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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201380036852.X (22)申请日 2013.07.05 1212569.6 2012.07.14 GB A61L 27/28(2006.01) A61L 27/54(2006.01) (71)申请人 诺贝尔生物服务公司 地址 瑞士克洛滕 (72)发明人 京特乌尔 (74)专利代理机构 中科专利商标代理有限责任 公司 11021 代理人 纪晓峰 (54) 发明名称 生物激活的骨替代材料 (57) 摘要 本发明总体上涉及骨替代材料的领域， 并且 特别涉及生物激活的骨替代材料。更具体地， 本 发明涉及一种特定的试剂， 所述试剂包含柠。
2、檬酸 盐、 柠檬酸、 磷酸二氢钠、 右旋糖和腺嘌呤， 其用于 改善或促进骨替代材料的骨整合， 涉及提供有所 述特定试剂的涂层的骨替代材料， 并且涉及用在 安装骨替代材料的方法中的试剂盒， 所述试剂盒 包括骨替代材料以及柠檬酸盐、 柠檬酸、 磷酸二氢 钠、 右旋糖和腺嘌呤。 (30)优先权数据 (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2015.01.09 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/EP2013/001985 2013.07.05 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2014/012631 EN 2014.01.23 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (。
3、12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 (10)申请公布号 CN 104428015 A (43)申请公布日 2015.03.18 CN 104428015 A 1/1 页 2 1. 一种用于改善或促进骨替代材料的骨整合的试剂， 其中所述试剂包含柠檬酸三钠、 柠檬酸、 磷酸二氢钠、 右旋糖和腺嘌呤。 2. 根据权利要求 1 所述的试剂， 其中所述骨替代材料包含磷酸三钙。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的试剂， 其中所述试剂溶解在水中形成水溶液。 4. 根据权利要求 3 所述的试剂， 其中所述水溶液包含 ： -1.32 至 105.20g/l 柠檬酸三钠， -0.16 至。
4、 13.08g/l 柠檬酸， -0.11 至 8.88g/l 磷酸二氢钠， -1.60 至 127.60g/l 右旋糖， 和 -0.01 至 1.10g/l 腺嘌呤。 5. 试剂用于产生骨替代材料上的涂层的应用， 其中所述试剂包含柠檬酸三钠、 柠檬酸、 磷酸二氢钠、 右旋糖和腺嘌呤。 6. 根据权利要求 5 所述的应用， 其中所述骨替代材料包含磷酸三钙。 7. 根据权利要求 5 或 6 所述的应用， 其中所述试剂溶解在水中形成水溶液。 8. 根据权利要求 7 所述的应用， 其中所述水溶液包含 ： -1.32 至 105.20g/l 柠檬酸三钠， -0.16 至 13.08g/l 柠檬酸， -0。
5、.11 至 8.88g/l 磷酸二氢钠， -1.60 至 127.60g/l 右旋糖， 和 -0.01 至 1.10g/l 腺嘌呤。 9. 一种骨替代材料， 其特征在于， 其提供有至少一个涂层， 其中所述涂层能够通过将所 述骨替代材料浸没在包含柠檬酸三钠、 柠檬酸、 磷酸二氢钠、 右旋糖和腺嘌呤的水溶液中获 得。 10. 根据权利要求 9 所述的骨替代材料， 其中所述骨替代材料包含磷酸三钙。 11. 根据权利要求 9 或 10 所述的骨替代材料， 其中所述水溶液包含 ： -1.32 至 105.20g/l 柠檬酸三钠， -0.16 至 13.08g/l 柠檬酸， -0.11 至 8.88g/l。
