中国林蛙lectin样功能基因Rdr-lec序列、构建方法及其氨基酸序列和用途 【技术领域】
本发明涉及一种中国林蛙功能序列及其编码的蛋白序列，具体地说是一种中国林蛙lectin样抗肿瘤功能基因Rdr-lec序列及其编码的氨基酸序列和其用途。
背景技术
目前国际上仅研究报道了从日本稻田蛙(Rana Japonica)、牛蛙(Ranacatesbeiana)等蛙中分离得到具有凝集素活性的核糖核酸酶jSBL([1]FusaoSakakibara，Hiroaki Kawauchi，Giichi Takayanagi，Hitomilse.Egg lectinof Rana japonica and its receptor glycoprotein of ehrlich tumor cells.1979.Cancer research.39：1347-1352)与cSBL([2]Kazuo Nitta，GiichiTakayanagi，Hiroaki Kawauchi，Sen-itiroh Hakomori.Isolation andCharacterization of Rana catesbeiana Lectin and Demonstration of theLectin-binding Glycoprotein of Rodent and Human Tumor Cell Membranes.1987.CANCER RESEARCH.47，4877-4883)。
Sakakibara等[1]从日本稻田蛙的卵中分离出一种具有凝集活性的核糖核酸酶jSBL，可优先凝集大量的各种人类和动物的肿瘤细胞，而不是正常的红细胞，淋巴细胞，或成纤维细胞。Nitta等[2]从牛蛙卵中也分离出具有凝集各种肿瘤细胞作用的核糖核酸酶cSBL。具有凝集活性的核糖核酸酶可识别大量的各种肿瘤细胞的细胞表面糖蛋白特征的具体组织结构和方向，这无疑对于人类癌症提供了一个重要的基础诊断和治疗。
cSBL和jSBL蛋白对体内的各种癌细胞均表现出细胞毒性，其中cSBL已被证明是一种在体外非常有效用的化疗药物。在一项有关的实验研究中，研究人员将肿瘤细胞注入小鼠腹膜内腔，24小时后开始每天按一定剂量对其中部分小鼠进行治疗。研究结果表明，被治疗小鼠的存活时间显著高于未被治疗小鼠的存活时间。
对cSBL进行的研究显示，其酶活性不受人类RNA酶抑制因子的抑制，它们一旦进入细胞中，其降解肿瘤细胞RNA、杀死癌细胞的作用能很好地发挥，有利于作为抗癌药物应用。
中国林蛙是中国特有的两栖动物资源，目前国内对于中国林蛙的研究开发仅局限于林蛙油及林蛙抗菌肽等，对于其凝集素样的核糖核酸酶及其抗肿瘤作用的研究在国际国内均属于空白。
【发明内容】
本发明的目的在于弥补现有技术的缺陷而提出一种中国林蛙lectin样功能基因Rdr-lec序列。
本发明另一目的在于提出一种上述中国林蛙lectin样功能基因Rdr-lec序列的构建方法。
本发明的又一目的在于提出一种中国林蛙lectin样功能基因Rdr-lec的氨基酸序列。及由该氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的且与该氨基酸序列功能相同的氨基酸衍生序列。
本发明的再一目的在于提出一种中国林蛙lectin样功能基因Rdr-lec序列的用途。
为实现上述目的，本发明的发明思路为：
降解DNA的药物所导致的凋亡与野生型p53肿瘤遏制物的存在与否关系密切，在p53缺失的情况下，降解DNA的药物对肿瘤无效。目前人类的大部分肿瘤(尤其是实质性肿瘤)都能通过变异使p53失活，或产生p53抗体。而且，导致DNA损伤的药物往往能够使正常细胞产生基因变异。而由lectin样核糖核酸酶介导的肿瘤细胞凝集和对肿瘤细胞的选择性杀伤作用与野生型p53肿瘤遏制物的存在与否无关，并且不产生基因的变异，因此，作为降解RNA的lectin样核糖核酸酶在药物治疗方面具有优势。
本发明基因序列从中国林蛙基因组中扩增得到的，是一条新基因。其编码的功能蛋白可作为一种有选择性的细胞毒素，其是以中国林蛙为基础的，作为制备新型、高效的抗肿瘤功能生物药物的应用，具有重要的医药开发应用价值。
