说明书受体配体连接的细胞毒性分子
技术领域
本发明涉及新的细胞毒性分子以及它们在治疗癌症和其他疾病中的用途。
本发明的一个目的是提供新的细胞毒性分子，其连接至受体配体，并且具有抗癌细胞的活性和可调的药理学活性，特别是对于高效靶向表达神经肽Y受体1的那些癌细胞。具体地，本发明描述了受体配体连接的细胞毒性化合物，其为细胞毒性化合物的衍生物，通过接头部分缀合至为神经肽Y受体1的配体的肽，从而提供化合物的靶向特性以增强细胞毒性化合物的选择性和治疗窗口。
背景技术
各种细胞毒性化合物是已知的，例如天然存在的tubulysin或其衍生物以及其他细胞毒性化合物(A.W.Richter,Mol.Diversity 2005,9,141-147)，其表现出高度有效的抗一大组癌细胞系的细胞毒性活性。但是，那些化合物作为癌症的新治疗的用途有限，这是因为它们的小治疗窗口以及对非癌细胞的选择性不足。一种已知的增加高度有效的细胞毒素的治疗窗口的策略是将那些分子缀合至癌症特异性配体如抗体(US 2010/0092496和US 2011/0166319)、肽(US 2011/0166319)或受体的小分子配体如叶酸受体(US 2011/0027274和2011/0172254)或在体内内化的分子如维生素(US 2010/0004276)。
虽然这个一般原理是已知的，但是不可能预测那种具体化合物会是可用的细胞缀合物，因为许多因素影响这类缀合物的潜在治疗用途。一般来说，可用的缀合物必须表现出选择性且有效杀死癌细胞全部需要的4个主要特性：
1.在体内足够的半衰期以到达癌细胞；
2.选择性结合至癌细胞；
3.缀合物高效内化入细胞；以及
4.在细胞内从缀合物切割细胞毒性分子，高效杀死肿瘤细胞。
这些特性在一个分子中难以组合。例如，缀合可能显著减少癌症特异性配体对其靶标的亲和性和/或选择性或者其他结合特性。细胞毒性药物缀合物的内化可能通过非特异性转运入细胞如胞吞作用发生，从而减少治疗窗口。通过例如受体激活和随后的内化的配体的特异性内化可能被缀合废除。从靶向配体切割细胞毒性分子可能已在细胞外间隙或血液中发生，导致缀合物的一般毒性。或者，细胞内的切割可能需要较慢，或者通过一部分接头仍然连接或可能完全未发生而导致更无活性的毒素。
已显示NPY-1受体在某些癌症类型如乳腺癌，特别是转移性乳腺癌中过量表达，但是在其他癌症状况如尤文肉瘤、肾细胞癌、胃肠道间质瘤、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、副神经节瘤、嗜络细胞瘤、肾上腺皮质瘤、卵巢性索间质肿瘤和卵巢腺癌中也是如此(and Reubi,Peptides 28,419-425(2007))。有趣的是，在通过其天然配体NPY 1受体激活时，NPY肽内化。
因此，考虑NPY-1受体用于靶向是令人感兴趣的。这种方法已由Zwanziger(Zwanziger et al.Bioconjugate Chem.2008,19,1430–1438)公开，使用结合至修饰的NPY肽的螯合剂用于诊断目的。据发现在不同组织中，当与天然肽(T1/2～4分钟)相比时，一些缀合物的半衰期更长(T1/2>24h)。例如，修饰的NPY包括在位置7中至苯丙氨酸和在位置34中至脯氨酸的改变。据称与竞争性NPY-2、-4、-5或-6受体相比，这种修饰的NPY分子特别选择NPY 1受体。虽然这些结果大有希望，但是缀合物具有非常低的肿瘤摄入，满足前提1和2，却违反上文的前提3。
Langer(Langer et al.J.Med.Chem.2001,44,1341-1348)已公开NPY-1配体毒素缀合物，使用柔红霉素和多柔比星作为细胞毒性药物，缀合至天然的NPY肽。不同的缀合物能够以25-51nM的亲和力结合至受体，但是仅包含酸敏感的腙连接的柔红霉素的化合物表现出与游离的柔红霉素相当的细胞毒性活性。但是，因为腙接头在血清中已切割，这不满足上文的前提1和4，并且这类缀合物不可以用作治疗剂。这些实例说明在应当发明具有治疗应用的新的靶向细胞毒性缀合物时需要的解决的问题。
本发明的目的是提供新的化合物和方法，其满足靶向药物缀合物的全部4个前提，并且利用通过合适的策略偶联至细胞毒性分子的NPY-1受体特异性配体。
发明内容
本发明提供式(I)的化合物，或者其药理学可接受的盐、溶剂合物、水合物或药理学可接受的制剂：
A-L-Pep
(I)
其中
A为合适的(优选高度有效的)分子(特别是有毒的，例如细胞毒性分子)，优选具有低于100纳摩尔浓度的细胞活性，并且优选地，A具有例如通过细胞抑制、细胞毒性、抗血管生成或其他特性杀死癌细胞的能力，
L为A和Pep之间可释放或不可释放的接头或键，并且
Pep为NPY-1受体结合配体，其额外地表现出NPY-1受体激活和内化特性。
优选地，A为细胞毒性或细胞抑制分子(优选具有低于100纳摩尔浓度的细胞活性)，特别选自高度有效的分子如天然和合成的tubulysin类及其衍生物、天然和合成的埃坡霉素类及其衍生物、阿里他汀(auristatin)、多拉司他汀、天然和合成的长春新碱及其类似物、天然和合成的长春碱及其类似物、鹅膏毒环肽及其类似物、美登素类及其类似物、紫杉烷类、奈莫柔比星、PNU-159682、吡咯并苯并二氮杂(pyrrolobenzodiazepin)和二聚体、倍癌霉素(duocarmycin)及其类似物。
优选地，本发明提供式(II)的化合物，或者其药理学可接受的盐、溶剂合物、水合物或药理学可接受的制剂：
其中
n＝0、1、2；
R1为烷基或杂烷基；
R2为氢、任选地被取代的烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、烷基环烷基、杂烷基环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基；
R3为氢、OH、任选地被取代的烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、烷基环烷基、杂烷基环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基；
X为O或S(特别是S)；
R4为任选地被取代的亚芳基、亚杂芳基、亚杂环烷基、杂烷基亚环烷基、亚芳烷基或亚杂芳烷基；
R5为氢、任选地被取代的C1-C6烷基、或者任选地被取代的芳基或杂芳基；
R6为-CO2-、-CONH-、-CO-、-CONHNH-、-O-、-NH-、-S-、-SO-、-SO2-、-OP(＝O)O2-或者支化或未支化的取代或未被取代的亚烷基、亚环烷基、亚杂烷基或亚杂环烷基；
m为0、1、2或3；
X1为–L-Pep且X2为H，或者X1为H且X2为–L-Pep；并且
L和Pep如本文所定义。
优选地，R1为甲基。
优选地，R2为任选支化的烷基如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、CH2OR7、C(O)R7或CH2OCOR8，其中R7为任选支化的烷基，特别是异丙基，R8为任选支化的C1-C6烷基或C2-C6烯基。
进一步优选的R2为任选地被取代的烷基；-R9-O-R10，其中R9为亚烷 基(特别是亚甲基或亚乙基)，并且R10为烷基、烯基、环烷基、杂烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基；C(O)R7，其中R7为烷基，特别是异丙基；CH2OCOPh；CH2OCOCH2Ph；-R9-NR11R12，其中R9为亚烷基，并且R11和R12互相独立地为H或烷基；或者R13-OH，其中R13为亚烷基；或者CH2OCOR8，其中R8为任选支化的C1-C6烷基或C2-C6烯基。
更优选的R2为C1-C8-烷基；-R9-O-R10，其中R9为C1-C6-亚烷基，特别是亚甲基或亚乙基，并且R10为C1-C6-烷基、C2-C6-烯基、环烷基、杂烷基、芳基或杂芳基；C(O)R7，其中R7为C1-C6-烷基，特别是异丙基；CH2OCOPh；或者CH2OCOCH2Ph。
优选地，R3为H、-O(C＝O)-(C1-4)烷基、O-烷基或O-乙酰基。
优选地，当X1为氢时，R4为芳烷基或杂芳烷基；特别优选R4为下式的基团
其中R14为H、卤素、OH、NO2、NH2、CN、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、烷基氨基或二烷基氨基。
特别优选R14为H、OH、卤素、NH2、烷氧基、苯基、烷基氨基或二烷基氨基。
优选m为0或1。
进一步优选地，X1为氢且X2为–L-Pep。
特别优选以下式(III)的化合物，或者其药理学可接受的盐、溶剂合物、水合物或药理学可接受的制剂：
其中
R2为C1-C6烷基(特别是CH3、乙基、丙基、异丙基、异丁基、正戊基或正己基)、CH2Ph,CH2OC1-C6-烷基(特别是CH2OCH2CH3或CH2OCH2CH(CH3)2)、CH2OCOC1-C6-烷基、CH2CONHC1-C6-烷基、CH2OCOCH2Ph或CH2OCOPh；
R3为H、OAc或OC1-C6烷基(特别是OPr)；
R5为CH3或H；
R6为-CO-、-COO-、-CONH-、-CONHNH-、-O-、-NH-、-CH2O-、-CH2NH-或-CH2S-；
R14为H、F、OH、NH2、CH3、OMe或Ph；并且
L和Pep如上文所定义。
特别优选式(III)的化合物，其中R6为-CO-。
进一步优选地，A为式(Tub)的化合物
其中
R”为H、烷基、烯基、芳基或杂芳基且R”’为H或OH，并且其中一个氢原子被L或L或连接至L的键代替。
