携带HSL基因的重组腺病毒在降血脂方面的应用.pdf

本发明公开了一种携带HSL基因的重组腺病毒在降血脂方面的应用，其中，携带HSL基因的重组腺病毒Ad-HSL采用细胞内质粒DNA同源重组法制备取得；降血脂方面的应用包括降低血糖浓度、减轻体重和/或改善血脂代谢异常。通过Ad-HSL治疗DIO小鼠或db/db小鼠模型实验得出：Ad-HSL可明显降低小鼠体重和血脂含量，改善血脂代谢异常现象。Ad-HSL在降血脂方面有积极、有效、可靠的作用，为降低血脂、血糖提供了新的解决思路。

权利要求书
1.  一种携带HSL基因的重组腺病毒在降血脂方面的应用。

2.  根据权利要求1所述的携带HSL基因的重组腺病毒在降血脂方面的应用，其特征在 于，所述携带HSL基因的重组腺病毒采用细胞内质粒DNA同源重组法制备取得。

3.  根据权利要求1所述的携带HSL基因的重组腺病毒在降血脂方面的应用，其特征在 于，所述降血脂方面的应用包括降低血糖浓度、减轻体重和/或改善血脂代谢异常。

说明书携带HSL基因的重组腺病毒在降血脂方面的应用
技术领域
本发明涉及一种生物技术，尤其涉及一种利用携带HSL基因的重组腺病毒进行降低血脂 的应用，属于生物医疗技术领域。
背景技术
随着生活水平的提高，大量高脂、高热量食品被人们广泛食用，同时，随着生活节奏 的加快，生活压力加大，运动量减少，人类身体状态每况愈下，三高人群逐年递增，并开 始成为诱使人类死亡的主要原因。
在基因研究过程中，激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive lipase，HSL)是脂肪分 解的一种限速酶，其能够水解甘油三酯(TG)、甘油二酯(PG)、胆固醇酯和其他脂质及 水溶性底物，并产生游离脂肪酸。HSL主要存在于脂肪组织中，在胰腺、睾丸、肌肉、肾上 腺等组织中也有少量表达。
随着基因工程的深入，探讨基因工程对降低血脂的影响和作用，确定出可行、有效的 降血脂方法，就成为本发明的主要目的。
发明内容
鉴于上述现有情况，本发明旨在提供一种利用携带HSL基因的重组腺病毒进行降血脂的 应用，以满足人类需要，改善血脂含量，促进身体健康。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种携带HSL基因的重组腺病毒在降血脂方面的应用。
其中，HSL为人激素敏感性脂肪酶，其基因序列记载于Langin D，Laurell H，Holst  LS，Belfrage P，Holm C.Gene organization and primary structure of human  hormone-sensitive lipase：possible significance of a sequence homology with a  lipase of Moraxella TA144，an Antarctic bacterium.Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1993June 1；90(11)：4897-901。
所述携带HSL基因的重组腺病毒采用细胞内质粒DNA同源重组法制备取得。具体步骤包 括：将HSL基因克隆到穿梭质粒pXCJL1-CMV/pA的多克隆位点；然后与腺病毒载体GT4050通 过脂质体共转染HEK293细胞，使其进行细胞内同源重组，通过HEK293细胞包装获得携带HSL 基因的重组腺病毒Ad-HSL。对获得的重组腺病毒Ad-HSL进行扩增，采用CsCl密度梯度离心 进行纯化和滴度测定，得到的产品在纯度和滴度方面均符合国家相关标准。
所述降血脂方面的应用包括降低血糖浓度、减轻体重和/或改善血脂代谢异常。