本发明采用的具体技术方案为：
一种中国林蛙lectin样功能基因Rdr-lec序列，其为序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，具体如下：
成熟蛋白编码区基因序列
＞Rdr-lec
cagaactggc caacatttca gcagaagcac atttcaagca atccaaccat cgtctgtaac 60
agcatcatga acaacatcat atatatcgta ggaggtcaat gcaaggaacg caacactttc 120
ataatttctt ctgcaaccac cgtaagggcc atctgtagcg gggcgtcaac cgatagaaat 180
gtattaagta ccacaagatt ccagctcaac acttgcattc gtagtgccat tgtaccccgc 240
ccttgtccat atacctccag accggaaact aatgtgatat gtgtaaaatg tgagaataga 300
cttcccgtac attttgttgg aataggaagt tgt 333
一种中国林蛙lectin样功能基因Rdr-lec地氨基酸序列，其为序列表中SEQID No.2所示的氨基酸序列，具体如下：
由基因序列推导得到成熟蛋白编码区蛋白序列
＞Rdr-lec
QNWPTFQQKH ISSNPTIVCN SIMNNIIYIV GGQCKERNTF IISSATTVRA ICSGASTDRN 60
VLSTTRFQLN TCIRSAIVPR PCPYTSRPET NVICVKCENR LPVHFVGIGS C 111
上述的一种中国林蛙lectin样功能基因Rdr-lec序列的构建方法，其具体步骤为：提取出中国林蛙的基因组DNA，设计基因特异性引物，进行PCR扩增，产物电泳，从电泳胶中回收目标DNA片段，与质粒连接，转移到细胞，提取质粒，PCR初步鉴定目标基因后，测序。
上述的一种中国林蛙lectin样功能基因Rdr-lec序列的构建方法，其中，所述的基因特异性引物为：
正向引物NP1：ATG TGT GCA AAA TCT CTT CTT CTG G
反向引物CP0：GTA AAG CGT TGC TTG ACC AAG TAA TT
上述的一种中国林蛙lectin样功能基因Rdr-lec序列的构建方法，其中，所述PCR反应体系及参数：
基因组模板100ng、dNTPs(10mM)1μL、10×Taq Buffer 5μl、Taq DNAPolymerase 3U和引物(NP1，CP0)各30pmol、补无菌超纯水至总体积为50μl，混合均匀；
扩增条件为：94℃30s，48℃30s，72℃50s，35个循环，72℃延伸7min结束。
上述的一种中国林蛙lectin样功能基因Rdr-lec序列的构建方法，其中，所述与质粒连接的具体步骤为：
(1)目标DNA片断(20ng)、pGM-T载体(50ng)、T4 DNA Ligase 3U、10×T4DNA Ligase Buffer 1μl，补无菌超纯水至总体积10μl；
(2)16℃连接10～12小时制备成连接好载体的基因；
(3)对步骤(2)连接好的样品进行PCR检测；连接产物1μl、dNTPs(10mM)1μL、10×Taq Buffer 5μl、Taq DNA Polymerase3U和质粒通用引物(T7，SP6)各10pmol，补无菌超纯水至总体积50μl，混合均匀；PCR扩增条件：94℃30s，48℃30s，72℃50s，35个循环，72℃延伸7min结束；
(4)2.5％TAE琼脂糖凝胶中上样电泳检测，紫外分析仪中，观察DNA条带。
上述的一种中国林蛙lectin样功能基因Rdr-lec序列的构建方法，其中，所述转移到细胞的具体步骤为：
(1)将5μl(50ng)目标基因与质粒连接的产物(重组质粒pGM-lec)加入到100μl感受态细胞DH5α中，混匀，冰浴30min；
(2)42℃水浴中热激90s；取出后立即置于冰浴2min；
(3)加入500μl提前37℃预热好的不含抗生素的LB培养基，37℃，150rpm摇床培养45min；
