说明书(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼在制药中的应用
技术领域
本发明涉及(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼在制备抗横纹肌肉瘤药物中的应用。
背景技术
横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)是发生自胚胎间叶组织的恶性肿瘤，发生率次于恶性纤维组织细胞瘤和脂肪肉瘤，居软组织肉瘤的第三位。横纹肌肉瘤的治疗主要有手术治疗、化学治疗、放射治疗、磁感应治疗等。其中化疗在治疗癌症中是必不可少的治疗手段。目前常用的化疗药物主要是长春新碱、更生霉素和环磷酰胺，新药有异环磷酰胺、etoposide和topotecan。但在使用中由于化疗药物杀死一些正常细胞，因此会引起许多副作用，如脱发、恶心和呕吐、食欲不振、疲劳、贫血以及易受感染等。大部分副作用在停止用药后会消失，但是某些药物会永久损害卵巢和睾丸中的细胞，以至很难甚至不能生育。环磷酰胺或异环磷酰胺对肾脏和膀胱的损害也是永久性的。面临这些不良反应，急待开发疗效确切且安全可靠的抗癌药物产品予以替代。
酰腙类化合物因其特殊的化学结构—CONHN＝CH—而表现出良好的消炎、杀菌、抗惊厥、抗肿瘤、抗糖尿病、抗结核病菌等药理活性。已报到的专利JP52027775、US3513165、US3972905、US5122368、EP0398305中描述的酰腙衍生物具有消炎、杀菌、抗惊厥、抗肿瘤、抗病毒的药理活性。然而，在酰腙化学结构引入中吡唑类化合物形成新合成的(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼化合物，并研究该化合物在制备抗横纹肌肉瘤药物中的应用还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼在制备抗横纹肌肉瘤药物中的应用。
本发明所述(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼的化学结构式为：
本发明所述(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼在制备抗 横纹肌肉瘤药物中的应用。
上述(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼能有效抑制人横纹肌肉瘤RD细胞生长，其半数生长抑制浓度(GI50)是0.80μM。
下面结合试验具体论述本发明所述(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼的药效学作用和其作用机制。
以常规方法培养人横纹肌肉瘤RD细胞，并收集生长状态良好且处于对数期的细胞用于实验研究。采用细胞生物学和分子生物学方法进行如下实验，观察(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼对人横纹肌肉瘤RD细胞凋亡的影响。
1.(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼对横纹肌肉瘤细胞的形态学和数目影响
收集对数期人横纹肌肉瘤RD细胞，在含该细胞的培养基中分别加入1μM或5μM本发明所述化合物，处理48h，以DMSO作为溶剂对照，在显微镜下观察癌细胞形态学和数目的变化，结果发现该化合物处理48h后的细胞较溶剂对照组的细胞数目变少而且发生了明显的形态学变化(见图1)。
2.(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼对横纹肌肉瘤细胞的半数生长抑制浓度测定
将对数期人横纹肌肉瘤RD细胞接种于96孔板中，经不同浓度(20、10、5、1、0.5、0.25、0.1、0.05、0.01μM)的(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼处理48h后，分别用SRB方法检测活细胞的数目，计算存活率。
存活率＝(实验组吸光度值-加药0h时吸光度值)÷(对照组OD值-加药0h时吸光度值)(以不含细胞的培养液为吸光度测定空白背景)。
实验结果：(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼作用于人横纹肌肉瘤RD细胞，半数生长抑制浓度GI50为0.80μM(见图2)。
3.(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼对横纹肌肉瘤细胞的细胞周期阻滞影响
取对数期人横纹肌肉瘤RD细胞，加入5.0μM的(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼，作用24h后，用PI染色，以流式细胞术分析，结果发现所述化合物作用人横纹肌肉瘤RD细胞在24h内被阻滞在G2/M期(见图3)。
4.(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼对横纹肌肉瘤细胞诱导产生细胞凋亡的影响
取对数期人横纹肌肉瘤RD细胞，加入5.0μM的(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼，作用48h后进行Annexin V-FITC/7-AAD染色，用流式细胞术分析，结果发现该化合物对人横纹肌肉瘤RD细胞作用48h后产生显著的凋亡现象(见图4)。
5.体外实验证明(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼抑制微管蛋白聚合