进一步优选的A选自以下化合物：Tubulysin A、B、C、D、E、F、G、H和I，其中一个氢原子被L或L或连接至L的键代替。
进一步优选地，A为式(IV)的化合物，其中一个氢原子被L或L或连接至L的键代替：
其中
R41为H或者烷基、烯基、炔基、CO-烷基、杂烷基、芳烷基或杂芳烷基，所有这些基团均可以是任选地被取代的；
R42为OH、烷基、烯基、炔基、-O-烷基、-O-烯基、-O-炔基、-O-CO-烷基或杂烷基，所有这些基团均可以是任选地被取代的；
R43为式CO2H、CO2R45、CONHR45、CONR245的基团，或者式CH2OH或的基团；
R45独立地为烷基、芳基、芳烷基或杂烷基；
X4为S或O；
R44独立地为任选地被取代的烷基(例如甲基)、任选地被取代的杂烷基(例如MeO)、卤素、CN、NO2或OH；并且
r为0、1、2、3、4或5。
优选地，R41为H或C1-C6烷基；特别是甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、异丁基、正戊基或正己基。
优选地，R42为-O-CO-烷基、烷基或杂烷基(例如-O-烷基、-O-烷基-O-烷基)；特别是O-乙酰基(OAc,OCOCH3)、-O-丙基或-OCH2OCH3。
优选地，R43为式CO2H或CO2R45的基团，其中R45优选为烷基。
进一步优选地，R43为或-CH2OH。
优选地，X4为S。
优选地，R44独立地为任选地被取代的烷基、卤素(例如F或Cl)或OH。
优选地，r为0、1、2或3，特别是0或1。
特别优选式(IV)的化合物，其中：
R41为C1-C6烷基，特别是-CH3、乙基、丙基、丁基、异丙基、异丁基、正戊基、正己基；
R42为-O-CO-烷基或杂烷基，特别是-O-CO-CH3、-O-丙基或-OCH2OCH3；
R43为-CO2H、-CO2R45、-CH2OH或
R45为烷基；
X4为S；
R44独立地为任选地被取代的烷基、卤素(例如F或Cl)或OH；并且
R为0或1。
进一步优选地，A为式(Epo)的化合物
其中
T为杂烷基-、杂环烷基-、杂烷基环烷基-、杂芳基-或杂芳基烷基-基团，
U为氢、卤素、烷基、杂烷基-、杂环烷基-、杂烷基环烷基-、杂芳基-或杂芳基烷基-基团，
G-E选自以下基团，
其中R’为F或C1-C3烷基，或者G-E是任选地被取代的苯环的一部分，
R15为C1-C4-烷基-、C1-C4-烯基-、C1-C4-炔基-或C3-C4-环烷基-基团，
Y-V-W为式CH＝CH-CH、CH2-CH2-CH或CH2-CH＝C的基团，其中双键产生顺式或反式异构体，
D1为C＝O或S(＝O)p，其中p为0、1或2，
D2为CHOH、O或S(＝O)q，其中q为0、1或2，
B为氧或式NR18的基团，其中R18为氢、烷基-、烯基-、炔基-、杂烷基-、芳基-、杂芳基-、环烷基-、烷基环烷基-、杂烷基环烷基-、杂环烷基-、芳烷基-或杂芳基烷基-，并且
R16或R17互相独立地表示氢、C1-C4-烷基，或者一起为具有3或4个环原子的环烷基的一部分，
其中式(Epo)的化合物的一个氢原子被L或连接至L的键代替。
优选式(Epo)的化合物，其中T为式-C(CH3)＝CHR19或-CH＝CHR19的基团，其中R19为杂芳基-或杂芳基烷基。
进一步优选式(Epo)的化合物，其中T为式(EpoI)或(EpoII)的基团(特别是基团(EpoI))：
其中Q为硫、氧或NR21(特别是氧或硫)，其中R21为氢、C1-C4烷基或C1-C4杂烷基，z为氮或CH(特别是CH)，并且R20为OR22、NHR22、C1-C4烷基、C1-C4烯基、C1-C4炔基或C1-C6杂烷基(特别是甲基、CH2OR22或CH2NHR22)，其中R22为氢、C1-C4烷基或C1-C4杂烷基(特别是氢)。
进一步优选地，D1为C＝O，并且D2为CHOH或S(＝O)q，其中q为0、1或2。
更优选地，D1为S(＝O)p，其中p为0、1或2且D2为CHOH。
更优选式(Epo)的化合物，其中R18为氢或C1-C4烷基。
进一步优选式(Epo)的化合物，其中B为氧或NH(特别是氧)。
更优选式(Epo)的化合物，其中R15为甲基或乙基(特别是甲基)。
进一步优选式(Epo)的化合物，其中R16和R17为甲基。
更优选式(Epo)的化合物，其中U为氢、氟、甲基、三氟甲基或COOH(特别是氢)。
进一步优选式(Epo)的化合物，其中绝对立体化学与天然存在的埃坡霉素B和/或D相同。
更优选式(Epo)的化合物，其中R’为CH3或CF3。
进一步优选式(Epo)的化合物，其中D为C＝O。
优选地，L为键或者任选地被取代的亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚芳基、亚杂芳基、亚环烷基、亚杂环烷基、烷基亚环烷基、杂烷基亚环烷基、亚芳烷基或亚杂芳烷基。
进一步优选地，L为键或者亚杂烷基、杂烷基亚环烷基或亚杂芳烷基(即优选包含杂亚烷基的基团)。
在一优选实施方案中，L为选自C、N、O、S、Si和P的原子的链，其将A共价连接至Pep。L可以具有各种长度，如在约2-约100个原子的范围中。用于形成L的原子可以以所有化学相关的方式组合，如形成亚烷基、亚烯基和亚炔基等的碳原子的链；形成醚、聚氧基亚烷基，或者当与羰基组合时形成酯和碳酸酯等的碳和氧原子的链；形成胺、亚胺、聚胺、肼、腙，或者当与羰基组合时形成酰胺、尿素、氨基脲、卡巴肼等的碳和氮原子的链；形成烷氧基胺、烷氧基胺(alkoxylamine)，或者当与羰基组合时形成氨基甲酸酯、氨基酸、酰氧基胺(acyloxylamine)、异羟肟酸等的碳、氮和氧原子的链；以及许多其他选择。此外，应当理解在上述说明性实施方案的每个中形成链的原子可以是饱和或不饱和的，从而例如烷烃、烯烃、炔烃、亚胺等可以是包括在L中的基团。此外，应当理解形成L的原子还可以互相环化以形成二价环状结构，所述二价环状结构形成接头，包括接头中的环烷、环醚、环胺、亚芳基、亚杂芳基等。
进一步优选地，L包括形成至少一个可释放的接头的基团，以及任选存在的一个或多个间隔接头。如本文所用，术语可释放的接头指这样的接头，其包括至少一个可以在生理条件下破裂的键，如pH-不稳定、酸-不稳定、碱-不稳定、氧化不稳定、代谢不稳定、生物化学不稳定或酶-不稳定的键。应当理解这类导致键破裂的生理条件不必包括生物或代谢过程，相反其可以包括标准化学反应，如水解反应，例如，在生理pH下，或者是分隔 入具有比胞质pH低的pH的细胞器如核内体和/或溶酶体的结果。
进一步优选地，L为键。
更优选地，L为任选地被取代的杂烷基，其包含1-20个碳原子以及1-12个选自O、S和N的杂原子，并且其中优选的取代基为＝O和NH2。
进一步优选地，L包含-S-S-基团或者与Pep或A形成-S-S-基团。
更优选地，L包含式-S-CH2-CH2-O-C(＝O)-、-S-CH2-CH(NH2)-C(＝O)-和/或-N-CH(CO2H)-CH2-S-的基团和/或优选由选自天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸的氨基酸组成的三肽、四肽、五肽或六肽，以及它们的组合。
更优选地，L为US 2010/0004276、EP 2481427、WO 2006/012527和WO 2008/112873中描述的接头，这些文献全部援引加入本文。特别优选地，L选自EP 2 481 427 A1中段落[0039]-[0132]和权利要求6-12中描述的接头。
特别优选地，L为键或者选自以下基团：
-CH2-CH2-S-；
-O-CH2-CH2-S-；
-NH-CH2-CH2-S-；或
-NH-NH-C(＝O)-O-CH2-CH2-S-。
优选地，其中L的左侧结合至A，而右侧结合至Pep；特别优选地，基团L的硫原子结合至Pep的半胱氨酸侧链的硫原子。
进一步特别优选地，L选自以下基团：
优选地，其中L的左侧结合至A，而右侧结合至Pep。
优选地，Pep为选自以下的基团(肽残基)：
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys(XL)-β-Ala)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2；
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(Palmitoyl-Cys(XL)-β-Ala)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2；
Ac-Tyr-Pro-Ser-Lys(Palmitoyl-Cys(XL)-β-Ala)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2；
棕榈酰基-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys(XL)-β-Ala)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2；
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys(XL)-β-Ala)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2；