本发明所述的携带HSL基因的重组腺病毒在降血脂方面的应用，其通过对Ad-HSL在DIO 小鼠或db/db小鼠模型的治疗得出：Ad-HSL可明显降低小鼠体重和血脂含量，改善血脂代谢 异常现象。故证明，Ad-HSL在降血脂方面应有积极、有效、可靠的作用，为降低血脂、血 糖提供了新的解决思路。
附图说明
图1治疗后小鼠体重变化曲线对照图；
图2治疗后小鼠血脂指标含量的对比直方图；
图3治疗后小鼠血糖浓度变化的对比直方图；
图4治疗小鼠经q-PCR检测后mRNA含量的对比直方图。
具体实施方式
为证明上述应用，下面结合附图1-4对本发明所述的携带HSL基因的重组腺病毒在降血 脂方面的应用进行详细验证说明：
一、实验动物模型构建
1、Leprdb db(db/db)小鼠模型构建
Leprdb db小鼠，5-6周龄，雄性，普通饲料喂养，自由饮水，12h/12h黑白交替。每3天 称量小鼠体重，每4天检测小鼠随机血糖，待平均体重至30g，随机血糖大于18mmol/L时开 始治疗。
2、饮食诱导肥胖(Diet-Induced-Obese，DIO)小鼠模型构建
3-4周龄C57BL/6J雄性小鼠，普通饲料适应喂养1周后，按空腹体重随机选择8只小 鼠设为正常对照组(Normal)，喂饲普通饲料，其余小鼠喂饲高脂饲料(60Kcal％脂肪， 7Kcal％蔗糖)。每5天称量一次小鼠体重。喂养4周后，在高脂饲料喂养的小鼠中，选择体 重高于对照组平均体重20％的个体，按体重平均分组。
二、动物模型的治疗
雄性DIO小鼠或db/db小鼠平均分成两组，每组8只，在实验第1天和第15天两次给予尾 静脉注射给药。两组分别注射Ad-GFP(2×109IU/0.1mL生理盐水)和Ad-HSL(2×109IU/0.1mL生理盐水)，同时，以8只雄性C57BL/6J小鼠作为正常对照组(Normal)进行对 照。其中，Ad-GFP治疗组的设置是为了排除腺病毒载体本身在治疗过程中可能存在的作 用，其制备过程与Ad-HSL相同；而正常对照组的设置则是为了提供正常指标作为参考。
三、动物试验相关指标检测
1、称量体重
每周两次称量小鼠体重，根据小鼠平均体重绘制体重变化曲线。
2、空腹血糖检测
实验开始后，每周测一次小鼠空腹血糖。方法为：小鼠禁食10小时后，尾部取血，滴 在血糖试纸的反应端，通过血糖测试仪显示出血糖浓度，绘制血糖变化曲线。
3、血脂指标检测
实验结束后，摘除小鼠眼球收集外周血，3000rpm离心10min分离血清，样品进行甘油 三脂(TG)、总胆固醇(CHOL)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)检 测。
四、实验结果
1、Ad-HSL可抑制小鼠体重增长
如图1所示，与Ad-GFP治疗组相比：Ad-HSL治疗组小鼠体重增长速度较慢，可明显抑制 小鼠体重增长。
2、Ad-HSL可显著改善小鼠血脂代谢异常
如图2所示，与Ad-GFP治疗组相比：Ad-HSL治疗组小鼠的血脂代谢异常得到改善、接近 正常值，表现为：总胆固醇(CHOL)含量下降，高密度脂蛋白(HDL-C)含量下降，低密度 脂蛋白(LDL-C)含量下降。
3、Ad-HSL可显著改善小鼠血糖浓度
如图3所示，与Ad-GFP治疗组相比：在各治疗周期内，Ad-HSL治疗组小鼠的血糖浓度显 著降低。
4、Ad-HSL可提高棕色脂肪特异性基因的mRNA含量
如图4所示，经q-PCR检测，Ad-HSL治疗组小鼠脂肪组织中，棕色脂肪特异性基因 uncoupling protein 1(UCP-1)，PRD1-BF1-RIZ1homologous domain containing 16 (Predm 16)的mRNA含量显著提高。其中，棕色脂肪可以分解引发肥胖的白色脂肪，棕色脂 肪特异性基因UCP-1和Predm16的mRNA含量的提高，表明Ad-HSL治疗组小鼠体内白色脂肪的 代谢能力提高，即有利于减轻体重。