一种柞蛹虫草中药材的人工培育方法、炮制、检测及其用途.pdf

本发明的目的在于提供一种人工培育的柞蛹虫草中药材的培育及炮制方法。采用活的、健康的柞蚕蚕蛹，人工接种蛹虫草菌在温度15～25℃，培育时间45～60天，采用蓝光(60-100勒克斯)及白光(350-400勒克斯)每日交替照射各8-10小时的条件下培育出有效成份稳定可控的柞蛹虫草中药材。同时，柞蛹虫草中药材(连蛹带草)的炮制在温度不超过60℃的条件下进行炮制，工艺为烘干及粉碎，最大限度的保证柞蛹虫草中药材有效成份的活性。柞蛹虫草中药材的特征检测方法：采用高效液相、高效液相-质谱联用检测系统及对照品对柞蛹虫草中药材成分进行定性检测及成分指认，并采用指纹特征图谱进行指纹检测，5个特征色谱峰相对保留时间在±5％之内。经过鉴定，各指纹成分分别为：峰1为：尿苷，峰2为：酪氨酸，峰3为：腺苷，峰4为：虫草素，峰5为：N-(2)羟基腺苷。柞蛹虫草中药材在临床上可用于感冒的治疗。

权利要求书
1.  一种柞蛹虫草中药材，其特征在于，所述柞蛹虫草按照如下方法制备得到：蛹虫草菌 接种在天蚕蛾科昆虫柞蚕(Antheraea pernyi Geurin-Meneville)的活蛹上，在温度为15～25℃ 的条件下，采用蓝光(60-100勒克斯)及白光(350-400勒克斯)每日交替照射各8-10小时， 经45～60天培养出子座和蛹体，即麦角菌科虫草属蛹虫草Cordyceps militaris (Linn.et.Fr.)Link的人工培养品。

2.  权利要求1中所述的柞蛹虫草中药材，其特征在于，所述柞蛹虫草由蛹体与从蛹体长 出的多个子座相连而成，二者结合紧密；蛹体呈长椭圆形，长2～4.5cm，直径1～2.5cm； 表面覆盖黄白色至黄色菌膜，剥落后呈黑褐色至黑色，蛹体腹部有环纹10～25个；质较脆， 易折断，断面略平坦，灰棕色；子座4～20个，细长扁圆柱形，长2～8cm，直径约0.2cm； 表面橙黄色至橙红色，少有分枝，顶端偶有膨大；质柔韧，断面黄白色；气微腥，味微咸。

3.  权利要求1中所述的柞蛹虫草中药材的炮制方法，其特征在于柞蛹虫草中药材在温度 为60℃以下干燥并研末；干燥方式为：红外或微波或冷冻或气流或真空或烘箱干燥，干燥温 度不超过60℃；研末为细粉，即按中国药典规定：指能全部通过五号筛，并含能通过六号筛 不少于95％的粉末。

4.  权利要求1中所述的柞蛹虫草中药材的检测方法，其特征在于：采用高效液相(HPLC)、 高效液相-质谱联用检测系统(HPLC-MS)，对该蛹虫草药材成分进行定性检测及成分指认， 并采用指纹特征图谱进行指纹检测，所述蛹虫草药材成分如附图2所示，各指纹成分分别为： 峰1-尿苷，峰2-酪氨酸，峰3-腺苷，峰4-虫草素，峰5-N-(2)羟基腺苷。