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys(XL)-β-Ala)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-Lys(棕榈酰基-Glu)-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2；
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys(XL)-β-Ala)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Lys(棕榈酰基-Glu)-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2；
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(XL-β-Ala-β-Ala)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2；
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(XL-β-Ala)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2；
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(XL)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu- Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2；
H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH-XL；以及
XL-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2,
其中XL表示连接至L的点。
更优选地，Pep为以下肽(PepX)：
H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2(PepX,SEQ ID NO:1),
其中在位置18(Ala)、22(Ser)和26(His)处的氨基酸中的1个、2个或3个(优选1个)可以被其他氨基酸代替，优选被天然存在的氨基酸代替，特别是被赖氨酸(Lys)、鸟氨酸(Orn)和谷氨酰胺(Gln)代替(还参见PepY,SEQ ID NO:2)，并且
其中Pep的一个氢原子被L或连接至L的键代替。
根据一优选实施方案，Pep的一个或多个氢原子可以被酰基如棕榈酰基或乙酰基代替。
优选地，酰基为式-CO-C1-20烷基、-CO-C5-20烯基的基团，或者式-CO-杂烷基的基团，其中杂烷基包含1-25个碳原子以及1-6个选自O、S和N的杂原子。优选地，所述杂烷基可以是任选地被取代的(例如被一个或多个＝O基团和/或一个或多个NH2基团)。
进一步优选地，Pep的一个或多个氢原子可以被选自以下的基团代替：聚乙二醇(聚乙二醇化)、聚谷氨酸、聚合脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸(PAS化)和羟乙基淀粉(HES化)。
优选地，聚乙二醇具有100-2,000Da的分子量。
特别优选地，Pep包含赖氨酸，并且所述赖氨酸的侧链在其氮原子处被式H-βAla-βAla-、H-Cys-βAla-、H-Cys-、棕榈酰基-Cys-或棕榈酰基-Cys-βAla- 的基团取代。在这种情况下，优选被L或连接至L的键代替的氢原子是该基团的氢原子，特别是半胱氨酸的SH基团的氢原子。
进一步优选地，Pep为以下肽(PepX)：
H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2(PepX,SEQ ID NO:1)，其中一个氢原子被L或连接至L的键代替。
更优选地，Pep为肽PepX，其中一个氢原子被L或连接至L的键代替，并且其中一个或多个其他氢原子被酰基如棕榈酰基或乙酰基代替。
进一步优选地，Pep为肽PepX，其中一个氢原子被L或连接至L的键代替，并且其中另一个氢原子被选自以下的基团代替：聚乙二醇(聚乙二醇化)、聚谷氨酸盐、聚合脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸(PAS化)和羟乙基淀粉(HES化)。
最优选具有以下式(III)的化合物，或者其药理学可接受的盐、溶剂合物、水合物或药理学可接受的制剂：
其中
R2为C1-C6烷基(特别是CH3、乙基、丙基、异丙基、异丁基、正戊基或正己基)、CH2Ph,CH2OC1-C6-烷基(特别是CH2OCH2CH3或CH2OCH2CH(CH3)2)、CH2OCOC1-C6-烷基、CH2CONHC1-C6-烷基、CH2OCOCH2Ph或CH2OCOPh；
R3为H、OAc或O-C1-C6-烷基(特别是OPr)；
R5为CH3或H；
R6为-CO-；
R14为H、F、OH、NH2、CH3、OMe或Ph；并且
L选自以下基团：
-O-CH2-CH2-S-,
-NH-CH2-CH2-S-,
-NH-NH-C(＝O)-O-CH2-CH2-S-,
其中基团L的硫原子结合至Pep；并且
Pep选自：
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys(XL)-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2；
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(棕榈酰基-Cys(XL)-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2；
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys(XL)-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-Lys(棕榈酰基-Glu)-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2；
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys(XL)-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Lys(棕榈酰基-Glu)-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2；
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys(XL)-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Lys(棕榈酰基-Glu)-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2；
乙酰基-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys(XL)-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2；或
棕榈酰基-βAla-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys(XL)-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2；
其中XL表示连接至L的键；
或者其中L为键，并且
Pep为：
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(XL-βAla-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2。
具体实施方式
术语烷基或烷(alk)指饱和的直链或支化的任选地被取代的烃基，其优选包含1-20个碳原子，优选1-12个碳原子，最优选1-6个碳原子，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2,2-二甲基丙基、2-甲基丁基、正己基、2,2-二甲基丁基或2,3-二甲基丁基。
术语烯基和炔基指至少部分不饱和的直链或支化的任选地被取代的烃基，其优选包含2-20个碳原子，优选2-12个碳原子，最优选2-6个碳原子，例如乙烯基、烯丙基、乙炔基、炔丙基、异戊烯基或己-2-烯基。优选地，烯基包含一个或两个，最优选一个双键，而炔基包含一个或两个，最优选一个三键。
任选地，术语烷基、烯基和/或炔基指其中一个或多个，优选1、2或3个氢原子被卤素原子(优选氟或氯)或2,2,2-三氯乙基或三氟甲基代替的基团。
术语杂烷基指烷基、烯基或炔基，其中一个或多个，优选1、2或3个碳原子被O、N、P、B、Se、Si或S原子代替，优选O、S或N。术语杂烷基还指羧酸或由其衍生的基团，例如，酰基(烷基-CO)、酰基烷基、烷氧基羰基、酰氧基、酰氧基烷基、羧基烷基酰胺或烷氧基羰基氧基。
