用于治疗膀胱肿瘤的药物 【技术领域】
本发明涉及一种药物，特别是一种用于在膀胱内灌注治疗膀胱肿瘤的，由从中药中提取的活性成份配伍复方组成的，用于在膀胱内灌注治疗膀胱肿瘤的药物。
背景技术
膀胱肿瘤是男性泌尿生殖系统肿瘤，在西方国家中，其发病率在男性泌尿生殖系肿瘤中仅次于前列腺癌，居第二位。并且据流行病学调查，在美国，该疾病的发病率在过去的30年间稳步升高。膀胱肿瘤在我国也较为最常见。由于年龄是该疾病主要的发病风险因素之一，可以预见，随着人口老龄化的加重，膀胱肿瘤的发病率将进一步升高。
膀胱肿瘤中80％以上为浅表性肿瘤，现阶段主要治疗方法为手术治疗，术后辅以膀胱内灌注药物以抑制肿瘤复发和延缓其向肌层侵袭。若术后不进行辅助治疗，术后1年的复发率高达80％。自1976年Morales首次将卡介苗(BCG)应用于浅表性膀胱肿瘤术后灌注预防复发以来，BCG膀胱灌注已成为膀胱肿瘤辅助治疗的一种重要手段，并且，目前BCG是美国FDA唯一批准的膀胱内灌注药物。但其确切的抗肿瘤机制至今尚不清楚，并且BCG膀胱内灌注毒副作用大，患者难以坚持完成整个灌注疗程，从而影响疗效。
中国发明专利公开了多种用于治疗膀胱癌的口服中药制剂，如01131500.8公开了一种由山茨菇、螃蟹、败酱草、千金子、仙鹤草等五种药配成，治疗膀胱癌的中成药。01106271.1公开了由全酥、大戟、白花蛇舌草、半枝莲、大黄、黄连原料组成的一种治疗癌症的中药。200610057952.2公开了一种以石韦、黄芪、败酱草、龙葵、蒲黄、土茯苓、琥珀、金钱草、小茴香、乌药、车前子、海金沙、瞿麦、白术和三七为原料制备的治疗膀胱癌的中药制剂。但在现有技术中尚无以中药或中药活性成份提取物或其配伍复方组成的膀胱灌注药物。
【发明内容】
本发明提供一种以中药活性成份提取物配伍复方构成的，用于膀胱内灌注治疗膀胱癌的药物，
本发明用于治疗膀胱肿瘤的药物，其特征是药物由中药单体人参皂甙Rg3、槲皮素和姜黄素组成，且各组份的摩尔比为人参皂甙Rg3∶槲皮素∶姜黄素＝20∶5∶3。
本发明的最佳药物组方为三种中药单体人参皂甙Rg3 160±40μmol/L，姜黄素24±6μmol/L，槲皮素38±9μmol/L。
中药人参性甘温，入心、肺、脾经，大补元气、宁神益智、健脾益气、养心生津。人参抗肿瘤作用的活性成分是人参皂甙，研究表明人参皂甙Rg3的抗肿瘤作用最为明显，其抗肿瘤的主要机制如下：(1)促进肿瘤细胞的凋亡；(2)抑制肿瘤细胞的增殖；(3)抑制肿瘤新生血管形成；(4)提高机体的免疫功能。
槲皮素是一种黄酮类化合物，中草药槐米、侧柏叶、高良姜、三七、银杏等均含有槲皮素。既往研究证实槲皮素可抑制恶性肿瘤的生长，众多的实验研究结果显示：槲皮素可以抑制肿瘤细胞增殖和信号转导途径中的多种酶、清除氧自由基等作用。目前我们的研究证实槲皮素可抑制膀胱癌细胞增殖，有凋亡诱导效应，这些作用可能通过P53和survivin蛋白起作用。同时槲皮素可降低膀胱癌细胞生长抑制基因Erb、P16和PASSF1A的甲基水平，参见LiMa，JeanMagloire Feuguang，Jianzhong Lu，Shengiun Fu，Baoliang Ma，1 BinqiangTian，Changping Zou ang Zhiping Wang.Growth inhibitory sffects of quercetin onbladder cancer cell.Frontiers in Bioscience 2006，September 1，11，2275‑2285.