将不同浓度(100、30、10、3、1、0.1μM)的(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼与微管蛋白在体外共孵育60分钟，DMSO为溶剂对照组，Nocodole为已知的抑制微管蛋白聚合的阳性药物对照组。通过荧光信号检测微管蛋白的聚合情况，结果显示，在较低浓度下本发明的化合物即可抑制微管蛋白的聚合，可以推断微管蛋白是(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼重要的作用靶点之一(见图5)。
本发明公开的(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼在0.80μM即可引起人横纹肌肉瘤RD细胞50％的生长抑制效果，5.0μM即引起人横纹肌肉瘤RD细胞的细胞周期阻滞并诱导凋亡，而且考察其作用靶点发现，此化合物作用于微管蛋白，抑制微管的形成。预示本发明所述(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼在制备抗横纹肌肉瘤药物中具有良好的开发应用前景，有望成为针对横纹肌肉瘤治疗的有效药物。
附图说明
图1本发明所述(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼作用人横纹肌肉瘤RD细胞后，显微镜下显示的细胞形态变化和数量变化情况。
其中，化合物处理时间均为48小时，所用浓度为0μM(DMSO)，1μM，5μM。
图2用SRB方法分析(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼作用于人横纹肌肉瘤RD细胞48h后的剂量-细胞存活率关系。
其中，横坐标为浓度(单位：mol/L)的负对数，纵坐标为细胞存活率。
图3流式细胞术检测(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼对人横纹肌肉瘤RD细胞的细胞周期阻滞情况。
其中，所用化合物浓度5.0μM，横坐标为作用时间24h，横坐标为细胞DNA含量，纵坐标为细胞数目。线段1、2和3分别依次标示G1、S和G2/M时期。
图4Annexin V-FITC/7-AAD双染法检测(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼诱导人横纹肌肉瘤RD细胞发生细胞凋亡现象。
其中，所用的化合物浓度为5.0μM，作用时间48h。第四象限为正常活细胞。第二、三象限为凋亡细胞。
图5不同浓度(100、30、10、3、1、0.1μM)的(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼抑制微管蛋白聚合成微管过程测试。
其中，横坐标为时间，纵坐标为微管形成的量(以荧光强度标示)。DMSO为溶剂对照组，Nocodole为已知的抑制微管蛋白聚合的阳性药物。
具体实施方式
实施例1：
(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼的制备
1)在100毫升的圆底烧瓶中加入碳酸钾(0.005摩尔),3-苯基-1H-吡唑-5-甲酸乙酯(0.005摩尔)，2-氯-5-氯甲基吡啶(0.005摩尔)以及乙腈(25毫升)，装置回流冷凝器，上部接 干燥管。加热回流4小时，反应至原料完全消耗，用TLC检测反应终点。减压浓缩，去除溶剂，加入乙酸乙酯(30毫升)，过滤，滤液浓缩，用乙酸乙酯-石油醚(V/V＝1/2)作洗脱剂硅胶柱色谱分离剩余物(100～200目硅胶),得到1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基吡唑-5-羧酸乙酯，产率为87％。
2)在0.341克(0.001摩尔)1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基吡唑-5-羧酸乙酯的甲醇(5毫升)溶液中加入1.2毫升80％的水合肼，搅拌回流反应1小时，反应至原料完全消耗，用TLC检测反应终点。静置过夜，析出固体，过滤，减压抽滤得粗产物；用8毫升乙醇重结晶制得高纯度1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼，产率为86％。
3)将得到的0.328克(0.001摩尔)1-苯甲基-3-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-碳酰肼与胡椒醛0.150克(0.001摩尔)加入到10毫升乙醇中，回流反应11小时，反应至原料完全消耗，用TLC检测反应终点；静置过夜，析出白色固体，过滤，减压抽滤得粗产物；用12毫升乙醇重结晶制得高纯度(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼，产率为87％。
结构式如下：
分子式：C24H18ClN5O3
分子量：459.88
性状：白色固体
熔点：213-215℃
核磁共振数据如下：
1H-NMR(400MHz,DMSO)δ:5.81(s,2H,CH2),6.10(s,2H,O-CH2),7.01(d,J＝8.0Hz,1H,ArH),7.20(d,J＝8.0Hz,1H,ArH),7.30(s,1H,4-H),7.37-7.51(m,5H,ArH),7.73(dd,J＝2.1Hz,8.4Hz,1H,PyH),7.81(d,J＝7.6Hz,2H,ArH),8.33(s,1H,＝CH),8.37(d,J＝2.1Hz,1H,PyH),11.90(s,1H,NH).
