一种抑制新城疫病毒的制剂.pdf

本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及一种抑制新城疫病毒的制剂。抑制新城疫病毒的制剂为壳聚糖胺代衍生物；壳聚糖胺代衍生物为N-邻苯二甲酰基壳聚糖和/或6-脱氧-6-溴代-N-邻苯二甲酰基壳聚糖。本发明采用不同溶剂溶解壳聚糖胺代衍生物，对不同溶剂对其生物活性的释放影响进行了评估，并最终采用生理盐水作为有效溶剂对壳聚糖胺代衍生物进行溶解释放，增加壳聚糖正电荷的衍生物壳聚糖胺代衍生物，其对新城疫病毒具有很好的抑制作用。

权利要求书
1.  一种抑制新城疫病毒的制剂，其特征在于：抑制新城疫病毒的制剂为壳聚糖胺代衍生物；
壳聚糖胺代衍生物为N-邻苯二甲酰基壳聚糖和/或6-脱氧-6-溴代-N-邻苯二甲酰基壳聚糖。

2.  按权利要求1所述的抑制新城疫病毒的制剂，其特征在于：所述制剂为壳聚糖胺代衍生物溶解液；壳聚糖胺代衍生物溶解液为N-邻苯二甲酰基壳聚糖的溶解液和/或6-脱氧-6-溴代-N-邻苯二甲酰基壳聚糖的溶解液。

3.  按权利要求2所述的抑制新城疫病毒的制剂，其特征在于：所述壳聚糖胺代衍生物溶解液为壳聚糖胺代衍生物经生理盐水溶解获得。

4.  按权利要求3所述的抑制新城疫病毒的制剂，其特征在于：所述抑制新城疫病毒的制剂是浓度为1-10g/L的N-邻苯二甲酰基壳聚糖的生理盐水溶解液和/或1-10g/L的6-脱氧-6-溴代-N-邻苯二甲酰基壳聚糖的生理盐水溶解液。