5.  权利要求1所述的柞蛹虫草中药材，其特征在于含砷量不超过百万分之二、重金属不 超过百万分之三十、炽灼残渣限度不超过7.5％、水分限度不超过10.0％。

6.  权利要求1所述的柞蛹虫草中药材在制备用于治疗感冒的药物中的用途。

说明书一种柞蛹虫草中药材的人工培育方法、炮制、检测及其用途
技术领域
本发明属中药材技术领域，具体涉及一种柞蛹虫草中药材的人工培育方法、 炮制、特征成分的检测及其用途。
背景技术
蛹虫草Cordyceps militaris(Linn.et.Fr.)Link为麦角菌科虫草属，又 名北冬虫夏草、北虫草、蛹草、东北虫草等，天然野生蛹虫草始载于《新华本草 纲要》，后收载于《中华本草》、《中药辞海》、《全国中草药汇编》、《中国药用孢 子植物》、《中华药海》等中药典籍中。蛹虫草作为冬虫夏草的模式种，可作为冬 虫夏草入药。此外，人工培育蛹虫草已获得成功，中国专利申请87106987.3、 中国专利申请00130381.3、中国专利申请201210376581.X公开了蛹虫草的人工 培育方法。蛹虫草菌已收载在国家食品药品监督管理局国家药品标准 WS3-286(Z-039)-2005(Z)“蛹虫草菌粉”药品标准中。上述公开的文献并未考 虑不同光源交替照射对于蛹虫草培育的作用以及蛹虫草作为中药材全草入药的 炮制、特征成分的检测及其新的用途。
目前蛹虫草人工培养品基本上作为高档食用菌类烹调用，其食用部位为人工 培育的蛹虫草子实体，即真菌部分，而没有蛹体。卫生部2009年根据《中华人 民共和国食品卫生法》和《新资源食品管理办法》的规定，批准蛹虫草为新资源 食品，其用于食品生产加工。其公告规定：蛹虫草：即人工培养的蛹虫草子实体。 种属：子囊菌亚纲、麦角菌科、虫草属。生产工艺简述：接种蛹虫草菌种到培养 基上进行人工培养，采收蛹虫草子实体，经烘干等步骤而制成。食用量≤2克/ 天。使用范围：直接食用、酒类、罐头、调味品、饮料。国家药品标准中蛹虫草 菌粉亦指是菌粉。口服，每日3次，每次1g。而相关中药典籍明确指明蛹虫草 必须全草入药，即连蛹(蚕蛹部分)带草(真菌部分)一起入药。冬虫夏草也是 连虫带草一起入药(实际上是以虫为主)。再有，人工培育的蛹虫草成分复杂， 而其作为中药材用于临床治疗必须保证每批产品特征成分的检测、炮制工艺符合 规定，并具有确切的治疗效果。因此，对于蛹虫草人工培养品成分的检测及控制、 炮制工艺的确定，对其质量控制、提高疗效及保证安全性非常重要。本发明提供 了一种用活柞蚕人工培养的柞蛹虫草中药材、炮制方法、特征检测方法及用途， 与市场上的各种食用级的蛹虫草子实体或蛹虫草菌粉不同，本发明是将柞蛹虫草 全草作为中药材及中药饮片使用并具有明确的治疗效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人工培育的柞蛹虫草中药材的培育及炮制方法。 采用活的、健康的柞蚕蚕蛹，人工接种蛹虫草菌在温度15～25℃，培育时间45～ 60天，采用蓝光(60-100勒克斯)及白光(350-400勒克斯)每日交替照射各 8-10小时的条件下培育出有效成份稳定可控的柞蛹虫草中药材。同时，柞蛹虫 草中药材(连蛹带草)的炮制在温度不超过60℃的条件下进行炮制，工艺为烘 干及粉碎，最大限度的保证柞蛹虫草中药材有效成份的活性。
本发明的另一个目的是提供所述人工培育的柞蛹虫草中药材的特征检测方 法：采用高效液相、高效液相-质谱联用检测系统及对照品对柞蛹虫草中药材成 分进行定性检测及成分指认，并采用指纹特征图谱进行指纹检测，5个特征色谱 峰相对保留时间在±5％之内。经过鉴定，各指纹成分分别为：峰1为：尿苷，峰 2为：酪氨酸，峰3为：腺苷，峰4为：虫草素，峰5为：N-(2)羟基腺苷。
本发明的另一个目的是保证所述人工培育的柞蛹虫草中药材其相关成分在 各批次中的稳定性。
本发明还有一个目的是提供所述人工培育的柞蛹虫草中药材在临床治疗的 新用途。
以下通过具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但并不限制本发明， 本领域技术人员可以根据发明做出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神， 均应属于本发明所附权利要求的范围。
本发明的目的是通过如下技术方案实现：
A一种柞蛹虫草中药材的人工培育方法及炮制方法
一种柞蛹虫草中药材，为麦角菌科虫草属蛹虫草Cordyceps militaris (Linn.et.Fr.)Link的人工培养品。本品系蛹虫草菌接种在天蚕蛾科昆虫柞蚕 (Antheraea pernyi Geurin-Meneville)的活蛹上，在温度为15～25℃条件 下，经过45～60天培育，采用蓝光(60-100勒克斯)及白光(350-400勒克斯) 每日交替照射各8-10小时，培养出的子座和蛹体的复合体：由蛹体与从蛹体长 出的多个子座相连而成，二者结合紧密。蛹体呈长椭圆形，长2～4.5cm，直径1～ 2.5cm；表面覆盖黄白色至黄色菌膜，剥落后呈黑褐色至黑色，蛹体腹部有环纹 10～25个；质较脆，易折断，断面略平坦，灰棕色。子座4～20个，细长扁圆 柱形，长2～8cm，直径0.15～0.25cm；表面橙黄色至橙红色，少有分枝，顶端 偶有膨大；质柔韧，断面黄白色。气微腥，味微咸。
B柞蛹虫草中药材的特征检测方法
采用高效液相、高效液相-质谱联用检测系统及对照品对本发明的柞蛹虫草 中药材成分进行定性检测及成分指认，并采用指纹特征图谱进行指纹检测(图2、 图3)。本发明实施例1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6共6批样品中均呈现5个 特征色谱峰，以虫草素(峰4)为参照，相对保留时间分别为：0.32(峰1)、 0.55(峰2)、0.87(峰3)、1(峰4)、1.17(峰5)。且5个特征色谱峰相对保 留时间在±5％之内。经过鉴定，各指纹成分分别为：峰1为：尿苷，峰2为：酪 氨酸，峰3为：腺苷，峰4为：虫草素，峰5为：N-(2)羟基腺苷。
C柞蛹虫草中药材相关成分的检测
包括：水分、重金属、砷盐、炽灼残渣、含量。
D本发明柞蛹虫草中药材临床上用于感冒的治疗
其特点是：疗程短、见效快且无毒副作用。
附图说明
图1是本发明实施例1-2培育的柞蛹虫草中药材图片。
图2是本发明实施例1-2培育的柞蛹虫草中药材的特征图谱。
图3是本发明实施例1-2培育的柞蛹虫草中药材的LC-MS-MS(液相色谱-串 联质谱)色谱图总离子图。
具体实施方法
下面实施例用于进一步说明但不限于本发明。
实施例1：本发明柞蛹虫草中药材的培育与炮制
1-1 取无杂菌污染的蛹虫草菌液1200毫升(吉林省蚕业科学研究院)，健 康的活柞蚕蛹1000枚(河北省承德医学院蚕业研究所)，在百级空气洁净接种室 人工接种。每枚活柞蚕蛹接种1.2毫升蛹虫草菌液。培育条件：温度15℃，时 间45天，采用蓝光(100勒克斯)及白光(400勒克斯)每日交替照射各10小 时，即蓝光(COB光源，深圳市永恒晟光电有限公司)照射10小时，白光(白 炽灯，南通三星电瓷照明有限公司)照射10小时，培养出的子座和蛹体的复合 体。本品由蛹体与从蛹体长出的多个子座相连而成，二者结合紧密。蛹体呈长椭 圆形，长2～4.1cm，直径1～2.2cm；表面覆盖黄白色至黄色菌膜，剥落后呈黑 褐色至黑色，蛹体腹部有环纹10～22个；质较脆，易折断，断面略平坦，灰棕 色。子座4～18个，细长扁圆柱形，长2～6cm，直径0.15～0.18cm；表面橙黄 色至橙红色，少有分枝，顶端偶有膨大；质柔韧，断面黄白色。气微腥，味微咸。 炮制方法：在温度为60℃以下的条件将培育的柞蛹虫草进行红外干燥，并在温 度为60℃以下的条件下研末为细粉。即按中国药典规定：指能全部通过五号筛， 并含能通过六号筛不少于95％的粉末。
