一种制备绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物的方法及应用.pdf

本发明公开了一种制备绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物的方法，包括如下步骤：(1)获取原生质体：分别选取绞股蓝和丝瓜的愈伤组织细胞通过酶液进行处理并过滤、离心后用培养基悬浮沉淀得到绞股蓝原生质体或丝瓜原生质体；(2)绞股蓝原生质体和丝瓜原生质体融合及筛选：采用电融合法将绞股蓝原生质体和丝瓜原生质体融合后对杂交原生质体筛选，进行继代培养后制备绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物。本发明制备的绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物质量可控，能综合两植物的功效其效果更佳且无毒。

权利要求书
1.  一种制备绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)获取原生质体：
1)配制酶液：分别选取质量分数为1.0-2.0％纤维素酶、0.1-0.2％果胶酶、6-12％甘露醇及CPW洗液配制成酶液；
2)分别选取绞股蓝和丝瓜的愈伤组织细胞进行如下处理：按愈伤组织细胞与酶液质量比为(1-3):10的比例将所述绞股蓝或丝瓜的愈伤组织细胞中加入酶液中，在23-30℃黑暗环境中，转速为50-100r/min的条件下酶解8-12h,过滤并收集滤液置于离心管中，100g-300g离心2-15min后弃去上清液；用CPW洗液悬浮沉淀，混合均匀后取100g-300g离心2-15min，弃去上清液；然后用含0.2-0.4M甘露醇的MS液态培养基和0.2-0.4M甘露醇的原生质体培养基洗涤；接着用含0.2M甘露醇的原生质体培养基重悬沉淀得到绞股蓝原生质体或丝瓜原生质体；并分别对绞股蓝原生质体、丝瓜原生质体进行标记；
(2)绞股蓝原生质体和丝瓜原生质体融合及筛选：
1)融合：将绞股蓝原生质体和丝瓜原生质体等体积混合成混合液后静置，采用细胞融合仪进行融合，电融合液为0.6moL/L甘露醇和0.1mmoL/L CaCl2，融合后静置，并加入原生质体培养基进行离心，离心后将沉淀重悬；
2)杂交原生质体筛选：
选出杂交原生质体培养，待长出愈伤组织后进行继代培养；
(3)杂交细胞提取物的制备：将继代培养后的绞股蓝/丝瓜杂交细胞干燥。

2.  根据权利要求1所述的一种制备绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物的方法，其特征在于，所述CPW洗液由101mg/L KNO3、27mg/L KH2PO4、246mg/L MgSO4.7H20、1480mg/L CaC12.2H2O配制而成。

3.  根据权利要求1所述的一种制备绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物的方法，其特征在于，所述步骤(1)中过滤采用孔径不大于70μm网筛过滤；重复所述CPW洗液悬浮沉淀并离心除去上清液不少于2次；原生质体培养基的用量为酶液体积的1/4～1/5。

4.  根据权利要求1所述的一种制备绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物的方法，其特征在于，所述步骤(1)中对绞股蓝原生质体或丝瓜原生质体采用不同颜色的荧光染料进行标记。

5.  根据权利要求1所述的一种制备绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物的方法，其特征在于，所述步骤(2)中绞股蓝原生质体和丝瓜原生质体混合液于融合池静置；所述电融合液的pH为7.0-7.5。

6.  根据权利要求1所述的一种制备绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物的方法，其特征在于，步骤(2)中所述绞股蓝原生质体和丝瓜原生质体融合后静置20-30min,然后转入离心管，加10倍于混合液体积的原生质体培养基，200g离心5min,离心后的沉淀用原生质体培养基重悬稀释，采用浅层液态培养法培养；将所述杂交原生质体筛选出来后，在黑暗环境下于25℃±2℃的培养箱中培养；所述杂交原生质体长出愈伤组织后每三周继代培养一次。

7.  根据权利要求1所述的一种制备绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物的方法，其特征在于，步骤(3)中将所述继代培养后的绞股蓝/丝瓜杂交细胞于(-100℃)-(-60℃)环境下冷冻，干燥后研磨成粉末，并采用不小于60目的筛网筛选。

8.  权利要求1所述的方法制得的绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物在护肤品中应用。

9.  如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述护肤品为面膜、爽肤水、面霜、乳液、眼霜、洗面乳。

10.  如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物在护肤品中的添加量为10-50μg/ml。