杂烷基的实例有下式的基团：Ra-O-Ya-、Ra-S-Ya-、Ra-N(Rb)-Ya-、Ra-CO-Ya-、Ra-O-CO-Ya-、Ra-CO-O-Ya-、Ra-CO-N(Rb)-Ya-、Ra-N(Rb)-CO-Ya-、Ra-O-CO-N(Rb)-Ya-、Ra-N(Rb)-CO-O-Ya-、Ra-N(Rb)-CO-N(Rc)-Ya-、Ra-O-CO-O-Ya-、Ra-N(Rb)-C(＝NRd)-N(Rc)-Ya-、Ra-CS-Ya-、Ra-O-CS-Ya-、Ra-CS-O-Ya-、Ra-CS-N(Rb)-Ya-、Ra-N(Rb)-CS-Ya-、Ra-O-CS-N(Rb)-Ya-、Ra-N(Rb)-CS-O-Ya-、Ra-N(Rb)-CS-N(Rc)-Ya-、Ra-O-CS-O-Ya-、Ra-S-CO-Ya-、Ra-CO-S-Ya-、Ra-S-CO-N(Rb)-Ya-、Ra-N(Rb)-CO-S-Ya-、Ra-S-CO-O-Ya-、Ra-O-CO-S-Ya-、Ra-S-CO-S-Ya-、Ra-S-CS-Ya-、Ra-CS-S-Ya-、 Ra-S-CS-N(Rb)-Ya-、Ra-N(Rb)-CS-S-Ya-、Ra-S-CS-O-Ya-、Ra-O-CS-S-Ya-，其中Ra指H、C1-C6-烷基、C2-C6-烯基或C2-C6-炔基；其中Rb指H、C1-C6-烷基、C2-C6-烯基或C2-C6-炔基；其中Rc指H、C1-C6-烷基、C2-C6-烯基或C2-C6-炔基；其中Rd指H、C1-C6-烷基、C2-C6-烯基或C2-C6-炔基，并且Ya指直接结合、C1-C6-亚烷基、C2-C6-亚烯基或C2-C6-亚炔基，其中每个杂烷基可以被碳原子代替，并且一个或多个氢原子可以被氟或氯原子代替。杂烷基的实例有甲氧基、三氟甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、叔丁氧基、甲氧基甲基、乙氧基甲基、甲氧基乙基、甲基氨基、乙基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、异丙基乙基氨基、甲基-氨基甲基、乙基氨基甲基、二异丙基氨基乙基、烯醇醚、二甲基氨基甲基、二甲基氨基乙基、乙酰基、丙酰基、丁酰氧基、乙酰氧基、甲氧基羰基、乙氧基-羰基、N-乙基-N-甲基氨基甲酰基或N-甲基氨基甲酰基。杂烷基的其他实例有腈、异腈、氰酸酯、硫氰酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯和烷基腈基团。
术语环烷基指饱和或部分不饱和(例如环烯基)的任选地被取代的环状基团，其包含一个或多个环，优选一个或两个环，包含3-14个环碳原子，优选3-10个，优选3、4、5、6或7个环碳原子。此外，术语环烷基指其中一个或多个氢原子被F、Cl、Br、I、OH、＝O、SH、＝S、NH2、＝NH或NO2代替的基团，或者环酮，例如环己酮、2-环己烯酮或环戊酮。环烷基的实例有环丙基、环丁基、环戊烯基、螺[4,5]癸基、降龙脑基(norbornyl)、环己基、环戊烯基、环己二烯基、萘烷基、五环辛烷基(cubanyl)、二环[4.3.0]壬基、四氢化萘、环戊基环己基、氟环己基或环己-2-烯基。
术语杂环烷基指如上文所定义的环烷基，其中一个或多个，优选1、2或3个环碳原子被O、N、Si、Se、P或S代替，优选O、S或N。优选地，杂环烷基包含一个或两个环，所述环包含3-10个，优选3、4、5、6或7个环原子。此外，术语杂环烷基指其中一个或多个氢原子被F、Cl、Br、I、OH、＝O、SH、＝S、NH2或NO2代替的基团。杂环烷基的实例有哌啶基、吗啉基、乌洛托品基(urotropinyl)、吡咯烷基、四氢噻吩基、四氢吡喃基、四氢呋喃基、氧杂环丙基、氮杂环丙基或2-吡唑啉基，以及内酰胺、内酯、环状亚胺和环酐。
术语烷基环烷基指包含根据上文定义的环烷基以及烷基、烯基或炔基 的基团，例如烷基环烷基、烷基环烯基、烯基环烷基和炔基环烷基。优选地，烷基环烷基包含环烷基以及一个或两个烷基、烯基或炔基，所述环烷基包含一个或两个环，所述环包含3-10个，优选3、4、5、6或7个环碳原子，所述烷基、烯基或炔基具有1或2至6个碳原子。
术语杂烷基环烷基指按照上文定义的烷基环烷基，其中一个或多个，优选1、2或3个环碳原子被O、N、Si、Se、P或S代替，优选O、S或N。优选地，其包含一个或两个环系统以及一个或两个烷基、烯基、炔基或杂烷基，所述环系统具有3-10个，优选3、4、5、6或7个环原子，所述烷基、烯基、炔基或杂烷基具有1或2至6个碳原子。这样的基团的实例有烷基杂环烷基、烷基杂环烯基、烯基杂环烷基、炔基杂环烷基、杂烷基环烷基、杂烷基杂环烷基和杂烷基杂环烯基，其中环状基团是饱和或部分(单、二或三)不饱和的。
术语芳基或芳(ar)指任选地被取代的芳香基团，其包含一个或多个环，所述环包含6-14个碳原子，优选6-10个，优选6个碳原子。术语芳基或芳(ar)还可以指芳香基团，其中一个或多个H原子被F、Cl、Br或I或者OH、SH、NH2或NO2代替。实例有苯基-、萘基-、联苯基-、2-氟苯基、苯胺基-、3-硝基苯基或4-羟基-苯基。
术语杂芳基指芳香基团，其包含一个或多个环，所述环包含5-14个环原子，优选5-10个，其中一个或多个，优选1、2、3或4个为O、N、P或S环原子，优选O、S或N。术语杂芳基还可以指基团，其中一个或多个H原子被F、Cl、Br或I或者OH、SH、NH2或NO2代替。实例有4-吡啶基、2-咪唑基、3-苯基吡咯基、噻唑基、噁唑基、三唑基、四唑基、异噁唑基、吲唑基、吲哚基,、苯并咪唑基、哒嗪基、喹啉基、嘌呤基、咔唑基、吖啶基、嘧啶基、2,3′-二呋喃基、3-吡唑基和异喹啉基。
术语芳烷基(或芳基烷基或烷基芳基)指包含芳基以及烷基、烯基、炔基和/或环烷基的基团，例如芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、芳基环烷基、芳基环烯基、烷基芳基环烷基和烷基芳基环烯基。芳烷基的实例有甲苯、二甲苯、三甲苯(mesitylene)、苯乙烯、苄基氯、邻氟甲苯、1H-茚、四氢化萘、二氢萘、2,3-二氢-1-茚酮、苯基环戊基、枯烯、环己基苯基、芴和茚满。优选地，芳烷基包含一个或两个芳环以及一个或两个烷基、烯基和/或炔基 和/或一个环烷基，所述芳环包含6-10个环碳原子，所述烷基、烯基和/或炔基包含1或2至6个碳原子，所述环烷基包含5或6个环碳原子。
术语杂芳烷基(或杂芳基烷基或杂烷基芳基)指如上文所定义的芳烷基，其中一个或多个，优选1、2、3或4个碳原子被O、N、Si、Se、P、B或S代替，优选O、N或S，并且指包含芳基、杂芳基以及烷基、烯基、炔基和/或杂烷基和/或环烷基和/或杂环烷基的基团。优选地，杂芳烷基包含一个或两个芳环系统以及一个或两个烷基、烯基和/或炔基和/或一个环烷基，所述芳环系统包含5或6至10个碳原子，所述烷基、烯基和/或炔基包含1或2至6个碳原子，所述环烷基包含5或6个环碳原子，其中1、2、3或4个碳原子可以被O、N或S代替。
实例有芳基杂烷基、芳基杂环烷基、芳基杂环烯基、芳基烷基杂环烷基、芳基烯基杂环烷基、芳基炔基杂环烷基、芳基烷基杂环烯基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂芳基杂烷基、杂芳基环烷基、杂芳基环烯基、杂芳基杂环烷基、杂芳基杂环烯基、杂芳基烷基环烷基、杂芳基烷基杂环烯基、杂芳基杂烷基环烷基、杂芳基杂烷基环烯基以及杂芳基杂烷基杂环烷基，其中环状基团可以是饱和的，或者单、二、三或四不饱和的。实例有四氢异喹啉基、苯甲酰基、2-或3-乙基-吲哚基、4-甲基吡啶并、2-,3-或4-甲氧基苯基、4-乙氧基苯基、2-,3-或4-羧基苯基烷基。
术语环烷基、杂环烷基、烷基环烷基、杂烷基环烷基、芳基、杂芳基,芳烷基和杂芳烷基还指基团，其中一个或多个H原子被F、Cl、Br或I或者OH、SH、NH2或NO2代替。
术语“任选地被取代”涉及基团，其中一个或多个H原子可以被F、Cl、Br或I或者OH、＝O、SH、＝S、NH2、＝NH或NO2代替。该术语进一步涉及基团，其可以唯一或额外地被未取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C10环烷基、C2-C9杂环烷基、C6-C10芳基、C1-C9杂芳基、C7-C12芳烷基或C2-C11杂芳烷基取代。
保护基团是本领域技术人员已知的，并且如P.J.Kocienski,Protecting Groups,Georg Thieme Verlag,Stuttgart,1994和T.W.Greene,P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley&Sons,New York,1999所述。常见的氨基保护基团例如叔丁氧基羰基(Boc)、苄氧基羰基(Cbz,Z)、苄 基(Bn)、苯甲酰基(Bz)、芴基甲氧基羰基(Fmoc)、烯丙氧基羰基(Alloc)、三氯乙氧基羰基(Troc)、乙酰基或三氟乙酰基。
本文所述的化合物可以包含多个手性中心，这取决于它们的取代模式。本发明涉及所有定义的对映异构体和非对映异构体以及它们的所有比例的混合物。此外，本发明涉及本文所述化合物的所有顺式/反式异构体以及它们的混合物。此外，本发明涉及本文所述化合物的所有互变异构形式。
本文所述化合物的药理学可接受的盐的实例有生理上可接受的无机酸的盐，例如盐酸、硫酸和磷酸；或者有机酸的盐，例如甲磺酸、对甲苯磺酸、乳酸、甲酸、三氟乙酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸、马来酸和水杨酸。本文所述化合物可以是溶剂化的，特别是水合的。水合可以在合成过程中发生，或者可以是本文所述的初始无水化合物的吸湿性的结果。如上文所提到的，包含不对称碳原子的本文所述的化合物可以作为非对映体的混合物、作为对映体的混合物或作为旋光纯的化合物存在。