(4)4000rpm离心2min，弃部分上清液，浓缩后取100μl涂转化平板，涂匀，干燥，倒置平板，37℃恒温箱培养16h；
(5)挑取分离良好、中等大小的白色菌落接种到含有抗生素的LB液体培养基中，摇床37℃、180rpm培养12h。
上述的一种中国林蛙lectin样功能基因Rdr-lec序列的构建方法，其中，所述提取质粒PCR鉴定的PCR反应体系及参数为：
提取的重组质粒(pGM-lec)1μl、dNTPs(10mM)0.5μL、10×Taq Buffer 2μl、Taq DNA Polymerase 1.5U和质粒通用引物(T7，SP6)各5pmol，补无菌超纯水至总体积20μl，混合均匀；
PCR扩增条件：94℃30s，48℃30s，72℃50s，35个循环，72℃延伸7min结束。
本发明所述的一种中国林蛙lectin样功能基因Rdr-lec序列可以在制备治疗抗肿瘤药物中应用。
本发明的优点与效益：
本发明首先提取中国林蛙的基因组DNA，设计特异性引物，PCR扩增基因，测定基因顺序。经过数据库检索，确定为新的基因Rdr-lec，即本发明所述的中国林蛙lectin样功能基因Rdr-lec序列。经实验表明，本发明所述中国林蛙lectin样功能基因Rdr-lec序列的蛋白有在治疗耐药病原菌引起的感染性疾病方面具有应用价值，且本发明所述重组蛋白在制备治疗肿瘤细胞的生物药物中具有广泛的应用价值。
下面结合附图及最佳实施方式对本发明做进一步说明，以使公众对发明内容有整体和充分的了解，而并非对本发明保护范围的限定。前述部分已经充分公开了本发明可以实施的保护范围，因此凡依照本发明公开内容进行的任何本领域公知的等同替换，均属于对本发明的侵犯。
【附图说明】
图1为目的基因PCR扩增结果图；
图2为载体连接检测结果图；
图3为转移到细胞的转化结果图；
图4为质粒PCR扩增检测结果图；
图5为空载体诱导表达对宿主菌生长无影响图；
图6为重组蛋白诱导表达对宿主菌生长有抑制作用图；
图7为大肠杆菌裂解液的SDS-PAGE图；
图8为SDS-PAGE检测亲和胶纯化后重组蛋白的纯度图；
图9为大肠杆菌裂解液总蛋白与纯化的重组蛋白Western blotting检测图；
图10为重组融合蛋白对HeLa肿瘤细胞的生长抑制作用图。
【具体实施方式】
本发明具体实施方式所用材料及设备来源：
1、实验动物：中国林蛙(Rana dybowskii)来源：吉林省桦甸市，选择标准：识别特征：皮色多为深褐色，肚黄色，嘴端略钝圆，耳膜边有羊角黑瘢，颈背处有″∧″形黑斑，四肢有环行黑斑。
2、所用菌种和载体：大肠杆菌感受态细胞DH5α，pGM-T载体(均购于TIANGEN生物技术有限公司)。
3、工具酶与生化试剂：
琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，硅胶膜型PCR产物(DNA片断)纯化试剂盒，普通质粒小提试剂盒，Tryptone，Yeast Extract，Agarose，氨苄青霉素，X-Gal，IPTG等(均购于TIANGEN生物技术有限公司)，dNTPs，T4DNA Ligase，λDNA/HindIII，Taq DNA Polymerase，EcoR I，HindIII，1kb DNA Ladder，DNA Marker I(均购于TaKaRa公司)，基因组DNA提取试剂盒、核酸染料GoldView，50bp DNALadder(购于北京赛百盛生物技术有限公司)，其它试剂均为市售分析纯。
4、设备和器材
TGL-16C型 台式离心机，上海安亭科学仪器厂；
HQ-60型 旋涡混合器，北方同正生物技术发展公司；
PCR扩增仪9700型，Gene Amp公司；
THZ-D型 台式恒温振荡器，太仓市实验设备厂；
UV-IV型紫外分析仪，北京市新科技应用研究所；
SPN202F型电子天平，梅特勒-托利多称重设备系统有限公司；
DYY-6C型 电泳仪 北京市六一仪器厂；
DYCP-31DN型 电泳槽，北京六一仪器厂；
LRH-250型 生化培养箱，上海一恒科技有限公司；
LS-835L型 立式压力蒸汽灭菌锅 江阴江滨医疗设备厂；