1-2 取无杂菌污染的蛹虫草菌液1200毫升(吉林省蚕业科学研究院)，健 康的活柞蚕蛹1000枚(河北省承德医学院蚕业研究所)，在百级空气洁净接种室 人工接种。每枚活柞蚕蛹接种1.2毫升蛹虫草菌液。培育条件：温度18℃，时 间60天，采用蓝光(100勒克斯)及白光(350勒克斯)每日交替照射各9小时， 即蓝光(COB光源，深圳市永恒晟光电有限公司)照射9小时，白光(白炽灯， 南通三星电瓷照明有限公司)照射9小时，培养出的子座和蛹体的复合体。本品 由蛹体与从蛹体长出的多个子座相连而成，二者结合紧密。蛹体呈长椭圆形，长 2.5～4.5cm，直径1.5～2.5cm；表面覆盖黄白色至黄色菌膜，剥落后呈黑褐色 至黑色，蛹体腹部有环纹16～25个；质较脆，易折断，断面略平坦，灰棕色。 子座5～20个，细长扁圆柱形，长3～8cm，直径0.18～0.25cm；表面橙黄色至 橙红色，少有分枝，顶端偶有膨大；质柔韧，断面黄白色。气微腥，味微咸。炮 制方法：在温度为60℃以下的条件将培育的柞蛹虫草进行微波干燥，并在温度 为60℃以下的条件下研末为细粉。即按中国药典规定：指能全部通过五号筛， 并含能通过六号筛不少于95％的粉末。
1-3 取无杂菌污染的蛹虫草菌液1300毫升(吉林省蚕业科学研究院)，健 康的活柞蚕蛹1000枚(河北省承德医学院蚕业研究所)，在百级空气洁净接种室 人工接种。每枚活柞蚕蛹接种1.3毫升蛹虫草菌液。培育条件：温度15℃，时 间60天，采用蓝光(100勒克斯)及白光(400勒克斯)每日交替照射各10小 时，即蓝光(COB光源，深圳市永恒晟光电有限公司)照射10小时，白光(白 炽灯，南通三星电瓷照明有限公司)照射10小时，培养出的子座和蛹体的复合 体。本品由蛹体与从蛹体长出的多个子座相连而成，二者结合紧密。蛹体呈长椭 圆形，长2.4～4.3cm，直径1.2～2.0cm；表面覆盖黄白色至黄色菌膜，剥落后 呈黑褐色至黑色，蛹体腹部有环纹11～22个；质较脆，易折断，断面略平坦， 灰棕色。子座6～18个，细长扁圆柱形，长2.6～7.8cm，直径0.19～0.23cm； 表面橙黄色至橙红色，少有分枝，顶端偶有膨大；质柔韧，断面黄白色。气微腥， 味微咸。炮制方法：在温度为60℃以下的条件将培育的柞蛹虫草进行烘箱干燥， 并在温度为60℃以下的条件下研末为细粉。即按中国药典规定：指能全部通过 五号筛，并含能通过六号筛不少于95％的粉末。
1-4 取无杂菌污染的蛹虫草菌液1400毫升(吉林省蚕业科学研究院)，健 康的活柞蚕蛹1000枚(河北省承德医学院蚕业研究所)，在百级空气洁净接种室 人工接种。每枚活柞蚕蛹接种1.4毫升蛹虫草菌液。培育条件：温度15℃，时 间60天，采用蓝光(100勒克斯)及白光(400勒克斯)每日交替照射10小时， 即蓝光(COB光源，深圳市永恒晟光电有限公司)照射10小时，白光(白炽灯， 南通三星电瓷照明有限公司)照射10小时，培养出的子座和蛹体的复合体。本 品由蛹体与从蛹体长出的多个子座相连而成，二者结合紧密。蛹体呈长椭圆形， 长2.9～4.5cm，直径1.9～2.5cm；表面覆盖黄白色至黄色菌膜，剥落后呈黑褐 色至黑色，蛹体腹部有环纹19～25个；质较脆，易折断，断面略平坦，灰棕色。 子座6～20个，细长扁圆柱形，长2.9～8cm，直径约0.16～0.25cm；表面橙黄 色至橙红色，少有分枝，顶端偶有膨大；质柔韧，断面黄白色。气微腥，味微咸。 炮制方法：在温度为0℃以下的条件将培育的柞蛹虫草进行冷冻干燥，并在温度 为60℃以下的条件下研末为细粉。即按中国药典规定：指能全部通过五号筛， 并含能通过六号筛不少于95％的粉末。
1-5 取无杂菌污染的蛹虫草菌液1500毫升(吉林省蚕业科学研究院)，健 康的活柞蚕蛹1000枚(河北省承德医学院蚕业研究所)，在百级空气洁净接种室 人工接种。每枚活柞蚕蛹接种1.5毫升蛹虫草菌液。培育条件：温度20℃，时 间55天，采用蓝光(80勒克斯)及白光(350勒克斯)每日交替照射9小时， 即蓝光(COB光源，深圳市永恒晟光电有限公司)照射9小时，白光(白炽灯， 南通三星电瓷照明有限公司)照射9小时，培养出的子座和蛹体的复合体。本品 由蛹体与从蛹体长出的多个子座相连而成，二者结合紧密。蛹体呈长椭圆形，长 2～4.3cm，直径1～2.1cm；表面覆盖黄白色至黄色菌膜，剥落后呈黑褐色至黑 色，蛹体腹部有环纹10～22个；质较脆，易折断，断面略平坦，灰棕色。子座 4～16个，细长扁圆柱形，长2～7.9cm，直径0.15～0.20cm；表面橙黄色至橙 红色，少有分枝，顶端偶有膨大；质柔韧，断面黄白色。气微腥，味微咸。炮制 方法：在温度为60℃以下的条件将培育的柞蛹虫草进行真空干燥，并在温度为 60℃以下的条件下研末为细粉。即按中国药典规定：指能全部通过五号筛，并含 能通过六号筛不少于95％的粉末。
1-6 取无杂菌污染的蛹虫草菌液1500毫升(吉林省蚕业科学研究院)，健 康的活柞蚕蛹1000枚(河北省承德医学院蚕业研究所)，在百级空气洁净接种室 人工接种。每枚活柞蚕蛹接种1.5毫升蛹虫草菌液。培育条件：温度25℃，时 间45天，采用蓝光(60勒克斯)及白光(300勒克斯)每日交替照射8小时， 即蓝光(COB光源，深圳市永恒晟光电有限公司)照射8小时，白光(白炽灯， 南通三星电瓷照明有限公司)照射8小时，培养出的子座和蛹体的复合体。本品 由蛹体与从蛹体长出的多个子座相连而成，二者结合紧密。蛹体呈长椭圆形，长 2～3.9cm，直径1～1.8cm；表面覆盖黄白色至黄色菌膜，剥落后呈黑褐色至黑 色，蛹体腹部有环纹10～19个；质较脆，易折断，断面略平坦，灰棕色。子座 4～18个，细长扁圆柱形，长2～7.1cm，直径0.18～0.21cm；表面橙黄色至橙 红色，少有分枝，顶端偶有膨大；质柔韧，断面黄白色。气微腥，味微咸。炮制 方法：在温度为60℃以下的条件进行将培育的柞蛹虫草气流(二氧化碳或氮气) 干燥，并在温度为60℃以下的条件下研末为细粉。即按中国药典规定：指能全 部通过五号筛，并含能通过六号筛不少于95％的粉末。
1-1～1-6培育得到的柞蛹虫草外形相同，以1-2的为例，其图片见图1。
与现有各种食用级的蛹虫草子实体或蛹虫草菌粉培育技术突出产量的技术 特点不同，本发明的柞蛹虫草作为中药材使用，其培育技术主要是用不同光源交 替照射并模拟自然状态的蛹虫草生长环境，使本发明的柞蛹虫草中药材性状、相 关成份(五个特征成份)稳定可控，同时，在温度为60℃以下的条件干燥粉碎， 保证柞蛹虫草有效成分的活性。因此，本发明培育的柞蛹虫草中药材比现有技术 更好的的满足临床治疗的需要。
实施例2：本发明柞蛹虫草中药材的特征图谱
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为 250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm，载碳量11％)；以甲醇为流动相A，水为流动 相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为35℃；检测波长为260nm。理论板 数按虫草素峰计算应不低于5000。