6、 磷酸二氢钠， -1.60 至 127.60g/l 右旋糖， 和 -0.01 至 1.10g/l 腺嘌呤。 12. 根据权利要求 9-11 中任一项所述的骨替代材料， 其中所述骨替代材料的表面是亲 水性的。 13. 一种用于在安装骨替代材料的方法中使用的试剂盒， 其中所述试剂盒包含骨替代 材料、 柠檬酸三钠、 柠檬酸、 磷酸二氢钠、 右旋糖和腺嘌呤。 14. 根据权利要求 13 所述的试剂盒， 其中柠檬酸三钠、 柠檬酸、 磷酸二氢钠、 右旋糖和 腺嘌呤存在于水溶液中。 权 利 要 求 书 CN 104428015 A 2 1/5 页 3 生物激活的骨替代材料 发明领域 0001 本发明总体上涉。
7、及骨替代材料领域， 并且具体涉及生物激活的骨替代材料。更具 体地， 本发明涉及一种特定的试剂， 其包含柠檬酸盐、 柠檬酸、 磷酸二氢钠、 右旋糖和腺嘌 呤， 其用于改善或促进骨替代材料的骨整合， 涉及提供有所述特定试剂的涂层的骨替代材 料， 并且涉及用于在安装骨替代材料的方法中使用的试剂盒， 所述试剂盒包括骨替代材料 以及柠檬酸盐、 柠檬酸、 磷酸二氢钠、 右旋糖和腺嘌呤。 0002 发明背景 0003 骨替代材料用于补充或替代自体癌性骨。与癌性骨的移植相比， 骨替代具有这样 的优点 ： 其是充分可获得的并且能够储存。骨替代材料充当填充材料通过提供框架结构而 机械性加固缺损部位并且支持骨愈合。。
8、 0004 骨替代材料按其生物学机制可以分类为 ： 骨传导， 骨诱导和骨发生。 0005 骨传导在骨替代材料充当新骨生长的框架 ( 该框架由天然骨永久延续 ) 时发生。 来自缺损部位边缘的成骨细胞使用所述骨替代材料作为骨架， 在其上产生新的骨骼。最至 少地， 骨替代材料应该是骨传导性的。典型的骨传导性的材料包括合成的材料， 如磷酸钙 ( 例如， 羟基磷灰石和磷酸三钙 ) 的陶瓷， 生物聚合物， 生物玻璃和磷酸钙， 以及同种异体的 和异种的材料， 如牛的材料。 0006 骨诱导涉及刺激骨祖细胞分化成成骨细胞， 然后其起始新骨形成。最广泛研究的 骨诱导细胞调控剂的类型是骨形态生成蛋白 (BMPs)。
9、。骨传导性的和骨诱导性的骨替代材 料不仅充当现有的成骨细胞的框架， 而且还引发新的成骨细胞的形成。除了 BMP 之外， 骨诱 导性材料包括去矿物质的骨基质和粉碎的骨的自体骨移植物。 0007 当来源于所述骨替代材料的活的成骨细胞与由另外两种机制产生的骨生长一起 促进新骨生长时， 发生骨生成。表现出骨生成作用的材料包括自体骨和组织工程材料。 0008 骨替代材料通常具有多孔结构， 并且以颗粒状、 块状和油灰状 (putty) 形式可用， 其是软的且易弯折的， 或硬的且保持形状。 所有的骨替代材料需要血液渗透， 以能够在愈合 过程中形成纤维蛋白网络。可吸收的骨替代材料应该在骨形成的同时降解或再吸收。
10、。不可 吸收的骨替代材料应该被骨整合。 骨整合的先决条件是在活的骨骼与所述骨替代材料之间 直接的结构和功能连接， 而没有结缔组织插入。 0009 已经提示骨替代材料的可湿性对骨整合具有高度的影响。例如， 当疏水性骨替代 材料 ( 如基于聚已内酯的聚氨酯脲 ) 暴露于血液时， 其在多孔结构中不表现出纤维蛋白的 渗透。 另一方面， 亲水性骨替代材料可以在材料的周围诱导加速的血小板激活， 但是凝结的 血液可能在所述替代材料周围形成囊 (capsule)， 这抑制完全的血液渗透。因此， 尽管良好 的可湿性是重要的因素， 但是还存在其他的仍然是未知的附加于良好的骨整合性的特性。 0010 综上所述， 本。