SWCJ-B型 净化工作台，天津市中环实验电炉有限公司；
DZKW型 电子恒温水浴锅，光明牌。
本发明一种中国林蛙lectin样抗肿瘤功能基因Rdr-lec序列的具体构建方法：
1、引物设计
基因特异性引物
正向引物NP1：ATG TGT GCA AAA TCT CTT CTT CTG G
反向引物CP0：GTA AAG CGT TGC TTG ACC AAG TAA TT
2、目标基因的PCR扩增
(1)使用血液基因组提取试剂盒，从林蛙新鲜血液中提取基因组DNA，1％琼脂糖电泳检测分子量及浓度。
(2)向无菌PCR管中加入基因组模板100ng、dNTPs(10mM)1μL、10×Taq Buffer5μl、Taq DNA Polymerase 3U和引物(NP1，CP0)各30pmol、补无菌超纯水至总体积为50μl，混合均匀；
(3)将加入样品的PCR管放入已经预热好的PCR仪中进行PCR反应。PCR扩增条件：94℃30s，48℃30s，72℃50s，35个循环，72℃延伸7min结束。
(4)PCR结束后，在2.5％TAE琼脂糖凝胶中上样电泳检测并切胶纯化目标基因。紫外分析仪中，观察DNA条带。
目标基因PCR扩增结果如图1所示，经PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳，以50bpDNALadder为参照标准，在紫外分析仪中，可看到约在500bp位置(完整开放阅读框架，包括信号序列，准确值为495bp)出现明亮的荧光条带，证明目的基因扩增成功，切胶纯化后可用于接下来的载体连接。
3、pGM-T载体连接
(1)向无菌PCR管中加入目标基因片断(20ng)、pGM-T载体(50ng)、T4DNALigase 3U、10×T4DNA Ligase Buffer 1μl，补无菌超纯水至总体积10μl；
(2)16℃连接10～12小时制备成连接好目标基因的载体；
(3)对连接好的样品进行PCR检测。向无菌PCR管中加入连接产物1μl、dNTPs(10mM)1μL、10×Taq Buffer 5μl、Taq DNA Polymerase3U和质粒通用引物(T7，SP6)各10pmol，补无菌超纯水至总体积50μl，混合均匀。
(4)将加入样品的PCR管放入已经预热好的PCR仪中进行PCR反应。PCR扩增条件：94℃30s，48℃30s，72℃50s，35个循环，72℃延伸7min结束。
(5)PCR结束后，在2.5％TAE琼脂糖凝胶中上样电泳检测。紫外分析仪中，观察DNA条带。
pGM-T载体连接检测结果如图2所示，对16℃连接过夜的结果进行PCR及琼脂糖电泳检测，在紫外分析仪中，以Marker I为参照标准，可看到在600bp位置出现明亮的荧光条带，与预期结果基本一致，证明载体连接成功，可进行后续实验。
4、制备转化平板
(1)配制LB及LB/Agar培养基
①LB液体培养基配制(500ml)：Tryptone 5g、Yeast Extract 2.5g、NaCl 5g，加入400ml水，充分搅拌溶解，滴加5N NaOH(约0.2ml)，调pH值到7.0，再加水定容至500ml(取出200ml用于配制固体培养基，300ml分装两瓶，各150ml)。121℃，0.1MPa，高压灭菌20min。4℃存放。
②LB/Agar/Amp固体培养基配制：按LB液体培养基准备好，高压灭菌前加入Agar 3g/200ml，高压灭菌，冷却至55℃，在超净台上向其中加入抗生素(氨苄青霉素)0.2ml，混匀，倒平板(20ml/板)，4℃存放。
(2)在超净台上，向铺好含有相应抗生素的LB/Agar/Amp固体培养基表面加入16μl IPTG(50mg/ml)、40μl X-Gal(20mg/ml)，使用无菌涂棒涂匀，避光37℃恒温箱中放置1～3小时后使用。
5、转化感受态细胞DH5α
(1)5μl(50ng)连接产物加入到100μl感受态细胞中，混匀，冰浴30min。
(2)42℃水浴中热激90s。取出后立即置于冰浴2min。
(3)加入500μl提前37℃预热好的LB培养基(不含抗生素)，37℃，150rpm摇床培养45min。