说明书一种制备绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物的方法及应用
技术领域
本发明属于生物美容领域，具体涉及具有美容功效的绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物在美容护肤中的应用。
背景技术
绞股蓝又名七叶胆、五叶参、七叶参等，为葫芦科绞股蓝属多年生草质藤本植物。绞股蓝营养丰富，生理活性广泛，对机体调节免疫系统、抗肿瘤、降血脂、镇痛、防衰老和延年益寿均有良效，被誉为“南方人参”、“长寿保健品”。其细胞提取物中含多种活性成分，例如：绞股蓝皂苷，黄酮类化合物，多糖，维生素及多种微量元素，具有抗衰老，抗氧化等功效。
丝瓜，是一种常见的食用蔬菜，其在美容上的功效自古由来，国内民间很早已知收集丝瓜茎汁，称“天罗水”(丝瓜古亦称“天罗”《事类台壁》)用来搽面营养皮肤，作为美容液。与绞股蓝一样，它也含有与人参相同的人参皂苷，除此以外，其细胞提取物还含有许多三萜类化合物，多糖等，具有抗炎、杀虫灭菌、晒后修复、美白保湿等功效。
但绞股蓝和丝瓜的植株生长需要多年时间，而且受到地域，气候，季节以及病虫害等的影响与威胁，其植株提取物品质不稳定，因此效果难以控制。此外，单种类的绞股蓝或丝瓜的提取物美容护肤效果单一，难易满足市场的需求。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，本发明的目的提供了一种对绞股蓝和丝瓜进行杂交得到杂交细胞系的方法，不仅质量可控，而且效果比单种植物来源的细胞系效果更佳，且对生物体无毒。
通过以下技术方案来实现：
一种制备绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物的方法，包括以下步骤：
(1)获取原生质体：
1)配制酶液：分别选取质量分数为1.0-2.0％纤维素酶、0.1-0.2％果胶酶、6-12％甘露醇及CPW洗液配制成酶液；
2)分别选取绞股蓝和丝瓜的愈伤组织细胞进行如下处理：按愈伤组织细胞与酶液质量比为(1-3):10的比例将所述绞股蓝或丝瓜的愈伤组织细胞中加入酶液中，在23～30℃黑暗环境中，转速为50～100r/min的条件下酶解8～12h,过滤并收集滤液置于离心管中，100g-300g离心2-15min后弃去上清液；用CPW洗液悬浮沉淀，混合均匀后取100g-300g离心2-15min，弃去上清液；然后用含0.2-0.4M甘露醇的MS液态培养基和0.2-0.4M甘露醇的原生质体培养基洗涤；接着用含0.2M甘露醇的原生质体培养基重悬沉淀得到绞股蓝原 生质体或丝瓜原生质体；并分别对绞股蓝原生质体、丝瓜原生质体进行标记；
(2)绞股蓝原生质体和丝瓜原生质体融合及筛选：
1)融合：将绞股蓝原生质体和丝瓜原生质体等体积混合成混合液后静置，采用细胞融合仪进行融合，融合后静置，并加入原生质体培养基进行离心，离心后将沉淀重悬；
2)杂交原生质体筛选：
选出杂交原生质体培养，待长出愈伤组织后进行继代培养；
(3)杂交细胞提取物的制备：将继代培养后的绞股蓝/丝瓜杂交细胞超声破碎，过滤后，冷冻干燥。
所述CPW洗液由101mg/L KNO3、27mg/LKH2PO4、246mg/LMgSO4.7H20、1480mg/LCaC12.2H2O配制而成。
所述步骤(1)中过滤采用孔径不大于70μm网筛过滤；重复所述CPW洗液悬浮沉淀并离心除去上清液不少于2次；原生质体培养基的用量为酶液体积的1/4～1/5。
所述步骤(1)中对绞股蓝原生质体或丝瓜原生质体采用不同颜色的荧光染料进行标记。
所述步骤(2)中绞股蓝原生质体和丝瓜原生质体混合液于融合池静置；电融合液为0.6moL/L甘露醇和0.1mmoL/L CaCl2，将电融合液的pH为7.0-7.5
所述步骤(2)中所述绞股蓝原生质体和丝瓜原生质体融合后静置20-30min,然后转入离心管，加10倍于混合液体积的原生质体培养基，200g离心5min,离心后的沉淀用原生质体培养基重悬稀释，采用浅层液态培养法培养；将所述杂交原生质体筛选出来后，在黑暗环境下于25℃±2℃的培养箱中培养；所述杂交原生质体长出愈伤组织后每三周继代培养一次。
步骤(3)中将所述继代培养后的绞股蓝/丝瓜杂交细胞超声破碎，并采用不小于0.22μm过滤器过滤，于(-100℃)-(-60℃)环境下冷冻干燥。
本发明所述的方法制得的绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物在护肤品中应用。
优选的，所述护肤品为面膜、爽肤水、面霜、乳液、眼霜、洗面乳。
优选的，所述绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物在护肤品中的添加量为10-50μg/ml。
有益效果：
1、质量可控。采用细胞系提取物，比用植株提取物，生产质量更加可控。因为不会受地域，季节，气候，病虫害影响。