对照品溶液的制备 取虫草素对照品(中检院提供，批号110858-200202) 适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含20μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 将本发明实施例1中的6批柞蛹虫草中药材分别在 60℃以下粉碎成细粉(过3号筛)，并分别取约0.8g，精密称定，置具塞锥形瓶 中，精密加入水50m1，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz) 45分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液， 即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪， 测定，即得。
采用含量测定项下色谱图，对柞蛹虫草中药材中的特征峰进行了鉴别，本发 明实施例1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6共6批柞蛹虫草中药材均呈现5个特 征色谱峰，以虫草素(峰4)为参照，相对保留时间分别为：0.32(峰1)、0.55 (峰2)、0.87(峰3)、1(峰4)、1.17(峰5)。且5个特征色谱峰相对保留时 间在±5％之内。经过鉴定，各指纹成分分别为：峰1为：尿苷，峰2为：酪氨酸， 峰3为：腺苷，峰4为：虫草素，峰5为：N-(2)羟基腺苷。以实施例1-2的柞 蛹虫草为例，图谱见图2。
特征图谱有效成分的确定
使用LC-MS-MS(液相色谱-串联质谱)：对本发明的柞蛹虫草中药材色谱图中 的5个特征性成分进行一级质谱分子量以及二级质谱分子离子碎片峰与对照品 及相关文献分析推断比对，结果显示：1号峰：尿苷，2号峰：酪氨酸，3号峰： 腺苷，4号峰：虫草素，5号峰：N-(2)羟基腺苷。以实施例1-2的柞蛹虫草为 例，图谱见图3。
实施例3：柞蛹虫草中药材相关成份含量的检测
(1)含量测定
与现有蛹虫草相比，本发明的柞蛹虫草中药材虫草素的含量非常稳定。并且 首次确定了柞蛹虫草中药材的5个特征峰及其比例关系。与现有蛹虫草的检测方 法相比，本发明的柞蛹虫草中药材的5个特征峰及其比例关系可以确保本发明的 柞蛹虫草中药材准确快速的鉴别。同时，本发明的柞蛹虫草中药材的5个特征峰 及其比例关系是由本发明的培育方法所决定的。
根据本发明的柞蛹虫草中药材特征图谱中5个特征性成分分析结果显示，其 特征性成分分别为尿苷、酪氨酸、腺苷、虫草素、N-(2)羟基腺苷。为此，本 发明在测定虫草素的含量的同时，测定5个特征性成分的比例关系以及相关质量 控制指标(砷盐、重金属、炽灼残渣、水分)。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为 250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm，载碳量11％)；以甲醇为流动相A，水为流动 相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为35℃；检测波长为260nm。理论板 数按虫草素峰计算应不低于5000。