姜黄为姜科黄属天然植物，有行气滞、散风活血和止痛功效。2000年别被列入美国药典。目前对姜黄素的抗癌机制表现在以下几个方面：(1)抗氧化；(2)抑制致癌物活性，诱导解毒酶；(3)抑制花生四稀酸代谢产物的形成；(4)抑制癌基因表达，诱导凋亡，调节细胞信号转导通路。姜黄素能诱导多种肿瘤细胞凋亡，能引起人肝癌细胞P53和C‑myc蛋白明显变化，参见Jiang，M.C.，H.f.Yang‑Yen，J.K.Lin and J.J.Yen.Differential regulation ofP53，c‑Myc，Bcl‑2and Bax protein expression during apoptosis induced by widelydivergent stimuli in human hepatoblastoma cells.Oncogene，1996，13(3)：609‑16.。发明人的的前期研究表明，姜黄素显著诱导三种膀胱肿瘤细胞T24、EJ和UMU2凋亡，阻滞肿瘤细胞在G2/M期。两种抗凋亡蛋白Bcl‑2和Survivin的表达下调，同时Bax和p53表达上调。克隆形成试验证实姜黄素大剂量、短期作用于膀胱癌细胞有致命的效应。同时体内试验证实姜黄素诱导原位膀胱癌细胞凋亡，抑制并减缓膀胱癌的形成和发展，参见Binqiang Tian，Zhiping Wang，YingmeiZhao，Degui Wang，Yonggang Li，Li Ma，Xiaoming Lia，Jing Lia，NanXIaoa，Yiaoa，Yichen Wanga，Ronald Rodriguezc.Effects of curcumin on bladdercancer cells and development of urothelia tumors in a rat bladder carcinogenesismodel.Canncer letters，2008，8；264(2)；299‑308.。
目前公认肿瘤的发生发展是多基因、多步骤共同参与累积的结果，这与中医的整体观有相似之处。本发明亦遵循这一理论观点，从整体观出发，坚持在中医药理论指导下，以病证结合、方证相应、理法方药一致为原则，进行有效单体成分复方配伍，发掘膀胱肿瘤灌注的优势中药，从与肿瘤发生有关细胞凋亡阐明配伍复方的抗膀胱癌作用。古籍《素问·气厥论篇》说：“胞移热于膀胱，则癃溺血”。膀胱肿瘤病位在膀胱，与心、脾、肾密切相关，尤其是手术后绝大多数患者证侯表现虚实夹杂，多以气虚血瘀为主，因此治疗原则当以益气活血，温补脾肾为宜。在这些原则下确定了本发明组方的具体药物，同时考虑到本发明是一种用于膀胱灌注的药物，因此本发明采用由药物中提取的活性成份。
相关研究表明，本发明作用于人膀胱癌肿瘤细胞后凋亡和死亡明显优于相对比的其他分组，具有抗肿瘤、抑制肿瘤复发、增强免疫力的疗效，且不良反应和副作用较小的优点。
【附图说明】
图1为双变量流式细胞仪的散点图，用于比较本发明和其他分组，作用于人膀胱癌肿瘤细胞后凋亡和死亡的情况。图2为本发明作用于膀胱肿瘤细胞24h后荧光显微镜照片。
【具体实施方式】
以下提供本发明的最佳实施例：
中药有效组分配伍复杂繁琐，传统研究方法费时费力，也不容易发现其内在规律。正交实验设计作为一种多因素多水平实验设计的科学方法，在医学中药方剂研究中具有十分重要的意义。本发明的最佳实施例即采用正交实验，得出最佳的配伍比例，具体的做法如下：
1、三种中药的体外的抗肿瘤试验通过膀胱癌细胞的培养及细胞毒试验来计算三种中药单体的半数抑制浓度(IC50)。
通过实验“三种单体成分体外抗膀胱癌细胞株T24的半数抑制率(IC50)”得到三种中药单体24小时内作用于膀胱癌细胞株T24的半数抑制率(24h/IC50)结果：人参皂甙Rg3 160μmol/L；姜黄素24μmol/L；槲皮素158μmol/L。
2、根据治疗原则依照，以人参皂甙Rg3为君药，槲皮素、姜黄素为复方臣药组成复方。
3、运用数理统计学方法，通过计算机正交设计计算出三种中药单体的最佳药效的剂量配伍。本实验选用L9(34)正交表，本实验所设计的因素水平表如下：
![]()
优化配伍复方的体外抗膀胱肿瘤试验：
(1)Annexin V‑FITC/PI检测凋亡
正常细胞膜磷脂的分布是不对称的，膜内表面含负电的磷脂(如磷脂酰丝酸，PS)，而膜外表面含有占绝大多数的中性磷脂。在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin V是一种分子量为35～36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin V进行荧光素FITC标记即能检测到细胞早期凋亡。碘化丙啶(propidine io2dide，PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，而早期凋亡细胞的细胞膜是完好的对PI有拒染性，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。具体实验步骤略。
(2)细胞毒实验得到如下正交实验数据表：
![]()
得到最佳复方配伍剂量为：人参皂甙Rg3 160μmol/L，槲皮素38μmol/L，姜黄素24μmol/L。
(3)中药复方与单体中药及羟基喜树碱对人膀胱癌细胞株T24凋亡作用的对比。
经Annexin V‑FITC/PI检测凋亡。得到双变量流式细胞仪的散点图，见图1；实验细胞的荧光显微镜观察见图2和图3。
图1给出双变量流式细胞仪的散点图，比较了中药复方制剂和其他分组，作用于人膀胱癌肿瘤细胞后凋亡和死亡的情况。即为Annexin V‑FITC/PI检测凋亡的流式细胞仪分析结果。流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为(FITC‑/PI‑)；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为(FITC+/PI+)；而右下象限为凋亡细胞，显现(FITC+/PI‑)。经本发明组方作用后的细胞主要位于右上象限和右下象限，其作用后的人膀胱癌肿瘤细胞以凋亡和死亡为主，而活细胞基本没有。由这一实验可知本发明的药效要好于其他分组。
实验细胞的荧光显微镜观察结果见图2和图3。由图2可见，在荧光显微镜下，双色滤光片(FITC和罗丹明)观察，经本发明药物处理后膀胱癌肿瘤细胞开始凋亡，由图3可见膀胱癌肿瘤细胞已经破裂坏死。