9、 11 天等。降解到相应的时间后， 取出样品， 用去离子水洗涤， 检测失重率。经检测 ： 本 发明的水凝胶在 15 天之内失重率达到 65。 0058 HA-CS-NGF 可注射原位水凝胶的累计释放量表征 0059 在超净工作台下， 将上述 2 制得的冷冻干燥后的水凝胶样品置入灭菌。
28、过的 5mL 离 心管， 加入 3mL 磷酸缓冲溶液 (pH 7.4)， 之后将离心管置于 37恒温振荡培养箱 (60r/ min)， 在预设时间点(6h、 12h、 1d、 3d、 5d、 7d等)将缓释液取出， 于-70保存， 并加入等量的 磷酸缓冲溶液， 继续均匀摇动， 浸提液的制备过程均应保证无菌。然后利用 NGF-ELISA 试剂 盒的方法测定特定时间缓释液中 NGF 的精确含量。20 天之内累计释放量达到 60。 0060 实施例 2 0061 HA-CS-NGF 可注射原位水凝胶的制备 0062 (1) 在 4冰浴的条件下， 将 0.2g 的 HA 加入到 10ml 去离子水中，。
29、 磁力搅拌 50min 使其充分溶解， 再逐渐加入 0.1gCS 盐酸盐， 磁力搅拌 1h 使其混合均匀后将 pH 调至 5.4， 然 后称取一定质量的EDC和NHS于上述反应液， 使EDC和NHS的摩尔质量分别为70mM和30mM， 反应 1 小时后即得 HA-CS 溶胶。 0063 (2) 将 (1) 中制得的 HA-CS 溶胶与 0.75g/ml 的 NGF 溶液 0.5ml 在 4下以一定 的比例混合， 并搅拌 30min 使其混合均匀， 即得。 0064 HA-CS-NGF 可注射原位水凝胶的结构、 形貌表征 0065 调整上述制备的体系的 pH 至 7.4 并置于 37恒温水浴中 。
30、( 模拟人体生理环境 )， 直至瓶中溶胶不能完全流动时， 真空冷冻干燥 12 48h 后备用。 0066 参考实施例 1 的表征方法对 .HA-CS-NGF 可注射原位水凝胶的结构、 形貌、 进行表 征。红外结果表明成功生成酰胺。用扫描电镜 (SEM) 对样品横截面微观形态进行检测。扫 描电镜观察到水凝胶孔径较小的为 0.5 微米， 较大的为 5 微米。 0067 HA-CS-NGF 可注射原位水凝胶的降解性表征 0068 参考实施例 1 的表征方法对 HA-CS-NGF 可注射原位水凝胶的降解性表征 0069 经检测 ： 本发明的水凝胶 15 天之内失重率达到 90。 0070 HA-CS-。
31、NGF 可注射原位水凝胶的累计释放量表征 0071 参考实施例 1 的表征方法对 HA-CS-NGF 可注射原位水凝胶的累计释放量表征 0072 经检测 ： 本发明的水凝胶 20 天之内累计释放量达到 50。 0073 实施例 3 0074 HA-CS-NGF 可注射原位水凝胶的制备 0075 (1) 在 4冰浴的条件下， 将 0.2g 的 HA 加入到 10ml 去离子水中， 磁力搅拌 50min 说 明 书 CN 104399118 A 7 6/7 页 8 使其充分溶解， 再逐渐加入 0.3gCS 盐酸盐， 磁力搅拌 1h 使其混合均匀后将 pH 调至 6， 然后 称取一定质量的 EDC 。
32、和 NHS 于上述反应液， 使 EDC 和 NHS 的摩尔质量分别为 10mM 和 10mM， 反应 2 小时后即得 HA-CS 溶胶。 0076 (2) 将 (1) 中制得的 HA-CS 溶胶与 1g/ml 的 NGF 溶液 0.5ml 在 4下以一定的 比例混合， 并搅拌 30min 使其混合均匀， 即得。 0077 HA-CS-NGF 可注射原位水凝胶的结构、 形貌表征 0078 调整上述制备的体系的 pH 至 7.4 并置于 37恒温水浴中 ( 模拟人体生理环境 )， 直至瓶中溶胶不能完全流动时， 真空冷冻干燥 12 48h 后备用。 0079 参考实施例 1 的表征方法对 .HA-C。
33、S-NGF 可注射原位水凝胶的结构、 形貌、 进行表 征。红外结果表明成功生成酰胺。用扫描电镜 (SEM) 对样品横截面微观形态进行检测。扫 描电镜观察到水凝胶孔径较小的为 1 微米， 较大的为 7 微米。 0080 HA-CS-NGF 可注射原位水凝胶的降解性表征 0081 参考实施例 1 的表征方法对 HA-CS-NGF 可注射原位水凝胶的降解性表征 0082 经检测 ： 本发明的水凝胶 15 天之内失重率达到 80。 0083 HA-CS-NGF 可注射原位水凝胶的累计释放量表征 0084 参考实施例 1 的表征方法对 HA-CS-NGF 可注射原位水凝胶的累计释放量表征 0085 经检。