本发明的药物组合物包含至少一种本文所述的化合物以及任选存在的载体和/或佐剂。
前药也是本发明的主题，它们包含本文所述的化合物和至少一种药理学可接受的保护基团，所述保护基团在生理条件下被切割，例如烷氧基、芳烷基氧基、酰基或酰氧基，更精确地，乙氧基、苄氧基、乙酰基或乙酰氧基。
本文所述的化合物、它们的药理学可接受的盐和/或溶剂合物和水合物以及相应的制剂和药物组合物的治疗用途也是本发明的主题。
本文所述化合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途也是本发明的主题。此外，本发明的化合物可用于预防和/或治疗类风湿性关节炎、炎性疾病、免疫疾病(例如I型糖尿病)、自身免疫性疾病、眼部疾病如AMD(年龄相关性黄斑疾病)或糖尿病性视网膜病变、其他肿瘤疾病以及用于塑料和金属植入物如支架的表面处理(浸渍)。
特别地，本文所述的化合物可用于癌症的治疗，例如其中NPY-1受体过量表达的癌症类型，如乳腺癌，特别是转移性乳腺癌，还有其他癌症疾病状况如尤文肉瘤、肾细胞癌、胃肠道间质瘤、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、副神经节瘤、嗜铬细胞瘤、肾上腺皮质瘤、卵巢性索间质肿瘤和卵巢 腺癌。
一般来说，本文所述的化合物可以作为单一治疗或作为综合治疗单独或与任意治疗物质联合根据已知并接受的模式给药，或者作为连续治疗，其中有效成分可以包埋在基质中，例如可植入的水凝胶。
本发明的组合物可以以下方式之一给药：溶液剂、乳剂或混悬剂；肠胃外，包括可注射的溶液剂；通过吸入，包括粉末制剂或者如喷雾剂、透皮或鼻内。为了制备液体溶液剂和糖浆剂，可以使用载体，例如水、醇、盐水溶液、葡萄糖水溶液、多元醇、甘油、植物油、石油、动物油或合成油。为了制备栓剂，可以使用赋形剂，例如植物油、石油、动物油或合成油、蜡、脂肪以及多元醇。对于气溶胶制剂，可以使用适合这个目的的压缩气体，例如氧气、氮气、稀有气体和二氧化碳。药学有用的物质还可以包含用于保存、稳定的添加剂，例如UV稳定剂、乳化剂、甜味剂、芳化剂、改变渗透压的盐、缓冲剂、包衣添加剂以及抗氧化剂。
与其他治疗剂的组合可以包括常用来治疗上文所提到的疾病，特别是癌症的其他物质。
式(I)、(II)和(III)的化合物可以例如制备自构件，所述构件可以利用已知的偶联试剂如羟基苯并三唑(HOBt)和二异丙基碳二亚胺(DIC)或二环己基碳二亚胺(DCC)通过肽偶联方法连接。除非另有定义，所有残基均如上文所定义。
Tubulysine及其衍生物是本领域技术人员已知的，并且可以如WO 2008/138561、WO 2004046170、WO 2004/005327、WO 2011/057806、WO 2011/057805以及其中引用的文件所述进行制备。
埃坡霉素及其衍生物是本领域技术人员已知的，并且可以如Nicolaou et al.Angew.Chem.Int.Ed.1998,37,2014-2045、WO 2004/007492、WO 2004/048372以及其中引用的文件所述进行制备。
实施例
以下衍生物合成自构件A、L和Pep。根据本领域技术人员已知的方法合成构件。
Pep的自动化固相肽合成
根据Fmoc/tBu策略利用自动化多固相肽合成仪Syro II(MultiSynTech GmbH,Bochum,Germany)合成肽。为了获得C-端肽酰胺，使用具有0.63mmol/g的承载能力的Rink酰胺树脂。
在每个氨基酸偶联步骤之前，必须从构件切除碱不稳定的Nα-保护基团，并且在来自Rink酰胺树脂的第一步中也是如此。对于Fmoc切割，将400μL DMF中的哌啶(40％v/v)添加至树脂中，并且在搅拌的同时温育3min。用400μL DMF中的哌啶(20％v/v)重复去保护10min。随后，将树脂用4x 600μL DMF洗涤。
通过用200μL氨基酸构件溶液(DMF中0.5M)和100μL DMF中的3M Oxyma预温育2min来偶联氨基酸。随后，添加100μL DMF中的3.3M DIC，并且允许反应在搅拌下进行40min。用800μL DMF的洗涤步骤之后，对每个氨基酸重复一次偶联步骤。
对于Dde-保护的赖氨酸残基的选择性去保护，将完全保护的树脂结合的肽与1mL新鲜制备的DMF中的3％肼温育12x 10min。在12个步骤中的每个之后，将树脂用DMF洗涤。在第1个和第12个步骤之后，收集去除的肼溶液，并且在301nm处对照DMF中的新鲜肼参考测量其吸收。如果第10个部分的吸收<0.1，则Dde去保护成功。
从树脂分析和制备切割
为了分析目的，将少量肽-负载的树脂与TFA/茴香硫醚/1,2-乙二硫醇(900:70:30v/v)在室温下温育3h，去除所有酸不稳定的保护基团。随后，将肽在-20℃下于1mL冰冷的二乙醚中沉淀20min，通过离心(在7,000g下2min)收集，并且用冰冷的二乙醚洗涤至少5次。将肽颗粒干燥，最后溶于100μL H2O/tBuOH(1:3v/v)中用于分析。
对于制备切割，如所述处理全部树脂。但是，在10mL冰冷的二乙醚中发生沉淀，并且在4,400g下进行离心。利用SpeedVac干燥肽，并且最后从1–2mL H2O/tBuOH(1:3v/v)冷冻干燥。
分析RP-HPLC
在反相Phenomenex Jupiter Proteo C18柱(4.6mm x 250mm,5μm)上通 过分析RP-HPLC分析合成的肽，并且使用包含(A)H2O中的0.1％TFA和(B)ACN中的0.08％TFA的洗脱系统。在40min中使用A中的20-70％溶剂B的线性梯度，流速0.6mL min-1。在220nm处检测肽。
制备RP-HPLC
在Phenomenex Jupiter Proteo C18柱(21.2mm x 250mm)上通过制备RP-HPLC完成合成肽的纯化，使用包含(A)H2O中的0.1％TFA和(B)ACN中的0.08％TFA的洗脱系统，以及40-50min中和流速10mL min-1的适当的A中的溶剂B的线性梯度。对于肽检测，测量在220nm处的吸收。手工采集级分并通过MALDI-TOF质谱分析法和分析RP-HPLC进行分析。将纯的鉴定的级分合并且冷冻干燥。
MALDI-TOF质谱分析法
对于利用MALDI-TOF质谱分析法进行质量分析，使用包含2,5-二羟基苯甲酸和2-羟基-5-甲氧基苯甲酸(在ACN/H2O/TFA 50:49.7:0.3v/v中10g/L)的基质。将Bruker Daltonis Ultraflex III TOF/TOF用于MALDI测量。
ESI离子阱质谱分析法
对于利用ESI离子肼质谱分析法进行质量分析，将样品用ACN(7:3v/v)在H2O(0.1％HCOOH)中稀释至20μM，注射并分析。将Bruker HCT质谱仪用于ESI测量。
构件A-L通过二硫键偶联至Pep
为了将OC169、OC503、OC504、OC505、OC506通过二硫键偶联至K4(βAla-Cys)-[F7,P34]-NPY，根据(pH 6.0)将纯化的肽溶于0.1mM磷酸盐缓冲液中，并且利用氩气脱气。在等摩尔条件(A-L和肽)下于室温下进行偶联反应。60min之后反应完成，通过MALDI-TOF质谱分析法证实产物性质。立即通过制备RP-HPLC纯化产物。
构件A-L通过肽键偶联至Pep
为了将OC501或OC503通过肽键偶联至K4(βAla-βAla)Cys)-[F7,P34]-NPY或[K4,F7,P34]-NPY，在所述赖氨酸残基的选择性去保护之后如上文所述使用标准酰胺偶联。在等摩尔条件(A-L和肽)下于室温下进行偶联反应。随后，从树脂切割最终产物。通过MALDI-TOF质谱分析法证实产物性质。立即通过制备RP-HPLC纯化产物。
功能受体激活(信号转导)
为了评价NPY-衍生的肽-药物缀合物功能性激活hY1R以及仅轻微程度激活hY2R的能力，进行两种不同类型的基于细胞的测定。功能IP3第二信使测定以及功能报道基因测定(使用cAMP反应元件-CRE)。
对于IP3第二信使测定，将用编码C-端融合至EYFP的人Y1受体和C-端融合至EYFP的人Y2受体以及嵌合G蛋白GαΔ6qi4myr(Cos7_hY1R_EYFP_GαΔ6qi4myr和Cos7_hY2R_EYFP_GαΔ6qi4myr)的cDNA稳定转染的Cos-7细胞接种入24孔-板。接种之后24小时，将细胞用3H-myo-肌醇溶液(300μl DMEM/0.6μl 3H-myo-肌醇每孔)温育16小时。随后，去除细胞培养基，并且将细胞用500μl包含10mM LiCl的DMEM洗涤。1小时之后，用包含10mM LiCl的DMEM中的不同肽浓度(10-5-10-12M)进行刺激。积累3H-磷酸肌醇。刺激之后，将样品用150μl的0.1N NaOH水解5分钟。通过添加50μl的0.2M甲酸来进行中和。随后在IP稀释缓冲液中稀释样品，并且用移液器去除细胞颗粒。通过阴离子交换色谱分离3H-磷酸肌醇。