(4)4000rpm离心2min，弃部分上清液，浓缩后取100μl涂转化平板，涂匀，干燥，倒置平板，37℃恒温箱培养16h。
(5)挑取分离良好、中等大小的白色菌落接种到含有抗生素的LB液体培养基中，摇床37℃、180rpm培养12h。
转化结果如图3所示，16h培养后，经连接、转化的目的基因在培养基上长出蓝色和白色两种菌落，其中白色菌落为所需目的菌，在经过菌落检测后，若结果正确，则可用于液体培养及质粒提取。
6、提取质粒、扩增及测序
(1)用质粒提取试剂盒提取质粒。用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测质粒。
(2)PCR检测重组质粒中的插入DNA片段。向无菌PCR管中加入提取的重组质粒(pGM-lec)1μl、dNTPs(10mM)0.5μL、10×Taq Buffer 2μl、Taq DNA Polymerase1.5U和质粒通用引物(T7，SP6)各5pmol，补无菌超纯水至总体积20μl，混合均匀。PCR扩增条件：94℃30s，48℃30s，72℃50s，35个循环，72℃延伸7min结束。2.5％琼脂糖凝胶检测。至总体积20μl，混合均匀。
PCR扩增检测质粒上目标基因片段插入如图4所示，经12h培养所得菌液进行质粒提取，对所得质粒进行PCR反应及琼脂糖电泳检测，以Marker I为参照标准，可看到在600bp位置出现明亮的荧光条带，与预期结果基本一致，证明质粒提取结果正确。
(3)将提取的质粒测序。
质粒样品由北京三博远志生物技术有限责任公司测序。得到成熟蛋白编码区基因序列为SEQ ID No.1所示，具体为：
＞Rdr-lec
cagaactggc caacatttca gcagaagcac atttcaagca atccaaccat cgtctgtaac 60
agcatcatga acaacatcat atatatcgta ggaggtcaat gcaaggaacg caacactttc 120
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gtattaagta ccacaagatt ccagctcaac acttgcattc gtagtgccat tgtaccccgc 240
ccttgtccat atacctccag accggaaact aatgtgatat gtgtaaaatg tgagaataga 300
cttcccgtac attttgttgg aataggaagt tgt 333
由基因序列推导得到成熟蛋白编码区蛋白序列如SEQ ID No.2所示，具体为：
＞Rdr-lec
QNWPTFQQKH ISSNPTIVCN SIMNNIIYIV GGQCKERNTF IISSATTVRA ICSGASTDRN 60
VLSTTRFQLN TCIRSAIVPR PCPYTSRPET NVICVKCENR LPVHFVGIGS C 111
将上述测序结果与Genbank数据库进行序列比对，结果表明，本发明所述的中国林蛙lectin样功能基因Rdr-lec序列为新的基因。
实施例2本发明构建的中国林蛙lectin样抗肿瘤功能基因Rdr-lec序列及氨基酸序列的生物学实验：
中国林蛙Rdr-lec基因的重组融合蛋白诱导表达过程中对宿主菌的细胞毒性研究
一、材料和方法
1、材料
(1)菌种和载体
大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞购于TIANGEN生物技术有限公司，pFLAG-CTS载体购于sigma-aldrich。
(2)工具酶与生化试剂：
Tryptone，Yeast Extract，Agarose，氨苄青霉素，X-Gal，IPTG等(均购于TIANGEN生物技术有限公司)，其它试剂均为市售分析纯。
(3)设备和器材
THZ-D型 台式恒温振荡器，太仓市实验设备厂；
SPN202F型电子天平，梅特勒-托利多称重设备系统有限公司；
LRH-250型 生化培养箱，上海一恒科技有限公司；
LS-835L型 立式压力蒸汽灭菌锅 江阴江滨医疗设备厂；