方法学考察
测定方法的选择 根据本发明柞蛹虫草中药材所含成分的理化特性，选定高效 液相色谱法分离，使用二极管阵列检测器检测，选定260nm为检测波长，对特征 图谱中主要的5个特征性成分峰进行控制。
测定条件的选择 根据特征性成分的特点，使用甲醇-水多种比例不同梯度 进行分离条件的实验，经过反复摸索最终选定以甲醇为流动相A，以水为流动相 B按下表中的规定进行梯度洗脱，结果供试品色谱中5个峰达到基线分离，样品 信息量较大，方法可行。
提取溶剂、时间的选择 为保证药材均匀，将实施例1-1～1-6的柞蛹虫草中 药材粉碎研末，分别精密称取相同重量样品，分别加入100％水、20％甲醇、90％ 甲醇作为提取溶剂，超声提取15分钟、30分钟、45分钟、60分钟，取样进行 测定。以谱图中的5个色谱峰的峰面积为参考标准，实验结果证明，超声提取 30分钟、45分钟峰面积相近，为保证提取完全，测定准确，故选用超声提取45 分钟。
重现性试验 取实施例1-1～1-6的柞蛹虫草细粉约0.8g，分别精密称定， 各加水50ml，称定重量，超声提取流45分钟，放至室温，再称定重量，补足减 失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，进行重复性试验。试验结果表明，该方法重 复性良好。
取实施例1-1～1-6的柞蛹虫草中药材6批，根据测定结果确定柞蛹虫草中 药材按干燥品计算，含虫草素(C10H13N5O3)不得少于0.10％
表1 柞蛹虫草中药材含量测定结果
序号 批号 虫草素含量(％) 1 实施例1-1 0.20 2 实施例1-2 0.25 3 实施例1-3 0.25 4 实施例1-4 0.19 5 实施例1-5 0.16 6 实施例1-6 0.26
5个特征峰的比例关系
根据实施例1-1～1-6的6批柞蛹虫草中药材5个特征峰的平均峰面积，确 定每个特征峰在5个特征峰总峰面积中所占的比例关系。
表2 5个特征峰的平均峰面积