通过分别用编码C-端融合至EYFP的人Y1受体和C-端融合至EYFP的人Y2受体的cDNA以及CRE报道载体pGL4.29(Promega GmbH,Mannheim,Germany)瞬时共转染CHO细胞来进行CRE报道基因测定。为了这个目的，每25cm2细胞培养瓶接种2.5·106个CHO细胞，并且允许其粘附过夜。随后，利用10μg的hYxR载体、2μg的pGL4.29报道载体和25μL的Pro转染试剂(Biontex Laboratories GmbH,Martinsried,Germany)每培养瓶进行细胞的共转染。在标准生长条件下于PBS中转染3小时之后，丢弃转染溶液，使转染的细胞脱离并接种在白色/透明底96-孔板中(50,000细胞/孔)。为了允许受体和报道基因表达，将细胞在标准生长 条件下培养48小时。随后，将细胞用10-6M毛喉素(cAMP升高的腺苷酸环化酶激活物)和10-11-10-5M所研究的肽/肽-药物缀合物共刺激(通过激活的hYx受体的Gαi-介导的信号转导降低cAMP水平)。在37℃下刺激6小时之后，去除温育培养基，并且添加60μL/96-孔的Promega`s ONE-GloTM试剂(DMEM中1:1,v/v)。在室温下温育10min之后，利用Synergy 2多孔板读数器(BioTek,Bad Friedrichshall,Germany)测量报道基因产生的发光信号。
内化研究
将用C-末端融合至EYFP的人Y1受体(HEK293_hY1_EYFP)以及C-端融合至EYFP的人Y2受体和HA标签(HEK293_HA_hY2_EYFP)稳定转染的HEK293细胞接种入无菌的μ-载片8孔-板(ibidi GmbH,Martinsried,Germany)，并且培养直至达到80％汇合。在配体刺激之前将细胞在OptiMEM中培养30分钟。将细胞核用HOECHST 33342核染料染色。在37℃下将细胞用OptiMEM中的1μM NPY刺激60分钟。用Axio Observer显微镜和ApoTome成像系统(Zeiss,Jena,Germany)获得活细胞图像。用Zeiss Axio Viosion软件Release 3.0分析荧光图像。
微管蛋白网络的去稳定
将用C-末端融合至EYFP的人Y1受体(HEK293_hY1_EYFP)以及C-端融合至EYFP的人Y2受体和HA标签(HEK293_HA_hY2_EYFP)稳定转染的HEK293细胞接种入无菌的μ-载片8孔-板(ibidi GmbH,Martinsried,Germany)，并且在37℃下培养。将细胞用pTub_ECFP_C1转染(1μg DNA/孔，1μl Lipofectamine 2000/孔，在37℃下转染60min)。允许微管蛋白_ECFP表达过夜。第二天，将细胞用OC500或游离的溶细胞素在OptiMem中刺激16h。用Axio Observer显微镜和ApoTome成像系统(Zeiss,Jena,Germany)获得活细胞图像。用Zeiss Axio Viosion软件Release 3.0分析荧光图像。
缓冲液中的稳定性研究
将K4(βAla-Cys-OC169)-F7,P34-NPY在0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH 4和6以及0.2M乙酸钠缓冲液，pH 4中稀释至10-4M。在0h、1h、2h、4h、6h、24h、72h和96h之后通过ESI质谱分析法确定肽性质。
MCF-7细胞培养上清中的稳定性研究
将K4(βAla-Cys-OC169)-F7,P34-NPY在MCF-7细胞培养上清中稀释至10-4M，并且在0h、1h、3h、5h、7h和24h之后通过ESI质谱分析法确定肽性质。
还原环境中的稳定性研究
将K4(βAla-Cys-OC169)-F7,P34-NPY在0.1M磷酸盐缓冲液，pH 6中的20x半胱氨酸中稀释至10-4M。在1h和24h之后通过ESI质谱分析法确定肽性质。
细胞增殖测定
为了分别评价所述化合物的抗增殖和细胞毒性效果，使用基于荧光刃天青的细胞活力测定。将人癌和非癌细胞系(主要是乳腺癌)以低密度接种入96-孔板(1,500–20,000个细胞/孔)，并且允许其粘附24h。随后，将在培养基中溶解至适当浓度的化合物添加至细胞中，并且温育4-72h。在化合物处理短于72h的情况下，丢弃温育溶液，将细胞用细胞培养基漂洗一次，并且允许其在不含化合物的培养基中增殖直至达到72h。随后，用培养基中的50μM刃天青替换培养基，并且将细胞培养2h。最后，利用Synergy2多孔板读数器(BioTek,Bad Friedrichshall,Germany)用540nm激发和590nm发射滤镜设置测量通过活的代谢活性细胞将刃天青转化为试卤灵。
凋亡测定
利用可商购的发光胱天蛋白酶测定(Promega,Mannheim,Germany)检测化合物介导的凋亡诱导。将人癌和非癌细胞系(主要是乳腺癌)以一定密度(取决于温育时间)接种入96-孔板(对于48h温育，5,000–20,000个细胞/孔；对于16–24h温育，15,000–40,000个细胞/孔)，并且允许其粘附24h。随 后，将在培养基中溶解至适当浓度的化合物以70μL/孔添加至细胞中。将细胞在标准生长条件下温育16–48h。对于温育的最后一小时，添加10μL/孔的8X刃天青溶液(400μM)以用细胞数量/细胞活力乘以胱天蛋白酶活性。当温育结束时，如上文所述测量刃天青转化为试卤灵。之后，根据Promega的指导添加胱天蛋白酶-Glo试剂，并且在室温下温育1h。利用Synergy 2多孔板读数器(BioTek,Bad Friedrichshall,Germany)进行发光读数。
因为核的片段化也表明正在进行的凋亡事件，所以我们检测了CytoPep缀合物是否能够诱导核片段化。为了这个目的，将用C-末端融合至EYFP的人Y1受体(HEK293_hY1_EYFP)以及C-端融合至EYFP的人Y2受体和HA标签(HEK293_HA_hY2_EYFP)稳定转染的HEK293细胞接种入无菌的μ-载片8孔-板(ibidi GmbH,Martinsried,Germany)，并且培养至80％汇合。将细胞用OC500或游离的溶细胞素在OptiMem中刺激16h。利用HOECHST 33342核染料将核染色。用Axio Observer显微镜和ApoTome成像系统(Zeiss,Jena,Germany)获得活细胞图像。用Zeiss Axio Viosion软件Release 3.0分析荧光图像。
利用siRNA的Y受体敲低
为了检测化合物的生物效应依赖于细胞表面上的hY1受体密度，将siRNA用于瞬时NPY1R敲低。为了特异性靶向，使用siGENOME SMART池人NPY1R以及作为对照的siGENOME非靶向siRNA池#2(Dharmacon,Lafayette,USA)。
将表达人Y1受体的乳腺癌细胞系接种于25cm2培养瓶中，以便在～24h之后达到～50％汇合用于细胞转染。利用Metafectene Pro(Biontex)进行瞬时、脂质体细胞转染。简单地说，每25cm2培养瓶将0–400pmol siRNA在500μL PBS中于室温下预温育5min，随后，与500μL PBS中的32μL Metafectene Pro温和混合。在室温下络合20min之后，将转染混合物添加至4mL新鲜培养基(具有4–5％FCS，代替10％)每培养瓶中。
24h之后停止温育，并且如所示使用转染的细胞。对于增殖或凋亡研究，将细胞接种入96-孔板。为了评价受体表达水平，收获细胞并进行RNA提取以及RT-PCR。
利用RT-PCR的表达分析
通过利用Bio&Sell(Feucht,Germany)RNA Mini Kit和Qiagen`s(Hilden,Germany)RNeasy Mini Kit进行RNA提取，然后DNase I消化步骤以及利用RevertAid Premium Reverse Transcriptase(Fermentas,St.Leon-Rot,Germany)进行cDNA合成来制备用于表达分析的样品。所有方法均根据制造商的指导进行。最后，利用适当的引物和常规PCR以及定量实时PCR(qPCR)利用Bio-Rad(München,Germany)CFX96TM实时PCR检测系统分析NPY Y受体、雌激素和孕酮受体等的表达。对于qPCR，根据制造商的指导使用Bio-Rad`s SsoFast EvaGreen Supermix。
在细胞培养中通过氨基酸的稳定同位素标记(SILAC)
SILAC用于检测细胞中化合物介导的蛋白失调。在第一步中，对于所用细胞系确定13C-标记的L-精氨酸(“重”培养基)的掺入率。
当掺入率≥95％时，化合物温育(例如24h)开始，“轻”培养基用于未处理的参考，而“重”培养基用于处理的细胞。完成温育之后，将细胞收获并裂解。定量蛋白含量，将20μg“轻”-标记的蛋白提取液与20μg“重”-标记的蛋白提取物混合并在12％SDS-PAGE上分离。将凝胶切为凝胶片并用胰蛋白酶进行凝胶内消化。用装有nano-HPLC的LTQ Orbitrap Velos(Thermo Scientific)测量样品。利用MaxQuant软件分析所得的质谱数据。归一化的比例“重”/“轻”用来鉴定显著上调或下调的蛋白(上调>1.5；下调<0.666)。
数据分析
对于数据分析，使用GraphPad Prism 5.03和LibreOffice Calc。
动物异种移植研究
对于体内效力研究，使用NMRI裸鼠中的皮下人乳腺癌(MDA-MB-468)和皮下人尤文氏肉瘤(SK-N-MC)异种移植模型。当以5x106个细胞/小鼠接种肿瘤细胞时(200μL的PBS中的细胞悬浮液，在右侧注射2.5x107个细胞/mL)，雌性NMRI裸鼠(Janvier,Saint Berthevin Cedex,France)为7周。