SWCJ-B型 净化工作台，天津市中环实验电炉有限公司；
2、实验方法
将携带有空质粒pFLAG-CTS或携带有中国林蛙Rdr-lec基因的重组质粒pFLAG-lec的大肠杆菌BL21(DE3)涂布于LB/agar/Amp平板上活化，挑取LB/agar/Amp平板上过夜生长的单菌落，接种于20ml LB/Amp培养基中，37℃，180rpm摇菌过夜。次日在20ml菌液中再加入新鲜LB/Amp培养基20ml，37℃，180rpm摇菌至对数生长期(OD600＝0.8)，分出20ml菌液于已灭菌并预热至37℃的三角瓶中，加入终浓度为20uM的IPTG诱导表达，剩余的20ml菌液中不加IPTG，作为非诱导对照，定时检测OD600，记录IPTG诱导重组蛋白表达过程中对宿主菌生长的抑制情况。
二、实验结果
1、空载体诱导表达对宿主菌生长无影响。
如图5所示，用20uM IPTG诱导携带有空质粒pFLAG-CTS的Escherichia ColiBL21(DE3)表达后，宿主菌的生长情况与未诱导相比，没有差别。可见空载体的诱导表达不影响宿主菌的生长。
2、重组质粒pFLAG-lec诱导表达过程中对宿主菌生长具有明显抑制作用。
如图6所示重组蛋白诱导表达对宿主菌生长有抑制作用，分别用20uM、40uM和100uM IPTG诱导携带有重组质粒pFLAG-lec的Escherichia Coli BL21(DE3)表达重组蛋白30min后，明显可见宿主菌的生长受到抑制，60min后抑制率分别达到11.9％，9.4％，8.7％，诱导210min后抑制率可达到36.4％，31.8％，33.5％。
三、结论
携带有中国林蛙Rdr-lec基因的重组质粒pFLAG-lec的大肠杆菌BL21(DE3)，在加入诱导剂IPTG以后开始转录和表达Rdr-lec基因，重组蛋白分泌至大肠杆菌的周质腔中储存。
实验结果表明，诱导剂IPTG对带有空载体的大肠杆菌没有抑制作用，说明空载体本身的诱导表达对大肠杆菌没有细胞毒作用。
诱导剂IPTG对带有Rdr-lec重组质粒pFLAG-lec的大肠杆菌具有显著的抑制作用，说明重组蛋白的诱导表达对大肠杆菌具有显著的细胞毒作用。尤其值得注意的是携带有pFLAG-CTS质粒的宿主菌都是耐受Amp抗生素的耐药菌，说明了重组蛋白的细胞毒性较强，这些重组蛋白在治疗耐药病原菌引起的感染性疾病方面具有应用价值。同样说明这些重组蛋白有在治疗肿瘤细胞中具有很好的应用价值。
实施例3中国林蛙Rdr-lec基因的重组融合蛋白的制备
一、材料与设备
1、菌种和载体
大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞购于TIANGEN生物技术有限公司，pFLAG-CTS载体购于sigma-Aldrich。
2、工具酶与生化试剂
Tryptone，Yeast Extract，Agarose，氨苄青霉素，X-Gal，IPTG等(均购于TIANGEN生物技术有限公司)，小鼠抗FLAG单克隆抗体(均购于Sigma公司)，连接有碱性磷酸酶的羊抗小鼠二抗，BCIP/NBT显色试剂盒(购于北京中杉金桥生物公司)，其它试剂均为市售分析纯。
3、设备
THZ-D型 台式恒温振荡器，太仓市实验设备厂；
LRH-250型 生化培养箱，上海一恒科技有限公司；
LS-835L型 立式压力蒸汽灭菌锅 江阴江滨医疗设备厂；
超净工作台，上海新苗医疗器械制造有限公司；
YC-1层析柜，北京博医康实验仪器有限公司；
高速冷冻离心机(SORVALL RC6PLUS)，THERMO；
冷冻干燥机(FD-1B-50)，北京亚泰科隆实验科技开发中心；
超声波细胞粉碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；
万分之一电子天平(AR2140)，奥豪斯公司；
PH仪(PHSJ-3F)，上海雷磁
可见-紫外分光光度计(UV-1700)，SHIMADZU；
垂直电泳槽(DYC2-24D)，北京六一仪器厂；
电泳仪(DYY-8C)，北京六一仪器厂
二、实验方法
1、菌体的培养及超声裂解