2、效果更佳且无毒。采用电熔合法对绞股蓝和丝瓜原生质体融合得到杂交的细胞系，实验表明效果比单种植物来源的细胞系能综合两植物的功效其效果更佳且对生物体无毒。
附图说明
图1各细胞提取物的抗氧化效果图
图2各细胞提取物对光老化人皮肤纤维细胞凋亡的影响图
图3各细胞OD值示意图
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例1
制备绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物、绞股蓝细胞提取物、丝瓜细胞提取物的制备
1、制备绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物
(1)获取绞股蓝和丝瓜原生质体
1)配制酶液：分别选取质量分数为1.0％纤维素酶、0.1％果胶酶、8％甘露醇及CPW洗液(101mg/L KNO3、27mg/LKH2PO4、246mg/LMgSO4.7H20、1480mg/LCaC12.2H2O)配制成酶液，过滤除菌。
2)分别选取绞股蓝和丝瓜的愈伤组织细胞进行如下处理：在每1g所述绞股蓝或丝瓜的愈伤组织细胞中加入10ml酶液，在27℃和黑暗环境中，及转速控制在50r/min的条件下酶解8h,将酶解后的原生质体通过70μm孔径的一次性网筛过滤，以除去未酶解完全的细胞团。收集滤液置于离心管中，200g离心5min后弃去的上清液；用CPW洗液悬浮沉淀，混合均匀后取200g离心5min，弃去上清液，重复此步骤3次；然后用MS液体培养基洗涤1次；接着用2mL原生质体培养基悬浮沉淀得到绞股蓝原生质体或丝瓜原生质体；
往绞股蓝原生质体中标记红色荧光染料，丝瓜原生质体中标记绿色荧光染料。
(2)绞股蓝原生质体和丝瓜原生质体融合及筛选：
采用电融合法进行绞股蓝及丝瓜原生质体融合。电融合液为0.6moL/L甘露醇和0.1mmoL/L CaCL2，pH为7.0，并对电融合液进行高压灭菌，原生质体用电融合液重悬后，200g离心5min，然后用电融合液悬浮备用。
1)融合：将绞股蓝原生质体和丝瓜原生质体等体积混合成混合液，将融合液至融合池中静置10min左右，待原生质体沉淀稳定后在交流电场强度100V/cm、交流电场作用时间为35s、直流脉冲强度为1000V/cm、直流脉冲作用时间为50μs、直流脉冲次数为3次、直流脉冲间隔时间为2s的条件下进行融合；融合后静置30min，然后转入15mL离心管，加原生质体培养基至8mL，800r/min离心6min。沉淀用原生质体培养基稀释至低密度(5x104个/mL)，吸取lmL于直径3.5cm的培养皿中。
2)杂交原生质体筛选：
在荧光显微镜下，把红绿相间或褐色的原生质体标记出来，放入温度25℃的培养箱中黑暗条件下进行培养。待长出愈伤组织后，每三周继代一次。
(3)杂交细胞提取物的制备：取扩增后的绞股蓝/丝瓜杂交细胞，加入适量超纯水后，超声破碎，300g离心5min后，过0.22μm滤膜，用BCA试剂盒测定蛋白浓度后，备用。
2、制备绞股蓝细胞提取物：制备方法同制备绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物的方法。
3、丝瓜细胞提取物的制备：制备方法同制备绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物的方法。
实施例2：绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物、绞股蓝细胞提取物、丝瓜细胞提取物的抗氧化实验
采用DPPH法测定实例一制备的绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物、绞股蓝细胞提取物、丝瓜细胞提取物清除自由基的能力。
将绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物、绞股蓝细胞提取物、丝瓜细胞提取物配制成浓度为0.2mg/mL溶液,分别作为实验组。采用0.2mg/ml的抗坏血酸(VC)作为阳性对照组。将绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物、绞股蓝细胞提取物、丝瓜细胞提取物分别与0.2mg/ml的DPPH等体积反应完全且30min后,记录最终吸光度。
其中，自由基清除率(％)＝[1-(样本加入DPPH的吸光度–样本的吸光度)/DPPH的吸光度]×100％
由图1可知，绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物、绞股蓝细胞提取物、丝瓜细胞提取物三种样品均有不同程度的对抗自由基作用，其中绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物样品的效果最佳。
实施例3：绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物、绞股蓝细胞提取物、丝瓜细胞提取物对光老化人皮肤纤维细胞凋亡的影响
