灰树花子实体或菌丝体D组分多糖的提取分离方法 【技术领域】
本发明涉及了食用菌有效成分的提取分离方法，具体涉及了一种灰树花子实体或菌丝体多糖组分的提取分离方法。
背景技术
灰树花(Polyporus frondosus)隶属于真菌门、担子菌亚门、非褶菌目、多孔菌科、多孔菌属。灰树花是著名的食用、药用真菌，营养丰富，鲜美可口，是“可食、可补、可药，周身是宝”的大型真菌。灰树花性平、味甘，可以用来治疗小便不利、水肿、脚气、肝硬化腹水、糖尿病、高血压和肥胖症等疾病。
已知从灰树花菌属的菌丝体或子实体提取的由带有β-1，3-键连葡萄糖支链的β-1，6-键连葡萄糖主链构成的或由带有β-1，6-键连葡萄糖支链的β-1，3-键连葡萄糖主链构成的多糖具有抗癌活性。
包括下列步骤制备抗癌物质也是已知的，所述步骤为：用热水对灰树花，树花菌司象耳兰(Grifola gigantea)(Tonbimai)或Laetiporus sulphureus(Masutake)进行提取；减压浓缩提取液，用有机溶剂对浓缩液进行沉淀，对沉淀物进行透析以除去低分子量的物质，并用亲脂有机溶剂提取杂质以从透析液中除去它们。
然而，以上描述的那些方法对于制备大量的药剂和从有限的资源来有效地制备健康食品而言是不适合，因为这些方法的纯化步骤相当复杂，而且所得的产物中含有抑制免疫增强活性的物质。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题是利用灰树花D组分多糖在不同乙醇浓度的不同性质，使得灰树花子实体或菌丝体D组分得到分级分离纯化，提供了一种有效的分级提纯D组分多糖的方法。
本发明实现灰树花子实体或菌丝体D组分多糖分级分离纯化的技术方案为：
将原料粉碎，热水提取，乙醇沉淀，加入络合物络合，酸洗，碱复溶sevag法脱蛋白，乙醇沉淀，碱复溶，乙醇再次沉淀，醇洗，冷冻干燥。记得到灰树花多糖。
本发明的分离纯化技术通过以下步骤得以实现：
A.粗多糖的提取
以灰树花子实体或菌丝体为原料，粉碎成细粉，加入10～40倍的水，热水提取1-6小时，离心，减压浓缩至浓缩液相对密度为1.02～1.15，缓慢加入95％的乙醇至终浓度为30％～70％，搅匀，4℃静置过夜，过滤，沉淀极为灰树花粗多糖。
B.D组分多糖的分级纯化
(1)A中所得粗多糖挤干乙醇，用蒸馏水复溶；
(2)加入70％的CTAOH至不再产生沉淀，调节PH≥10，4℃保持24-72h，离心分离，弃上清液得沉淀；
(3)取上述(2)所得沉淀加入醋酸溶液洗涤3遍，离心，80％的乙醇洗涤3遍，离心，所得沉淀用0.1～1M的NaOH溶液复溶，离心，上清液用sevag法脱蛋白；
(4)将(3)脱蛋白后的溶液加入乙醇至乙醇浓度为40％～60％，静置，离心，沉淀用NaOH溶液复溶，加入乙醇至终浓度为30％～40％，静置，离心，取沉淀复溶后加入乙醇使乙醇浓度为20％～30％，静置，离心，收集沉淀物，用95％的乙醇和无水乙醇洗涤，冷冻干燥，即得灰树花D组分多糖。
上述冷冻干燥的程序为：-47℃2h，-30℃4h，-5℃24h，27℃4h，真空度保持在0.08MPa～0.09Mpa。
D组分的多糖为能与CTA-基团集合的蛋白多糖，集合物不溶于水，其中糖含量在90％左右，蛋白质含量6％--10％，分子量为80～120万道尔顿且具有良好的抗肿瘤活性。
本发明利用水提乙醇沉淀法得到粗多糖，再利用络合物和D组分多糖对乙醇醇沉浓度不同性质而使其得到分离纯化。本发明操作方便，所得目标产物纯度高，为发挥灰树花D组分多糖的大规模生产，制备各种药物及保健食品提供了可行之途径。
【具体实施方式】
实施例1灰树花粗多糖的提取
称取灰树花子实体或菌丝体细粉15Kg，加入500L水，100℃提取1h，8000rpm离心20min，上清液浓缩至密度为1.04，加入3倍量的95％的乙醇，4℃静置过夜，过滤，所得沉淀于少量乙醇中保存备有。
实施例290万道尔顿分子量的灰树花多糖D组分的分离纯化
灰树花多糖浸膏加入30倍的热水复溶，离心，加入30％的PTOH至不再产生沉淀，调节PH＝11，4℃保持48h，离心分离，弃上清液得沉淀；沉淀用2倍体积的20％的醋酸洗涤2遍，90％的乙醇洗涤2遍，再用0.5的NaOH溶液复溶，离心，上清液用sevag法脱蛋白3次；上清液加入乙醇至乙醇浓度为55％使沉淀，沉淀用0.2M的NaOH溶液复溶，加入乙醇使乙醇浓度为35％，沉淀，离心，取沉淀用0.2M的NaOH溶液复溶后加入乙醇使乙醇浓度为30％，沉淀，离心，取沉淀用90％和无水乙醇分别洗涤，冷冻干燥，得到4.5g灰树花D组分多糖，多糖含量为91％，蛋白含量为6.67％，分子量为90W道尔顿。
实施例3115万道尔顿分子量的灰树花多糖D组分的分离纯化
灰树花多糖浸膏加入30倍的热水复溶，离心，加入30％的CTAOH至不再产生沉淀，调节PH＝12，4℃保持48h，离心分离，弃上清液得沉淀；沉淀用2倍体积的20％的醋酸洗涤2遍，90％的乙醇洗涤2遍，再用0.5的NaOH溶液复溶，离心，上清液用sevag法脱蛋白3次；上清液加入乙醇至乙醇浓度为40％使沉淀，沉淀用0.2M地NaOH溶液复溶，加入乙醇使乙醇浓度为30％，沉淀，离心，取沉淀用0.2M的NaOH溶液复溶后加入乙醇使乙醇浓度为25％，沉淀，离心，取沉淀用90％和无水乙醇分别洗涤，冷冻干燥，得到3.2g灰树花D组分多糖，多糖含量为93％，蛋白含量为5.61％，分子量为115W道尔顿。
实施例4100万道尔顿分子量的灰树花多糖D组分的分离纯化
灰树花多糖浸膏加入30倍的热水复溶，离心，加入40％的CTAOH至不再产生沉淀，调节PH＝11，4℃保持48h，离心分离，弃上清液得沉淀；沉淀用2倍体积的20％的醋酸洗涤2遍，90％的乙醇洗涤2遍，再用0.5的NaOH溶液复溶，离心，上清液用sevag法脱蛋白3次；上清液加入乙醇至乙醇浓度为50％使沉淀，沉淀用0.2M的NaOH溶液复溶，加入乙醇使乙醇浓度为25％，沉淀，离心，取沉淀用0.2M的NaOH溶液复溶后加入乙醇使乙醇浓度为30％，沉淀，离心，取沉淀用90％和无水乙醇分别洗涤，冷冻干燥，得到3.9g灰树花D组分多糖，多糖含量为91.5％，蛋白含量为6.02％，分子量为100W道尔顿。