红外光谱数据如下：
IR(KBr)ν:3173-2952(NH),1662(C＝O)cm–1.
质谱数据如下：
MS(EI):m/z 460.5(M+H)+。
实施例2：
SRB方法测定(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼对横纹肌肉瘤细胞生长半数抑制浓度
在37℃并含5％CO2的环境下，用DMEM/10％胎牛血清培养基培养人横纹肌肉瘤RD细胞。收集对数期人横纹肌肉瘤RD细胞，接种于96孔板中，孵育24h。加入不同浓度(20、10、5、1、0.1、0.05、0.01μM)的(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼孵育48h后，加入50μL三氯乙酸溶液(30％)，4℃固定一小时。甩去溶液，高纯水冲洗五次，晾干后加入100μL磺酰罗丹明B染色30分钟，甩干后用1％醋酸溶液冲洗五次。晾干后加入Tris溶液100μL充分溶解，在酶标仪上540nm波长下测定吸光度。根据吸光度计算存活率，存活率＝(实验组吸光度值-加药0h时吸光度值)÷(对照组OD值-加药0h时吸光度值)(以不含细胞的培养液为吸光度测定空白背景)。
实验结果：(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼作用于人横纹肌肉瘤RD细胞，半数生长抑制浓度GI50为0.80μM(结果见图2)。
实施例3：
PI染色流式细胞仪测定(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼对横纹肌肉瘤细胞周期的影响
取对数生长期的人横纹肌肉瘤RD细胞，按每3mL培养基体积含20万细胞数的量分别接种于6cm培养皿内，共接种8个培养皿。24小时后8个培养皿等分为两组。每组的培养皿中两个培养皿加入DMSO，两个培养皿加入5.0μM化合物(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼。继续分别孵育24h后，在冰上消化细胞，收集细胞悬液，离心后用PBS洗涤2次。加入70％冰乙醇10毫升混悬，在-20℃过夜。离心细胞悬液，用PBS冲洗2次，向细胞加入500μLPI/5μLRNAaseA避光4℃下染色半小时。以DMSO组为阴性对照用流式细胞仪以标准程序检测细胞周期。
结果表明：(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼作用人横纹肌肉瘤RD细胞在24h内被阻滞在G2/M期(结果见图3，横坐标为细胞DNA含量，纵坐标为细胞数目；线段1、2和3依次分别标示了G1、S和G2/M时期)。
实施例4：
Annexin V-FITC/7-AAD双染法检测(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼诱导横纹肌肉瘤细胞发生细胞凋亡现象
取对数生长期的人横纹肌肉瘤RD细胞，按每3mL培养基体积含20万细胞数的量分别接种于6cm培养皿内，分别用DMSO和5.0μM的(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼作用48小时。然后在冰上消化细胞，收集细胞悬液，离心后用PBS洗涤2次。向细胞加入100μL PBS和100μL Annexin-V/7-AAD染色液，振摇混匀，避光室温染色30分钟。以DMSO组为阴性对照用流式细胞术分析，确定所述化合物是否诱导横纹 肌肉瘤细胞发生细胞凋亡现象。
结果发现5.0μM化合物(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼对人横纹肌肉瘤RD细胞具有诱导发生凋亡现象(结果见图4)。
实施例5：
不同浓度(100、30、10、3、1、0.1μM)的(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼抑制微管蛋白聚合成微管过程测试
测试过程中，正常的反应条件下，微管蛋白会发生聚合反应，形成微管。
采用Tubulin聚合实验试剂盒(美国Cytoskelecton公司)进行测试，向反应体系中加入不同浓度(0、0.1、1.0、3.0、10.0、30.0、100.0μM)的(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼和已知的抑制微管蛋白聚合的阳性药物Nocodole 10.0μM，在60分钟时间内，测试反应体系荧光强度的变化，以鉴定微管的形成量(与荧光强度成正比)。
结果显示，在较低浓度下(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼即可抑制微管蛋白的聚合，可以间接推断微管蛋白是(E)-N-胡椒基-1-(3-(6-氯吡啶)甲基)-3-苯基-1H-吡唑-5-碳酰肼重要的作用靶点之一(见图5)。