制备绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物、绞股蓝细胞提取物、丝瓜细胞提取物的制备
1、制备绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物
(1)获取绞股蓝和丝瓜原生质体
1)配制酶液：分别选取质量分数为2.0％纤维素酶、0.2％果胶酶、12％甘露醇及CPW洗液(101mg/L KNO3、27mg/LKH2PO4、246mg/LMgSO4.7H20、1480mg/LCaC12.2H2O)配制成酶液，过滤除菌。
2)分别选取绞股蓝和丝瓜的愈伤组织细胞进行如下处理：在每3g所述绞股蓝或丝瓜的愈伤组织细胞中加入10ml酶液，在30℃和黑暗环境中，及转速控制在100r/min的条件下酶解12h,将酶解后的原生质体通过70μm孔径的一次性网筛过滤，以除去未酶解完全的细胞团。收集滤液置于离心管中，在离心力为200g下离心5min后弃去的上清液；用CPW洗液悬浮沉淀，混合均匀后在离心力200g下离心5min，弃去上清液，重复此步骤3次；然后用MS液体培养基洗涤1次；接着用2mL原生质体培养基悬浮沉淀得到绞股蓝原生质体或丝瓜原生质体；往绞股蓝原生质体中标记红色荧光染料，丝瓜原生质体中标记绿色荧光染料。
(2)绞股蓝原生质体和丝瓜原生质体融合及筛选：
采用电融合法进行绞股蓝及丝瓜原生质体融合。电融合液为0.6moL/L甘露醇和0.1mmoL/L CaCL2，pH为7.5，并对电融合液进行高压灭菌，原生质体用电融合液重悬后，在离心力为200g下离心5min，然后用电融合液悬浮备用。
1)融合：将绞股蓝原生质体和丝瓜原生质体等体积混合成混合液，将融合液至融合池中静置10min左右，待原生质体沉淀稳定后在交流电场强度100V/cm、交流电场作用时间为35s、直流脉冲强度为1000V/cm、直流脉冲作用时间为50μs、直流脉冲次数为3次、直流脉冲间隔时间为2s的条件下进行融合；融合后静置30min，然后转入15mL离心管，加原生质体培养基至8mL，800r/min离心6min。沉淀用原生质体培养基稀释至低密度(5x104个/mL)，吸取lmL于直径3.5cm的培养皿中。
2)杂交原生质体筛选：
在荧光显微镜下，把红绿相间或褐色的原生质体标记出来，放入温度25℃的培养箱中黑暗条件下进行培养。待长出愈伤组织后，每三周继代一次。
(3)杂交细胞提取物的制备：取扩增后的绞股蓝/丝瓜杂交细胞备用。
2、制备绞股蓝细胞提取物：制备方法同制备绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物的方法。
3、丝瓜细胞提取物的制备：制备方法同制备绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物的方法。
采用TUNEL法测定实施例三制备的绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物、绞股蓝细胞提取物、丝瓜细胞提取物对人真皮层纤维细胞生长的影响。
检测样品：实施例3制备的绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物、绞股蓝细胞提取物、丝瓜细胞提取物。
受试生物体：HSF细胞。
具体步骤如下所示：
(1)采用体积比为10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养基(青霉素200U/ml、链霉素250U/ml，pH7.2)培养HSF细胞，当细胞密度达到融合80％时，利用0.25％胰酶消化细胞，用PBS以1x104个/ml接种于T25瓶子中，用采用长波紫外线(UVA)照射方法建立光老化HSF细胞模型，照射剂量36J/cm2。
(2)分别用完全培养基稀释杂交细胞、丝瓜细胞、绞股蓝细胞提取物至终浓度为50μg/ml，通过0.22μm一次性网筛过滤。HSF经照射后，弃PBS后，分别添加上诉培养基。37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中继续培养；以添加不加样的完全培养基为模型组，以不经紫外照射的HSF为对照组。
(3)12h后，按TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒的方法检测细胞凋亡数。
由图2可知，三个样本均有抗光老化作用，其中绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物能够明显抑制光老化HSF的凋亡。
实施例4：绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物的毒性评价