11、发明要解决的目的是提供具有改善骨替代材料的骨整合性的能力的 试剂以及提供具有极佳的骨整合特性的骨替代材料。 0011 发明概述 0012 本发明已经令人吃惊地发现， 在骨替代材料的表面上存在柠檬酸盐、 磷酸盐、 右旋 说 明 书 CN 104428015 A 3 2/5 页 4 糖和腺嘌呤在其上诱导血液蛋白包被、 血小板激活和与所述表面的紧密的纤维蛋白纤维连 接。 这些作用， 即， 改善的血液蛋白包被、 改善的血小板激活和紧密的纤维蛋白纤维连接， 是 骨替代材料的极好的骨整合性的基本要求。 0013 鉴于上述发现， 在第一方面， 本发明涉及一种用于改善或促进骨替代材料的骨整 合的试剂， 其中所。
12、述试剂包含柠檬酸三钠、 柠檬酸、 磷酸二氢钠、 右旋糖和腺嘌呤。 0014 在第二方面， 本发明涉及试剂用于在骨替代材料上产生涂层的应用， 其中所述试 剂包含柠檬酸三钠、 柠檬酸、 磷酸二氢钠、 右旋糖和腺嘌呤。 0015 在第三方面， 本发明涉及一种骨替代材料， 其特征在于， 所述骨替代材料提供有至 少一个涂层， 其中所述涂层可通过将所述骨替代材料浸没在包含柠檬酸三钠、 柠檬酸、 磷酸 二氢钠、 右旋糖和腺嘌呤的水溶液中而获得。 0016 在第四方面， 本发明涉及一种用于在安装骨替代材料的方法中使用的试剂盒， 其 中所述试剂盒包括骨替代材料、 柠檬酸三钠、 柠檬酸、 磷酸二氢钠、 右旋糖和腺。
13、嘌呤。 0017 附图简述 0018 图 1a 显示膜暴露于未凝结的血液后的 SEM 照片 ( 放大倍数 1,000- 倍 )， 其中所述膜未提供有如本申请所述的涂层。 0019 图 1b 显示根据本发明的膜暴露于未凝结的血液后的 SEM 照片 ( 放大倍 数 1,000- 倍 )。 0020 图 2a 显示 Cerasorb 明胶型骨替代材料在暴露于未凝结的血液后的 SEM 照片 ( 放 大倍数 14,000- 倍 )， 其中所述骨替代膜未提供有如本申请所述的涂层。 0021 图2b显示根据本发明的Cerasorb明胶型骨替代材料在暴露于未凝结的血液后的 SEM 照片 ( 放大倍数 14,0。
14、00- 倍 )。 0022 详述 0023 按照第一方面， 本发明提供一种用于在改善或促进骨替代材料的骨整合的方法中 使用的试剂， 其中所述试剂包含柠檬酸三钠、 柠檬酸、 磷酸二氢钠、 右旋糖和腺嘌呤。 0024 按照本发明的优选的实施方案， 所述试剂溶解在水中形成水溶液。 特别优选的是， 该用于改善或促进骨替代材料的骨整合的水溶液包含 ： 0025 -1.32 至 105.20g/l， 优选 2.63 至 26.3g/l 柠檬酸三钠， 0026 -0.16 至 13.08g/l， 优选 0.33 至 3.27g/l 柠檬酸， 0027 -0.11 至 8.88g/l， 优选 0.22 至 2。
15、.22g/l 磷酸二氢钠， 0028 -1.60 至 127.60g/l， 优选 3.19 至 31.90g/l 右旋糖， 和 0029 -0.01 至 1.1g/l， 优选 0.03 至 0.28 腺嘌呤。 0030 如上文定义的所述水溶液 ( 在下文中还称为 “包被溶液” ) 是优选的， 原因在于含 有 26.3g/l 柠檬酸三钠、 3.27g/l 柠檬酸、 2.22g/l 磷酸二氢钠、 31.9g/l 右旋糖和 0.275g/l 腺嘌呤的水溶液是已经得到FDA和欧洲当局核准的溶液。 所述溶液， 即所谓的CPDA-1溶液， 确定为用于血袋的抗凝剂 - 防腐剂和辅药， 以允许在基本上不损失血。
16、细胞活力的前提下保 存 35 天。 0031 按照特别优选的实施方案， 用于按照本发明的应用的溶液是上文提及的 CPDA-1 溶液的 5 至 40 体积溶液。按照最优选的实施方案， 使用上文提及的 CPDA-1 溶液的 10 至 说 明 书 CN 104428015 A 4 3/5 页 5 20 体积溶液。 0032 换言之， 按照本发明的特别优选的实施方案， 使用由下述组成的水溶液 ： 2.63 至 5.26g/l 柠檬酸三钠、 0.327 至 0.654g/l 柠檬酸、 0.222 至 0.444g/l 磷酸二氢钠、 3.19 至 6.38g/l 右旋糖和 0.0275 至 0.055g/。