表3 5个特征峰之间的比例关系
序号 样品 峰1 峰2 3峰 峰4 峰5 1 实施例1-1 26.10％ 14.08％ 19.17％ 19.23％ 21.42％ 2 实施例1-2 21.82％ 11.82％ 17.12％ 32.65％ 16.59％ 3 实施例1-3 19.16％ 10.85％ 16.06％ 38.35％ 15.58％ 4 实施例1-4 23.94％ 10.80％ 17.44％ 29.97％ 17.85％ 5 实施例1-5 25.04％ 13.94％ 17.74％ 30.27％ 13.01％ 6 实施例1-6 23.23％ 13.70％ 17.73％ 33.74％ 11.60％
通过对本发明的柞蛹虫草中药材的5个特征峰的峰面积，计算5个特征峰的 比例关系可以确保本发明的柞蛹虫草中药材准确快速的鉴别。
(2)现有蛹虫草未做砷盐的限度研究，为保证柞蛹虫草中药材使用安全，本发 明对柞蛹虫草中药材的砷盐限度进行了以下研究：
前处理方法考察
方法1：不进行有机破坏
取实施例1-1的样品粉末3份：1.0089g、0.4143g、0.2432g，分别加盐 酸5ml与水21ml，依法检查(《中国药典》2010年版一部附录IX F砷盐检查法 第一法)测定。
结果样品均无砷班出现，标准砷斑颜色正常。
方法2：有机破坏无砷氢氧化钙法
参照《中国药典》2010年版一部收载的砷盐检查项下前处理方法：取实施 例1-1样品粉末1.0g，称定重量，加无砷氢氧化钙1g，加少量水，搅匀，烘干， 用小火缓缓炽灼至炭化，再在500～600℃炽灼至完全灰化，放冷，加盐酸7ml 使溶解，再加水21ml，依法检查(中国药典2010年版一部附录IX F第一法)。 结果样品砷斑明显。
限度
测定实施例1-1～1-6的柞蛹虫草中药材共6批样品，根据测定结果确定柞 蛹虫草中药材砷盐限度为：含砷量不超过百万分之二。
表4 柞蛹虫草中药材砷盐测定结果
序号 批号 取样量(g) 结果 1 实施例1-1 1.0294 小于百万分之二 2 实施例1-2 1.0012 小于百万分之二 3 实施例1-3 1.0515 小于百万分之二 4 实施例1-4 1.0036 小于百万分之二 5 实施例1-5 1.0019 小于百万分之二 6 实施例1-6 1.0240 小于百万分之二
(3)现有蛹虫草未做重金属的限度研究，为保证柞蛹虫草中药材使用安全， 本发明对柞蛹虫草中药材的重金属限度进行了以下研究：
按《中国药典》2010年版一部IX E重金属检查法第二法进行测定实施例1-1～ 1-6的柞蛹虫草中药材各6批样品。根据测定结果确定柞蛹虫草中药材重金属限 度不超过百万分之三十。
表5 柞蛹虫草中药材重金属限度
序号 编号 结果 1 实施例1-1 等于百万分之二十 2 实施例1-2 小于百万分之三十 3 实施例1-3 小于百万分之二十 4 实施例1-4 小于百万分之三十 5 实施例1-5 小于百万分之二十 6 实施例1-6 小于百万分之三十
(4)现有蛹虫草未做炽灼残渣的限度研究，为保证柞蛹虫草中药材使用安 全，本发明对柞蛹虫草中药材的炽灼残渣限度进行了以下研究：
按《中国药典》2010年版一部附录IX J炽灼残渣检查法进行测定，根据测 定结果确定柞蛹虫草中药材炽灼残渣限度不超过7.5％。
表6 柞蛹虫草中药材炽灼残渣限度