本实施例采用对实施例1制备的绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物的毒性进行评价。主要分为三部分试验，即绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物的小鼠急性经口毒性试验(一次限量法)、绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物的大鼠急性经皮毒性试验(一次限量法)和绞股蓝/丝瓜杂交 细胞提取物的家兔皮肤光毒性试验。
一、绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物的小鼠急性经口毒性试验(一次限量法)
样品：采用实施例1制备的绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物。
受试生物体：昆明小鼠。
试验方法：
前期体外试验：把杂交细胞提取物(即绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物)配置成50μg/ml浓度，加入培养基中，用CCK-8法检测其增殖能力：取HSF细胞，以每孔2000个细胞接种于96孔板中，取第一，三，五，七天的细胞作检测，添加10μl染色剂，在培养2h。用酶标仪在450nm处检测OD值，与不添加杂交细胞提取物的培养基培养作对照，每组作6个重复,取平均值，其实验结果见图3。
从图3中可知，杂交细胞提取物对HSF没有毒性影响，细胞生长正常，甚至有一定的促进作用。
因此，前期体外实验的结果表明，绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物基本无毒，因此采用一次限量法证实其对生物体的安全性，即一次最大灌胃剂量采用其10倍实效标示药量(50.0±0.5μl/支×10支)的受试物对10只昆明小鼠(雌雄各半，体重为20.0±0.2g)进行灌胃，观察其毒性反应，当未引起动物死亡，则不再进行多个剂量的急性经口毒性试验。
观察期限：14天。
实验结果观察：未观察到试验动物有任何不良反应，亦没有动物死亡。说明本发明的绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物冻干粉无急性经口毒性作用。
二、绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物的大鼠急性经皮毒性试验(一次限量法)
样品：实施例1制备的绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物。
受试生物体：SD大鼠(广东省动物实验中心)。
试验方法：
前期体外实验的结果表明，绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物基本无毒，因此采用一次限量法进一步证实其对生物体的安全性，即用10只动物(雌雄各半，体重为149.1±12.4g)，皮肤涂抹2000mg/kg体重剂量的绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物，当未引起动物死亡，则不再进行多个剂量的急性经皮毒性试验。
观察期限：14天。
观察结果：未观察到试验动物有任何不良反应，亦没有动物死亡。说明本发明的绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物冻干粉无皮毒性作用。
三、绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物的家兔皮肤光毒性试验
样品：实施例1制备的绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物。
受试生物体：成年白色家兔(广东省动物实验中心)50只，雌性各半。
UV光源：波长为320nm～400nm的UVA。
照射时间：1.5h。
试验步骤：
进行正式光毒试验前18～24h，将家兔脊柱两侧皮肤去毛，试验部位皮肤需完好，无损伤及异常；备4块去毛区，每块去毛面积约为2cm×2cm，去毛皮的试验安排如表1所示；将动物固定，根据下表，在动物去毛区1和2分别涂敷1m绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物；30min后，左侧(去毛区1和3)用铝箔复盖，胶带固定，右侧用UVA进行照射，结束后分别于1、24、48和72h观察皮肤反应，根据皮肤刺激反应评分表判断是否对皮肤有刺激反应，结果如表2所示。
表1动物去毛区的试验安排
去毛区编号试验处理1涂受试物，不照射2涂受试物，照射3不涂受试物，不照射4不涂受试物，照射
表2皮肤刺激评反应评分表

试验结果表明：60只受试家兔在处理后1h、24h、48h和72h均未观察到皮肤刺激反应，表明本发明的绞股蓝/丝瓜杂交细胞提取物冻干粉无光毒性作用。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。