将携带重组质粒的菌体，在LB/Agar/Amp培养基的平板上划线，37℃恒温箱中培养过夜。次日用接种针挑取分离良好的单菌落，接入LB/Amp液体培养基中，置于摇床，于37℃，180rpm，培养12小时。按照5％接种量接种于预热好的LB/Amp培养基中，共培养6L菌液。使菌生长至对数期(OD600＝0.6～0.8)时加入终浓度为20uM的IPTG诱导4h。
离心收集菌体，PBS洗涤三次。加入破碎缓冲液，冰浴超声，裂解菌体。离心收集上清液。分离胶浓度为12％的SDS-PAGE及western blotting检测裂解液中的目标蛋白。
2、亲和胶纯化重组融合蛋白
在重组蛋白的C端带有FLAG标签(其氨基酸序列为EFPGTRSVDYKDDDDK)，FLAG不会影响目标蛋白质正确折叠成三维结构，也不会影响目标蛋白质的活性。可方便地利用小鼠抗FLAG单克隆抗体偶联的琼脂糖亲和胶(购于sigma公司)进行纯化。具体方法是：将细胞裂解液高速冷冻离心(4℃，20000rpm，30min)后，取上清，与亲和胶孵育，4℃，过夜。离心(4℃，1500rpm，2min)，收集亲和胶。用TBS洗胶，五次。向亲和胶中加入1ml甘氨酸洗脱液，轻摇1min，离心(4℃，1500rpm，2min)，取上清，放入一支有10ul中和液的离心管内，分批共洗脱亲和胶5次，收集5管洗脱蛋白。
3、检测样品纯度
将得到的洗脱蛋白合并，对水充分透析后冻干。将冻干粉用100ul TBS溶解后，用Bradford法测定蛋白质浓度，进行SDS-PAGE，检测产品纯度，westernblotting鉴定重组蛋白。
三、实验结果
1、大肠杆菌裂解液中重组融合蛋白的检测
携带有Rdr-lec基因的重组质粒pFLAG-lec的大肠杆菌在LB/Amp培养基中培养至对数期(OD600＝0.6～0.8)，加入终浓度为20uM的IPTG诱导4h后，离心收集菌体，洗涤菌体后冰浴超声裂解细胞，将得到的裂解液进行SDS-PAGE(分离胶浓度为12％)，检测到裂解液中在预期分子量位置有重组融合蛋白的条带如图7所示，图7为大肠杆菌裂解液的SDS-PAGE图。图中，最左边泳道为核糖核酸酶A，中间泳道为低分子量蛋白标准，最右侧为大肠杆菌裂解液。由图可见，在分子量约14.2kDa处有目标蛋白表达。
2、亲和胶纯化重组融合蛋白Rdr-lec
将细胞裂解液高速冷冻离心(4℃，20000rpm，30min)后，取上清，与连接有抗FLAG抗体的亲和胶一起孵育过夜，使目标蛋白吸附于亲和胶上。经过多次洗涤亲和胶去除杂蛋白后，采用分部酸洗脱，使目标蛋白Rdr-lec从亲和胶上解析下来。洗脱后的Rdr-lec蛋白立即用中和液中和至中性pH值。电泳检测重组蛋白Rdr-lec的纯度。结果图8所示，图8为SDS-PAGE检测亲和胶纯化后重组蛋白的纯度图；由图可见，在分子量约为14.2kDa处重组蛋白为均一条带。采用亲和胶纯化得到了重组蛋白的单一组分。
分别将大肠杆菌裂解液和纯化的重组蛋白经12％分离胶浓度的SDS-PAGE分离后，转印到PVDF膜上，分别用抗FLAG小鼠单克隆抗体(Sigma，300倍稀释)、二抗——碱性磷酸酶连接的羊抗小鼠抗体(中杉金桥生物公司，20倍稀释)与抗原反应，BCIP/NBT显色鉴定重组蛋白，如图9示。图9为大肠杆菌裂解液总蛋白与纯化的重组蛋白Western blotting检测图。图中，左边为Rdr-lec纯品，右边为大肠杆菌裂解液。由此可鉴定大肠杆菌裂解液总蛋白中有重组蛋白表达，经过亲和胶纯化后得到了重组蛋白的纯品。
四、结论
本实验将导入重组质粒的大肠杆菌进行培养，制备核糖核酸酶Rdr-lec重组融合蛋白。由于核糖核酸酶为胞内酶，首先进行细胞破碎，上清液即为粗酶液。采用亲和胶分离纯化，得到林蛙核糖核酸酶Rdr-lec重组融合蛋白，SDS-PAGE电泳检测到分子量约在14.2kDa左右的均一条带。Western blotting法鉴定了Rdr-lec重组融合蛋白。建立了有效的Rdr-lec重组融合蛋白的制备方法。
实施例4中国林蛙Rdr-lec基因的重组融合蛋白的体外抗肿瘤作用研究
一、材料与设备
1、细胞株、培养基与生化试剂