5.  一种权利要求1所述的抑制新城疫病毒的制剂的应用，其特征在于：所述制剂作为制备抑制新城疫病毒的药物。

6.  按权利要求5所述的抑制新城疫病毒的制剂的应用，其特征在于：所述制剂作为制备有效降低鸡胚尿囊液中的新城疫病毒血凝效价的药物。

说明书一种抑制新城疫病毒的制剂
技术领域
本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及一种抑制新城疫病毒的制剂。
背景技术
壳聚糖是一种天然阳离子多糖，由于2位氨基的存在，表现出一定的亲水性和碱性，在酸性水溶液中易被质子化，而产生多种生物学活性，如抗菌、抗肿瘤等。研究表明，壳聚糖的抑菌活性主要与其分子上的氨基有关，在环境pH小于其pKa时，氨基被质子化带正电荷，能破坏细胞膜稳定性、干扰物质转运等方式抑制或杀灭微生物。
新城疫是由新城疫病毒(NDV)引起禽类的一种以呼吸道、消化道黏膜出血为典型症状的高度接触性、急性败血性传染病。具有分布范围广、易感禽类多、经济损失大、影响国际贸易等特点。目前新城疫的防治主要以预防为主，虽然有多种疫苗和免疫方法，但是该病的发病率却仍是居高不下。其主要原因有母源抗体的干扰、病毒引起的免疫抑制等。由于新城疫防治困难，给我国已造成了巨大的经济损失，引起了人们的极大关注。同时作为免疫损伤性疾病，对于新城疫的研究是系统性研究免疫损伤性疾病的重要基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种抑制新城疫病毒的制剂。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种抑制新城疫病毒的制剂，抑制新城疫病毒的制剂为壳聚糖胺代衍生物；
壳聚糖胺代衍生物为N-邻苯二甲酰基壳聚糖和/或6-脱氧-6-溴代-N-邻苯二甲酰基壳聚糖。
所述制剂为壳聚糖胺代衍生物溶解液；壳聚糖胺代衍生物溶解液为N-邻苯二甲酰基壳聚糖的溶解液和/或6-脱氧-6-溴代-N-邻苯二甲酰基壳聚糖的溶解液。
所述壳聚糖胺代衍生物溶解液为壳聚糖胺代衍生物经生理盐水溶解获得。
所述抑制新城疫病毒的制剂是浓度为1-10g/L的N-邻苯二甲酰基壳聚糖的生理盐水溶解液和/或1-10g/L的6-脱氧-6-溴代-N-邻苯二甲酰基壳聚糖的生理盐水溶解液。
一种抑制新城疫病毒的制剂的应用，所述制剂作为制备抑制新城疫病毒的药物。
所述制剂作为制备有效降低鸡胚尿囊液中的新城疫病毒血凝效价的药 物。
本发明的优点：
1.本发明采用不同溶剂溶解壳聚糖胺代衍生物，以不同溶剂对其生物活性的释放影响进行了评估，并最终采用生理盐水作为有效溶剂对壳聚糖胺代衍生物进行溶解释放，增加壳聚糖正电荷的衍生物壳聚糖胺代衍生物，对新城疫病毒具有很好的抑制作用。
2.经过充分溶解的N-邻苯二甲酰基壳聚糖和6-脱氧-6-溴代-N-邻苯二甲酰基壳聚糖对新城疫病毒具有较好的抑制效果，尤其是N-邻苯二甲酰基壳聚糖和6-脱氧-6-溴代-N-邻苯二甲酰基壳聚糖分别与病毒混合，使新城疫病毒的血凝效价由起始时的11降低至0。
3.经过荧光定量PCR实验发现，N-邻苯二甲酰基壳聚糖和6-脱氧-6-溴代-N-邻苯二甲酰基壳聚糖能有效降低尿囊液中病毒RNA含量。同时TLR-3和IL-8降低，而IFN-β、TNF-α增加表明以上两种物质对于机体的影响可能是直接作用于病毒，并加强病毒对免疫系统的激活效果。
4.本发明所述壳聚糖胺代衍生物除抗病毒以外，经证实具有其他多项优异的生物活性，能使抗病毒效果在综合作用下发挥最大，且制备简单，原材料丰富，作为药物使用能有效降低毒副作用及相关生物污染。
附图说明
图1为本发明实施例提供的N-邻苯二甲酰基壳聚糖(NPC)和6-脱氧-6-溴代-N-邻苯二甲酰基壳聚糖(6BrNPC)的红外谱图。
具体实施例
下面结合说明书附图对本发明作进一步说明，并且本发明的保护范围不仅局限于以下实施例。
实施例1
EID50的测定：取SPF鸡胚30枚，分成6组，分别注射10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9的鸡新城疫Lasota病毒原液，37℃孵育72h后收取尿囊液，测定EID50＝10-8.45/0.2ml,取150EID50为病毒注射量。
药物安全限度测定：将N-邻苯二甲酰基壳聚糖(NPC)、6-脱氧-6-溴代-N-邻苯二甲酰基壳聚糖(6BrNPC)、6-氨乙胺基-6-脱氧-N-邻苯二甲酰基壳聚糖(6ANPC)和6-胺取代-6-脱氧壳聚糖(6AC)四种物质，分别经生理盐水(N)、PBS(P)、二甲亚砜(D)溶解，溶解成5g/L、10g/L、15g/L三个梯度，分别注射于SPF鸡胚尿囊腔中，观察96小时内，完全成活，继续培养至出壳，鸡胚外观健康完整，无残疾。
实验：
将N-邻苯二甲酰基壳聚糖(NPC)、6-脱氧-6-溴代-N-邻苯二甲酰基壳聚糖(6BrNPC)、6-氨乙胺基-6-脱氧-N-邻苯二甲酰基壳聚糖(6ANPC)和6-胺取代-6-脱氧壳聚糖(6AC)四种物质，分别经生理盐水(N)、PBS (P)、二甲亚砜(D)溶解，溶解成1g/L、5g/L、10g/L三个梯度。各溶解液抽滤除菌后，备用。将lasota鸡新城疫病毒经生理盐水稀释为10-6后(原始病毒效价为211，96h内导致死亡)，而后将病毒稀释液与上述各物质的不同浓度的溶解液以1:1(v/v)的比例混匀，编号为1-12组，备用。
取9-11日龄SPF鸡胚，用照蛋器观察鸡胚存活情况并画出气室，确定打孔位置。采用碘伏对鸡胚气室外壳进行消毒后，再用75％酒精消毒，打孔器打孔后注射1-12组溶液0.2mL/只。血凝效价≤7为治愈。同时将空白组注射生理盐水，阳性对照1、2、3组分别为1g/L、5g/L、10g/L黄芪多糖生理盐水溶解液与病毒1:1(v/v)混合液。阴性对照为10-6鸡新城疫病毒与生理盐水1:1(v/v)混合液。蜡封，避免感染，放置于37℃孵育箱孵育72h。每隔8小时观察鸡胚存活情况，将24h内死亡鸡胚剔除，并将死亡鸡胚的尿囊液及时抽取进行血凝试验。72h后将所有活胚置于-20℃，冷冻1.5h致死抽取尿囊液进行血凝试验。结果如下表1.
表1：不同溶剂中壳聚糖胺代衍生物对新城疫病毒治愈率。