(5)现有蛹虫草未做水分的限度研究，为保证柞蛹虫草中药材使用安全， 本发明对柞蛹虫草中药材的水分限度进行了以下研究：
水分
按《中国药典》2010年版一部附录IX H第一法进行测定，根据测定结果确 定柞蛹虫草中药材水分限度不超过10.0％。
表7 柞蛹虫草中药材水分检测结果

实施例4 柞蛹虫草中药材动物实验
本发明提供的柞蛹虫草中药材与有现有的蛹虫草子实体或蛹虫草菌粉相比 具有广泛的药效学作用。现有的蛹虫草子实体或蛹虫草菌粉有用于抗疲劳、镇静、 提高免疫力、抗肿瘤的报道。但是，本发明的柞蛹虫草中药材除具有上述作用外， 对大鼠的体重及包皮腺、精囊、前列腺等的重量以及血清皮质醇、睾酮含量的影 响都明显大于生理盐水对照组。证明本发明的柞蛹虫草中药材有明确的雄性激素 样作用。此外，本发明的柞蛹虫草中药材还具有抑制肺癌自发肺转移、提高存活 率的作用。
4.1 柞蛹虫草抗疲劳作用
选用4～6周龄健康昆明种小鼠40只(北京市药品检验所)，体重19～24g， 雌雄各半，将小鼠随机分成4组：生理盐水对照组10只、柞蛹虫草低剂量组、柞 蛹虫草中剂量组，柞蛹虫草高剂量组，每组各10只。实施例1-1的柞蛹虫草 100g，加水500g，加热至100℃，煎煮时间30分钟，制成柞蛹虫草水煎液。灌胃 剂量：柞蛹虫草低剂量组5g/kg、柞蛹虫草中剂量组10g/kg，柞蛹虫草高剂量 组15g/kg。生理盐水对照组等容积。实验结果如下(见表8)：
表8 柞蛹虫草小鼠游泳实验

结果表明：实施例1-1的柞蛹虫草水煎液低、中、高三个剂量组都显著延长 小鼠游泳时间，提示柞蛹虫草有明显抗疲劳作用。
4.2 柞蛹虫草抗戊四唑型惊厥的作用
选用4～6周龄健康昆明种小鼠40只(北京市药品检验所)，体重19～24g， 雌雄各半，将小鼠随机分成4组：生理盐水对照组10只、柞蛹虫草低剂量组、柞 蛹虫草中剂量组，柞蛹虫草高剂量组，每组各10只。实施例1-1的柞蛹虫草 100g，加水500g，加热至100℃，煎煮时间30分钟，制成柞蛹虫草水煎液。灌胃 剂量：柞蛹虫草低剂量组5g/kg、柞蛹虫草中剂量组10g/kg，柞蛹虫草高剂量 组15g/kg。生理盐水对照组等容积。实验结果如下(见表9)：
表9 柞蛹虫草抗戊四唑型惊厥实验


结果表明：实施例1-1的柞蛹虫草水煎液有明显的抗惊厥作用。
4.3 柞蛹虫草对小鼠巨噬细胞吞噬活性的影响
选用4～6周龄健康昆明种小鼠40只(北京市药品检验所)，体重19～24g， 雌雄各半，将小鼠随机分成4组：生理盐水对照组10只、柞蛹虫草低剂量组、柞 蛹虫草中剂量组，柞蛹虫草高剂量组，每组各10只。实施例1-2的柞蛹虫草 120g，加水500g，加热至100℃，煎煮时间25分钟，制成柞蛹虫草水煎液。灌胃 剂量：柞蛹虫草低剂量组5g/kg、柞蛹虫草中剂量组10g/kg，柞蛹虫草高剂量 组15g/kg。生理盐水对照组等容积。实验结果如下(见表10)：
表10 柞蛹虫草对小鼠巨噬细胞吞噬活性的影响

结果表明：实施例1-2的柞蛹虫草水煎液有加强小鼠巨噬细胞吞噬活性的作 用。
4.4 雄性激素样作用
选用健康的Wistar雄性大鼠40只(北京市药品检验所)，体重170～200 g。将大鼠随机分成4组：生理盐水对照组10只、柞蛹虫草低剂量组、柞蛹虫草 中剂量组，柞蛹虫草高剂量组，每组各10只。实施例1-3的柞蛹虫草150g，加 水500g，加热至100℃，煎煮时间30分钟，制成柞蛹虫草水煎液。灌胃剂量：柞 蛹虫草低剂量组5g/kg、柞蛹虫草中剂量组10g/kg，柞蛹虫草高剂量组15g/kg。 生理盐水对照组等容积。实验结果如下(见表11-1、表11-2)：
表11-1 柞蛹虫草对大鼠体重、包皮腺、精囊+前列腺、精囊重的影响