人宫颈癌细胞HeLa为本实验室保存。RPMI 1640培养基购于Gibco，小牛血 清、青霉素、链霉素、MTT、台盼蓝、DMSO购于鼎国生物技术有限公司，其它试剂均为市售分析纯。
2、设备
二氧化碳培养箱(日本Forma)；
酶标仪(Lab systems Dragon well scan MK3)；
倒置显微镜(Nikon 808434)；
立式压力蒸汽灭菌锅(LS-835L型)江阴江滨医疗设备厂；
净化工作台(SWCJ-B型)，上海新苗医疗器械制造有限公司。
二、实验方法
1、细胞培养
HeLa细胞生长于RPMI 1640培养液(Gibco公司)，内含体积分数为10％小牛血清(56℃灭活30min)、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素，于37℃、体积分数为5％CO2的培养箱中培养，每2～3d传代一次，取对数生长期细胞用于实验。
2、MTT实验检测重组融合蛋白Rdr-lec对细胞生长的抑制作用
收集对数生长期细胞，用0.25％胰酶消化，配制成细胞悬液，于显微镜下用血球计数板计数，调整细胞初始浓度为1×104细胞/ml。于96孔培养板内每孔接种100μl(每孔含1000个细胞)。培养24h后，吸出培养液，按实验设计分别加入含不同药物浓度的培养液，用培养基配制重组融合蛋白Rdr-lec，设5个浓度：50μg/l、25μg/l、12.5μg/l、6.25μg/l、3.12μg/l，空白对照组加入不含药物的等体积培养液，每组设3个平行孔，每孔加样100μl。置37℃、体积分数为5％CO2孵育箱中培养48h后弃去培养液，用培养液洗2次，以去除药液，每孔加入0.5％MTT溶液(RPMI 1640配制)20μl。37℃保温4h，弃上清液，每孔加入DMSO 200μl溶解Formazan颗粒，平板振荡仪振荡10min，在酶标仪上570nm波长检测各孔吸光度值，绘制细胞存活率曲线。
三、实验结果
1、MTT实验检测重组融合蛋白对细胞的生长抑制作用如图10所示，图10为重组融合蛋白对HeLa肿瘤细胞的生长抑制作用图。由图可见，重组融合蛋白Rdr-lec对HeLa细胞的生长具有显著抑制作用，其IC50约为12.3ug/ml。
四、结论
重组融合蛋白Rdr-lec在极低浓度下对于受试的HeLa肿瘤细胞具有强大的体外细胞毒性，其IC50的值约为12.3ug/ml，且呈现明显的剂量依赖效应。可见，重组融合蛋白Rdr-lec具有杀伤肿瘤细胞的细胞毒性。对于肿瘤的临床治疗具有重要的开发应用价值。
【序列表】
<110>北京联合大学生物化学工程学院
<120>中国林蛙lectin样功能基因Rdr-lec序列、构建方法及其氨基酸序列
和用途
<130>
<140>
<141>
<213>人工序列
<400>
cagaactggc caacatttca gcagaagcac atttcaagca atccaaccat cgtctgtaac 60
agcatcatga acaacatcat atatatcgta ggaggtcaat gcaaggaacg caacactttc 120
ataatttctt ctgcaaccac cgtaagggcc atctgtagcg gggcgtcaac cgatagaaat 180
gtattaagta ccacaagatt ccagctcaac acttgcattc gtagtgccat tgtaccccgc 240
ccttgtccat atacctccag accggaaact aatgtgatat gtgtaaaatg tgagaataga 300
cttcccgtac attttgttgg aataggaagt tgt 333
<212>DNA
<211>333
中国林蛙lectin样功能基因Rdr-lec序列
<213>人工序列
<400>
QNWPTFQQKH ISSNPTIVCN SIMNNIIYIV GGQCKERNTF IISSATTVRA ICSGASTDRN 60
VLSTTRFQLN TCIRSAIVPR PCPYTSRPET NVICVKCENR LPVHFVGIGS C 111
<212>PRT
<211>111
中国林蛙lectin样功能基因Rdr-lec的氨基酸序列