34、测 ： 本发明的水凝胶 20 天之内累计释放量达到 30。 0086 实施例 4 0087 HA-CS-NGF 可注射原位水凝胶的制备 0088 (1) 在 4冰浴的条件下， 将 0.1g 的 HA 加入到 10ml 去离子水中， 磁力搅拌 50min 使其充分溶解， 再逐渐加入 0.2gCS 盐酸盐， 磁力搅拌 1h 使其混合均匀后将 pH 调至 5.4， 然 后称取一定质量的EDC和NHS于上述反应液， 使EDC和NHS的摩尔质量分别为10mM和40mM， 反应 0.5 小时后即得 HA-CS 溶胶。 0089 (2) 将 (1) 中制得的 HA-CS 溶胶与 1.25g/ml 的 NGF。
35、 溶液 0.5ml 在 4下以一定 的比例混合， 并搅拌 30min 使其混合均匀， 即得。 0090 HA-CS-NGF 可注射原位水凝胶的结构、 形貌表征 0091 调整上述制备的体系的 pH 至 7.4 并置于 37恒温水浴中 ( 模拟人体生理环境 )， 直至瓶中溶胶不能完全流动时， 真空冷冻干燥 12 48h 后备用。 0092 参考实施例 1 的表征方法对 .HA-CS-NGF 可注射原位水凝胶的结构、 形貌、 进行表 征。 0093 红外结果表明成功生成酰胺。用扫描电镜 (SEM) 对样品横截面微观形态进行检 测。扫描电镜观察到水凝胶孔径较小的为 1 微米， 较大的为 5 微米。 。
36、0094 HA-CS-NGF 可注射原位水凝胶的降解性表征 0095 参考实施例 1 的表征方法对 HA-CS-NGF 可注射原位水凝胶的降解性表征 0096 经检测 ： 本发明的水凝胶 20 天之内失重率达到 30。 0097 HA-CS-NGF 可注射原位水凝胶的累计释放量表征 0098 参考实施例 1 的表征方法对 HA-CS-NGF 可注射原位水凝胶的累计释放量表征 0099 经检测 ： 本发明的水凝胶 15 天之内累计释放量达到 30。 0100 实施例 5 说 明 书 CN 104399118 A 8 7/7 页 9 0101 HA-CS-NGF 可注射原位水凝胶的制备 0102 。
37、(1) 在 4冰浴的条件下， 将 0.1g 的 HA 加入到 10ml 去离子水中， 磁力搅拌 50min 使其充分溶解， 再逐渐加入 0.25gCS 盐酸盐， 磁力搅拌 1h 使其混合均匀后将 pH 调至 4.7， 然后称取一定质量的 EDC 和 NHS 于上述反应液， 使 EDC 和 NHS 的摩尔质量分别为 10mM 和 70mM， 反应 6 小时后即得 HA-CS 溶胶。 0103 (2) 将 (1) 中制得的 HA-CS 溶胶与 1.5g/ml 的 NGF 溶液 0.5ml 在 4下以一定 的比例混合， 并搅拌 30min 使其混合均匀， 即得。 0104 HA-CS-NGF 可注射。
38、原位水凝胶的结构、 形貌表征 0105 参考实施例 1 的表征方法对 .HA-CS-NGF 可注射原位水凝胶的结构、 形貌、 进行表 征。 0106 红外结果表明成功生成酰胺。用扫描电镜 (SEM) 对样品横截面微观形态进行检 测。扫描电镜观察到水凝胶孔径较小的为 2 微米， 较大的为 10 微米。 0107 HA-CS-NGF 可注射原位水凝胶的降解性表征 0108 参考实施例 1 的表征方法对 HA-CS-NGF 可注射原位水凝胶的降解性表征 0109 经检测 ： 本发明的水凝胶 18 天之内失重率达到 60。 0110 HA-CS-NGF 可注射原位水凝胶的累计释放量表征 0111 参考实施例 1 的表征方法对 HA-CS-NGF 可注射原位水凝胶的累计释放量表征 0112 经检测 ： 本发明的水凝胶 13 天之内累计释放量达到 50。 说 明 书 CN 104399118 A 9 1/3 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 104399118 A 10 2/3 页 11 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 104399118 A 11 3/3 页 12 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 104399118 A 12 。