每个实验组包含5只动物(未处理的参考组和OC化合物处理组)。以肿 瘤体积～100mm3(范围70–130mm3)开始处理。在侧面尾静脉中以1–4μmol/kg的剂量(在无菌PBS；应用体积5mL/kg)iv处理动物3x每周，持续2周。最后处理之后，再观察动物3周。
研究的参数为：存活、临床表现和动物行为(每天)、体重和肿瘤体积(2x每周)。通过卡尺测量来监测肿瘤生长，并且根据式W2xL/2(L＝长度，而W＝肿瘤的垂直宽度，L>W)计算肿瘤体积。
在研究结束时，进行尸检，确定原发肿瘤净重，并且采集血清和肿瘤样品。
如上文所述合成Pep1和Pep2。
如上文给出的文献所述制备tubulysin衍生物。
Pep1:
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-βAla-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2
计算的平均分子量：4397.86
分子式：C201H299N55O57
MS-TOF:4396.1[M+H]+
Pep2(OC 502):
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2
计算的平均分子量：4429.924
分子式：C201H299N55O57S
MS-ESI:1108.3[M+4H]4+；MS-TOF:4428.2[M+H]+
Pep3(OC 522):
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(棕榈酰基-Cys-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2
计算的平均分子量：4668.333
分子式：C217H329N55O58S
MS-ESI:1557.0[M+3H]3+
Pep4(OC 523):
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-Lys(棕榈酰基-Glu)-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2
计算的平均分子量：4788.48
分子式：C217H334N54O58S
MS-ESI:1198.1[M+4H]4+
Pep5(OC 524):
H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Lys(棕榈酰基-Glu)-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2
计算的平均分子量：4680.32
分子式：C219H333N55O59
MS-TOF:4678.5[M+H]+
Pep6(OC 525):
H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Lys(棕榈酰基-Glu)-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2
计算的平均分子量：4664.3
分子式：C203H301N55O58S
MS-ESI:778.3[M+6H]6+
Pep7(OC 502Ac):
乙酰基-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp- Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2
计算的平均分子量：4471.961
分子式：C203H301N55O58S
MS-TOF:4470.1[M+H]+
Pep8(OC 531):
棕榈酰基-βAla-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2
计算的平均分子量：4739.41
分子式：C220H334N56O59S
MS-TOF:4737.6[M+H]+
OC 501:
计算的平均分子量：773.997
分子式：C40H60FN5O7S
MS-ESI:774.6[M+H]+
OC 169:
计算的平均分子量：942.28
分子式：C47H68FN7O6S3
MS-ESI:942.6[M+H]+
OC 506:
计算的平均分子量：1001.304
分子式：C48H69FN8O8S3
MS-ESI:501.3[M+2H]2+；MS-TOF:999.4[M+H]+
OC 503:
计算的平均分子量：756.05
分子式：C41H65N5O6S
MS-ESI:756.4[M+H]+
OC 504:
计算的平均分子量：924.332
分子式：C48H73N7O5S3
MS-ESI:924.7[M+H]+
OC 505:
计算的平均分子量：925.317
分子式：C48H72N6O6S3
MS-ESI:925.7[M+H]+
OC 509:
计算的平均分子量：727.95
分子式：C38H57N5O7S
MS-ESI:928.1[M+H]+
OC 515:
计算的平均分子量：772.05
分子式：C41H65N5O7S
MS-ESI:772.4[M+H]+
OC 516:
计算的平均分子量：940.33
分子式：C48H73N7O6S3
MS-ESI:470.8[M+2H]2+
OC 517:
计算的平均分子量：1012.35
分子式：C50H73N7O9S3
MS-ESI:506.8[M+2H]2+
OC 175:
计算的平均分子量：5135.85
分子式：C241H358N60O63S
MS-ESI:1028.0[M+5H]5+
OC 500:
计算的平均分子量：5261.039
分子式：C243H362FN61O63S3
MS-ESI:1053.0[M+5H]5+；MS-TOF:5258.5[M+H]+
OC 508:
计算的平均分子量：5320.063
分子式：C244H363FN62O65S3
MS-TOF:5317.5[M+H]+
OC 510:
计算的平均分子量：5243.09
分子式：C244H367FN61O62S3
MS-TOF:5242.8[M+H]+
OC 511:
计算的平均分子量：5244.08
分子式：C244H366FN60O63S3
MS-ESI:1049.6[M+5H]5+
OC 518:
计算的平均分子量：5259.09
分子式：C244H367N61O63S3
MS-ESI:1052.6[M+5H]5+
OC 519:
计算的平均分子量：5331.11
分子式：C246H367N61O66S3
MS-TOF:5331.5[M+H]+
OC 529:
计算的平均分子量：5314.13
分子式：C246H368N62O64S3
MS-ESI:1063.7[M+5H]5+
OC 528:
计算的平均分子量：5569.52
分子式：C262H397N61O67S3
MS-ESI:929.1[M+6H]6+
抗增殖/细胞毒性活性
利用荧光细胞增殖测定评价本发明的新分子的细胞抑制/细胞毒性效应。将一组细胞系(它们的大部分为乳腺癌)用化合物处理4–72小时。在任何情况下，在72小时之后进行细胞活力的荧光读出。特别地，对于本发明的肽-药物缀合物，具有6小时初始处理的测定比72小时处理更有意义，因为6小时处理预期减少的肽缀合物的体内半衰期。
Tubulysin A和紫杉醇已用作参考。72h处理的结果在表1中示出，显示与参考化合物紫杉醇相比，在T-47D细胞中游离毒素如OC 515的效力高达300倍。甚至接头-激活的化合物(例如OC 517)的活性比紫杉醇也高几倍(还参见图1)。
表1：72h化合物处理之后在细胞增殖测定中确定的IC50值
图1示出各种细胞系的细胞增殖的抑制。MCF-7、T-47D、MDA-MB-231 和MDA-MB-468为乳腺癌细胞，184B5为化学永生化的乳腺细胞系，SK-N-MC为尤文氏肉瘤家族的细胞系，而HEK293细胞来自人胚肾(非癌症，但是未分化的)。将细胞用OC517处理72小时。利用基于刃天青的细胞活力测定检测细胞增殖。化合物的效果表示为IC50值。
本发明的肽-药物缀合物显示在72小时处理之后IC50值分别在中-纳摩尔(例如OC 500、OC 508、OC 529)或低-纳摩尔范围(例如OC 519、OC 528)中。基础核心肽单独(分别为OC 502和OC 522)显示没有细胞毒性。
图2示出各种乳腺癌细胞系的细胞增殖抑制，(A)MCF-7、(B)T-47D、(C)MDA-MB-231和(D)MDA-MB-468。将细胞用OC501及其相应的衍生物OC169和OC500，以及基础核心肽OC502处理72小时。72h之后利用基于刃天青的细胞活力测定检测细胞增殖。化合物的效果表示为IC50值。
在表2中，对几种肽-药物缀合物给出IC50值，在6小时的初始细胞处理和随后的细胞增殖72小时之后检测。由于这类分子减少的半衰期，这个测定设计更有预测性。IC50值统计计算自图3中对OC 519和OC 528示例性示出的曲线。
表2总结6h的初始化合物处理的细胞增殖测定中72h之后确定的IC50值
图3显示通过OC519(A)和棕榈酰化(palmitoylated)的类似物OC528(B)抑制各种细胞系的细胞增殖。MCF-7为乳腺癌细胞，184B5为化学永生化的乳腺细胞系，SK-N-MC为尤文氏肉瘤家族的细胞系，而HEK293细胞来 自人胚肾(非癌症，但是未分化的)。将细胞用OC528初始处理6小时。随后，将温育培养基更换为不含化合物的培养基，并且将细胞培养直至达到72小时。最后，利用基于刃天青的细胞活力测定检测细胞增殖。化合物的效果表示为IC50值。