表11-2 柞蛹虫草对大鼠前列腺重、睾丸重、皮质醇、睾酮的影响

结果表明：实施例1-3的柞蛹虫草中药材水煎液对大鼠的体重及包皮腺、精 囊、前列腺等的重量以及血清皮质醇、睾酮含量的影响都明显大于生理盐水对照 组。证明柞蛹虫草中药材有雄性激素样作用。
4.5 抗肿瘤作用
(1)柞蛹虫草对荷S180小鼠抑瘤率的影响
将25只S180荷瘤鼠(北京市药品检验所)随机分为两组：生理盐水对照组 15只、柞蛹虫草组10只。实施例1-4的柞蛹虫草150g，加水400g，加热至100℃， 煎煮时间25分钟，制成柞蛹虫草水煎液。灌胃剂量：柞蛹虫草组15g/kg。生 理盐水对照组等容积。实验结果如下(见表12)：
表12 柞蛹虫草对荷S180小鼠抑瘤率的影响


结果表明：实施例1-4的柞蛹虫草中药材水煎液组动物瘤块重量与生理盐水 组相比，瘤块重量明显减轻，表明柞蛹虫草有一定的抑瘤作用。
(2)柞蛹虫草对荷S180小鼠存活率的影响
将25只S180荷瘤鼠(北京市药品检验所)随机分为两组：生理盐水对照组 15只、柞蛹虫草组10只。实施例1-4的柞蛹虫草150g，加水400g，加热至100℃， 煎煮时间25分钟，制成柞蛹虫草水煎液。灌胃剂量：柞蛹虫草组15g/kg。生 理盐水对照组等容积。实验结果如下(见表13)：
表13 柞蛹虫草对荷S180小鼠抑瘤率的影响

结果表明：实施例1-4柞蛹虫草中药材水煎液组的小鼠存活率达70％以上， 远远高于生理盐水组。
(3)柞蛹虫草对C57BL小鼠Lewis肺癌抑制率的影响
清洁级C57BL小鼠30只(北京市药品检验所)，雄性，年龄6周，接种小鼠 Lewis肺癌瘤株。接种后7-10d肿瘤生长及动物健康程度较好。随机分为两组。 实施例1-5的柞蛹虫草150g，加水400g，加热至100℃，煎煮时间25分钟，制 成柞蛹虫草水煎液。灌胃剂量：柞蛹虫草组15g/kg。生理盐水对照组等容积。 实验结果如下(见表14)：
表14 柞蛹虫草对C57BL小鼠Lewis肺癌抑制率的影响


结果表明：实施例1-5的柞蚕蛹虫草中药材水煎液对C57BL小鼠Lewis肺癌 有抑制作用。
(4)柞蛹虫草对C57BL小鼠Lewis肺癌自发肺转移的影响
清洁级C57BL小鼠20只(北京市药品检验所)，雄性，年龄6周，接种小鼠 Lewis肺癌瘤株。接种后7-10天肿瘤生长及动物健康程度较好。随机分为两组。 实施例1-5的柞蛹虫草150g，加水400g，加热至100℃，煎煮时间25分钟，制 成柞蛹虫草水煎液。灌胃剂量：柞蛹虫草组15g/kg。生理盐水对照组等容积。 实验结果如下(见表15)：
表15 柞蛹虫草对C57BL小鼠Lewis肺癌自发肺转移的影响

结果表明：实施例1-5的柞蛹虫草中药材有抑制Lewis肺癌自发肺转移的作 用。
实施例5 柞蛹虫草中药材用于感冒的治疗
共选感冒患者120例，均为患病初期的患者，主要症状：咽干，咽痒或烧灼 感，有畏寒、鼻塞，咽痛，咳嗽，声嘶，轻度头痛或全身酸痛等症状，体温不超 过38.5℃。使用柞蛹虫草治疗感冒共60例，对照组60例给予安慰剂(蛋白粉)。 上述患者试验期间，不得服用其它治疗感冒的中药或西药。服用方法：实施例 1-6的柞蛹虫草中药材细粉(全草研末)，口服，一日二次，早晚各一次，每次2 克。对照组服用蛋白粉，口服，一日二次，早晚各一次，每次2克。服用时间3 天。判断标准：痊愈：感冒症状全部消失。显效：感冒的大部分症状消失。有效： 感冒的主要症状部分消失。无效：治疗后体温升高，感冒的主要症状无改善。柞 蛹虫草细粉治疗感冒的总有效率达到96％，而且均在服柞蛹虫草细粉三日内起 效，与对照组比较有显著的差异(P＜0.01)。此外，柞蛹虫草细粉治疗的不良事 件发生率非常低(主要为口感不快、轻微腹泻)，共3例，对照组共2例，两组 不良事件发生率的差异无统计学意义，且试验过程中未发现严重不良反应。柞蛹 虫草粉治疗感冒临床疗效好、起效迅速、不良反应轻微，治疗感冒安全有效。目 前，蛹虫草一般用于慢性病的滋补，而本发明的柞蛹虫草中药材对于感冒具有明 确的治疗作用，而且起效快，服用安全。是一种非常有临床治疗价值的中药材。