实施例2
N-邻苯二甲酰基壳聚糖(NPC)和6-脱氧-6-溴代-N-邻苯二甲酰基壳聚糖(6BrNPC)分别经生理盐水配置成0.05g/L、0.25g/L、0.5g/L、1g/L、5g/L、8g/L、10g/L不同浓度的溶解液，而后将各溶解液分别抽滤除菌后，备用。将lasota鸡新城疫原毒稀释为10-6后(原始病毒效价为211，96h内导致死亡)，而后将病毒稀释液与上述各物质的不同浓度的溶解液以1:1比例配制(v/v)，编号为1-14组，备用。
取9-11日龄SPF鸡胚，用照蛋器观察鸡胚存活情况并画出气室，确定打孔位置。采用碘伏对鸡胚气室外壳进行消毒后，再用75％酒精消毒，打孔器打孔后注射1-14组溶液0.2mL/只。阴性对照为10-6鸡新城疫病毒与生理盐水1:1混合液。蜡封，避免感染，放置于37℃孵育箱孵育72h。每隔8小时观察鸡胚存活情况，将24h内死亡鸡胚剔除，并将死亡鸡胚的尿囊液及时抽取进行血凝试验。72h后将所有活胚置于-20℃，冷冻1.5h致死抽取尿囊液进行血凝试验。结果如下表：

实施例3
以上述实施例中经10g/L的NPC或6BrNPC处理后的鸡胚尿囊液为实验对象。取鸡胚尿囊液400μL于1.5mL离心管中，加600μL裂解液颠倒混匀后加400μL氯仿，编号，颠倒混匀(10次左右)后放置-20℃沉淀10min。12000r/min离心10min，分管取上清液600μL，加异丙醇800μL，颠倒混匀，-20℃，沉淀30min。12000r/min离心10min。倾倒离心管上清，将管口向下置于吸水纸上，停留5-10s，沿离心管壁加入冷乙醇(75％)1000μL，冲洗1-2次。低速离心，将枪头置于核酸相反的位置吸出残余液体。
反转录：采用反转录试剂盒(试剂盒购买自北京全式金生物技术有限公司)，按说明书要求取上下游引物各1μL，去RNA酶水6μL分别加入到各管中，65℃孵育5分钟后冰浴2分钟，然后再加入其它反应组分。其它反应组分分别为10μL2×TS React ion Mix，1μL TransScript RT/RI Enzyme Mix，1μLgDNA Remover，轻轻混匀，42℃孵育30min。85℃加热5min失活TransScript RT与gDNA Remover。
荧光定量PCR：采用PCR试剂盒(试剂盒购买自北京全式金生物技术有限公司)，按说明书要求取8μL模板，上下游引物各1μL，10μL 2×TransStart Top Green qPCR SuperMix设置步骤为①94℃30sec，循环数为1。②94℃5sec、50-60℃15sec、72℃10sec，循环数为50。
以β-actin为内参，采用2-ΔΔCT法计算TLR-3和IL-8降低，而IFN-β、TNF-α增加的荧光定量PCR结果的差异：