甚至在仅6小时处理，然后增殖72小时之后，OC 528表现出非常高的抗增殖/细胞毒性活性，IC50值在低-纳摩尔范围中。如通过RT-qPCR确定的，表2中示出的所有肽-药物缀合物的活性与几种细胞系的hY1受体表达水平良好负相关：SK-N-MC>MCF-7>T-47D>MDA-MB-468>MDA-MB-231>184B5>HEK293(hY1R-缺陷的)。
一般来说，本发明的肽-缀合物在激素受体阳性乳腺癌细胞(例如MCF-7和T-47D代表的管腔型)，以及特别地三阴性和基底样乳腺癌类型(由MDA-MB-468和MDA-MB-231代表)的治疗中有效，如果细胞表达hY1受体。此外，任何其他hY1R过量表达的肿瘤细胞，例如尤文氏肉瘤(由SK-N-MC代表)可利用本发明的新肽-药物缀合物治疗。
信号转导
为了评价肽/肽-药物缀合物功能激活hY1受体的能力，作为受体-配体内化和药物活性的基本前提，利用IP3第二信使测定和使用cAMP反应元件(CRE)信号传导的报道基因测定进行功能受体信号转导测定。通过与hY2受体的激活进行比较来评价本发明的新分子的NPY Y1受体选择性。
IP3第二信使测定
图4示出如利用功能IP3测定确定的，通过NPY以及CytoPep缀合物OC500和OC508功能激活人Y1和Y2受体。
表3总结了利用功能IP3测定确定的通过NPY衍生物以及CytoPep缀合物OC500和OC508的Y受体激活的EC50值。
如通过IP3第二信使测定确定，且如图4和表3所示，OC500以亚纳摩尔EC50激活人Y1受体，并且与人Y2受体相比是高度hY1R选择性的。据显示OC508以低-纳摩尔EC50激活人Y1受体，即与人Y2受体相比好约50倍。
CRE报道基因测定
图5示出如利用功能报道基因测定确定的，通过天然NPY(非选择性的)和hY1R-选择性NPY衍生物OC502(本发明的肽-药物缀合物的核心肽)功能激活人Y1和Y2受体。
如图5所示，作为参考的天然Y受体配体NPY对hY1R和hY2R均相当地活化，表明其作用的非选择性模式。相比之下，据发现本发明的几乎所有肽和肽-药物缀合物(除了OC 175、OC 524和OC 525)的基础核心肽OC502是高度hY1R-选择性的。
图6示出如利用功能报道基因测定确定的，通过棕榈酰化的肽OC522、OC 523、OC524和OC525(OC502的衍生物)功能激活人Y1和Y2受体。
棕榈酰化的NPY衍生物OC 522、OC 523、OC 524和OC 525功能激活hY1R和hY2R的能力分别在图6中示出。对hY1R的EC50在任何情况下均为低-纳摩尔或亚-纳摩尔。由于非常不同的对hY2R的活性，关于它们的hY1R选择性，棕榈酰化的肽明显不同。OC 522具有最高的hY1R选择性，而OC 525最低(与hY2R相比，分别为好～100倍和～5倍的EC50)。
如图7所示，检测到肽-药物缀合物OC 500、OC 508、OC 519和OC 528以低-或亚-纳摩尔范围中的EC50值激活hY1R。由于其对hY2R的活性较弱， 约500nM或更高，因此在任何情况下均给出强hY1R选择性。
图7示出如利用功能报道基因测定确定的，通过肽-药物缀合物OC500、OC508、OC519和OC528功能激活人Y1和Y2受体。
表4总结了利用功能CRE报道基因测定确定的通过NPY衍生物以及CytoPep缀合物OC500和OC508的Y受体激活的EC50值。
内化研究
荧光显微镜内化研究显示对于[F7,P34]-NPY和OC500，人Y1受体通过胞吞途径选择性细胞内化。通过EYFP-标记的受体(以深灰色显示)从质膜重新定位至胞内小泡显示，内源和非选择性的配体NPY与全部4种Y受体种类结合并内化。对于[F7,P34]-NPY和OC500，与未处理的参考相比，对表达hY1受体的细胞观察到这种重新定位，对那些表达hY2的细胞未观察到，并且对那些表达hY4或hY5受体的细胞观察到很小程度。
荧光显微术研究示出肽-介导的人Y受体种类的细胞内化。将分别稳定表达EYFP-标记的人Y1,Y2,Y4和Y5受体的HEK293细胞用1μM的天然配体NPY、Y1受体选择性肽[F7,P34]-NPY和OC500处理1h。用Axio Observer显微镜和ApoTome成像系统(Zeiss,Jena,Germany)采集活细胞图像。未刺激(对照)的分别稳定表达YFP-标记的Y1、Y2、Y4和Y5受体的显微图片显示受体种类清楚定位于细胞膜中，通过受体-融合的EYFP的荧光可见。当NPY刺激时，由于受体内化入细胞，在细胞表面的来自受体的荧光减少。相反，受体荧光在细胞内的小泡中清楚可见，表明配体-介导的受体内化。用[F7,P34]-NPY处理细胞仅显示NPY Y1受体的显著受体内化。与未刺激的对照细胞相比，其他NPY受体表现出没有或仅非常少的内化。对OC500可以显示相同结果。仅对NPY Y1受体可以观察到清楚的受体内化。与未刺激的对照细胞相比，NPY Y2、Y4和Y5受体表现出没有或仅非常少的内化。
微管蛋白网络的去稳定
表达ECFP-标记的微管蛋白和EYFP-标记的人Y1受体的HEK293细胞的荧光显微术用来研究化合物对微管蛋白网络完整性的影响。用Axio Observer显微镜和ApoTome成像系统(Zeiss,Jena,Germany)采集活细胞图像。未刺激的表达ECFP-标记的微管蛋白和EYFP-标记的人Y1受体的HEK293细胞显示NPY Y1受体定位在细胞膜，而据发现微管蛋白在细胞质中组成典型的网络结构。用100nM的OC500处理这些细胞16h引起(1)NPY Y1受体的内化，(2)降解和分散的微管蛋白网络以及(3)形成细胞膜的囊泡外翻所示的凋亡样形态学。
凋亡测定
研究化合物处理之后几种乳腺癌细胞系中效应子胱天蛋白酶3和7的活性水平显示通过游离的溶细胞素(例如OC169)以及通过细胞毒性肽缀合物(例如OC500)诱导凋亡细胞死亡机制(胱天蛋白酶依赖性的)，而基础肽OC502不能触发凋亡事件。如对MDA-MB-468和184B5细胞所示，据显示凋亡的诱导(以及因此减少的细胞活力)为时间和浓度依赖性效应(图8)。
图8A-D示出胱天蛋白酶3/7的激活(柱形)以及乳腺癌细胞系MDA-MB-468(A,B)和184B5(C,D)的细胞活力(三角形)。将细胞分别用所示化合物浓度处理24h(A,C)和48h(B,D)。随后，利用基于发光的胱天蛋白酶-GloTM测定试剂盒(Promega)测量效应子胱天蛋白酶3/7的激活，并且利用基于刃天青的细胞活力测定荧光检测细胞活力。细胞活力计数用来归一化胱天蛋白酶活性数据，其显示为基础(未处理的细胞)的x倍。
核片段化是表明细胞凋亡的一个标志。图9分别示出稳定表达EYFP-标记的人NPY Y1(白色条形)和Y2受体(黑色条形)的HEK293细胞的各种浓度OC500的核片段化测定。通过Hoechst33342染色用OC500处理的细胞的核，并且通过用荧光显微术(用Axio Observer显微镜和ApoTome成像系统；Zeiss,Jena,Germany)肉眼观察来进行非片段化的核的计算。核片段化测定显示在50-100nM浓度下，表达hY1的细胞的核显著片段化。在表达hY2受体的细胞中，在这些化合物浓度下片段化较少。因此，OC500表现出hY1受体选择性。还用OC508进行这些实验并显示相似的结果。此外，OC508略微更有效。这些发现与信号转导数据一致，并且指出OC500和OC508触发的凋亡机制。
在细胞培养中通过氨基酸的稳定同位素标记(SILAC)
进行利用SILAC的蛋白质组学分析以评价化合物对蛋白表达的细胞调节的影响(图10)。分别用例如OC169和OC500处理在各种乳腺癌细胞系中导致相当的蛋白调节。观察到的许多蛋白表达的上调可以大致分类为至少3个功能组，即处理蛋白表达调节的蛋白，细胞骨架相关蛋白以及处理蛋白水解相关时间的那些蛋白。一般来说，OC169和OC500触发的所有这些蛋白的调节可以在化合物诱导的细胞微管蛋白网络降解，以及细胞努力回收和修复细胞骨架的背景中看到。
图10示出利用在细胞培养中通过氨基酸的稳定同位素标记(SILAC)，在分别用OC169和OC500处理之后MCF-7(A)和MDA-MB-468(B)细胞的蛋白质组分析。将细胞用所示浓度的化合物处理所示时间，并且利用nano-HPLC/质谱分析法检测上调或下调的蛋白。这里，仅示出上调的蛋白，并且分类为3个功能组，处理蛋白表达的调节，微管蛋白网络的组织以及 蛋白酶体回收过程。IMA2，输入蛋白亚基α-2；DNAJ，DnaJ同系物亚家族B成员1；KIF11，驱动蛋白样蛋白11；TPX2，Xklp2的靶向蛋白；PSMG1，蛋白酶体组装分子伴侣1；UBE2S，泛素缀合酶E2S；CKAP5，细胞骨架相关蛋白5；RLA1，60S酸性核糖体蛋白P1；RL21，60S核糖体蛋白L21；RL29，60S核糖体蛋白L29；ZN428，锌指蛋白428；KIF20A，驱动蛋白样蛋白20A；KIFC1，驱动蛋白样蛋白C1；UBE2N，泛素缀合酶E2N；USP10，泛素羧基端水解酶10；UBE2I，泛素缀合酶E2I；RM40，39S核糖体蛋白L40(线粒体)；RS13，40S核糖体蛋白S13；EIF2A，真核翻译起始因子2A；CENPF，着丝粒蛋白F；ZYX，斑联蛋白；ACTBL，β-肌动蛋白样蛋白2；UBE2C，泛素缀合酶E2C；UBE2K，泛素缀合酶E2K。