17、l 腺嘌呤， 并且其余的是水。 0033 根据本发明的 “骨替代材料” 可以是本领域已知的任意得益于改善的骨整合的骨 替代材料。按照本发明使用的骨替代材料可以是可吸收性的或不可吸收性的。此外， 按照 本发明使用的骨替代材料可以具有骨传导特性或骨传导加骨诱导特性。 本发明中所用的典 型的骨替代材料包括合成的、 人造的和天然的骨替代材料。可以提及作为实例的是基于陶 瓷的骨替代材料， 如基于陶瓷的磷酸三钙， 磷酸钙粘固剂， 牛来源的羟基磷灰石和基于聚合 物的物质， 例如， 由聚已内酯和 / 或聚氨酯制成的基于聚合物的材料。按照本发明的优选的 实施方案， 所述骨替代材料包含磷酸三钙。 按照甚至更优选的。
18、实施方案， 所述骨替代材料是 - 磷酸三钙或 - 磷酸三钙和猪明胶的混合物。 0034 还可能的是， 所述骨替代材料另外提供有改善或促进所述骨替代材料的骨诱导和 / 或成骨特性的方式。还可能使用具有提供有生长因子、 优选转化生长因子 、 例如骨形态 生成蛋白(BMP-2,-4,-7)、 或与富血小板血浆(PRP)组合的表面的牙支持部件。 生长因子可 以进一步包括选自由下述组成的组的任一种 ： 血小板衍生生长因子 (PDGF)， 血管内皮生长 因子 (VEGF)， 胰岛素样生长因子 (IGF)， 成纤维细胞生长因子 (FGF)， 分化因子 5(GDF-5)。 0035 骨整合是活的骨骼与骨替代材。
19、料表面之间直接的结构和功能连接。骨替 代材料表面的浓厚的血液蛋白涂层和浓密的纤维蛋白网络整合将影响细胞 - 询问 (cell-interrogation)、 招募、 增殖、 分化和基质成熟的级联。形成初级基质的纤维蛋白纤 维是 “高速路” ， 在其上软组织和硬组织形成细胞沿着其移动至骨替代材料的表面。由激 活的血小板释放出来的蛋白和生长因子支持并组织细胞通信。所述血小板释放的因子还 诱导并且放大内皮细胞的迁移、 增殖和分化， 并且由此起始血管发生。血管的侵入和出芽 (sprouding) 是高度活性再生细胞所需要的充分的营养和氧供应的先决条件。通过最优化 在骨替代材料表面上的创面愈合过程， 接。
20、触 - 骨发生将较早发生， 并且最终骨整合将被加 速。 0036 按照本发明的第二方面， 上文定义的试剂用于产生上文定义的骨替代材料的涂 层。 如上文所解释的， 按照本发明的一个优选的实施方案， 将所述试剂溶解在水中形成水溶 液。优选地， 用于在骨替代材料的表面形成涂层的水溶液如上文所定义。 0037 用上文定义的试剂涂覆骨替代材料的方法没有特别的限制， 并且可以使用任意已 知的方法。 0038 在使用上文定义的水溶液形式的试剂的情形中， 可以将所述骨替代材料在室温 (25 ) 浸没在所述水溶液中， 即， 上文定义的水溶液中， 例如， 浸没 10 分钟。在多孔骨替代 材料的情形中， 推荐施加低。
21、真空(例如， 600mbar)， 例如， 约10分钟， 以确保涂覆溶液渗透到 孔中。 然后， 将所述骨替代材料从所述溶液中取出， 并且晾干， 例如， 在37 30分钟。 然而， 涂覆的材料的干燥不是必需的。备选地， 还可以直接使用所述包被的骨替代材料 ( 即， 不经 过干燥 ) 进行移植。 0039 如果需要， 上文示例的方法可以进行适当地修改。 例如， 可以先对所述骨替代材料 施加真空， 由此去除表面上吸收的水。 在多孔的骨替代材料的情形中， 这样的预处理是优选 说 明 书 CN 104428015 A 5 4/5 页 6 的， 原因在于在进行涂覆步骤之前去除孔中吸收的水是有益的。 然后， 。
22、将这样处理的材料用 涂覆溶液涂覆， 例如， 通过将所述骨替代材料浸没在涂覆溶液中进行。 0040 尤其是在无孔性骨替代材料的情形中， 其中涂覆溶液向孔中的渗透不是问题， 可 以在将所述骨替代材料插入到硬组织或软组织中之前立即将所述涂覆溶液直接倾倒在患 者的创面中， 即， 缺损部位。由此， 可以获得用所述涂覆溶液对所述骨替代材料的覆盖。 0041 还可以使用单组分溶液逐步应用对所述骨替代材料表面的涂覆。例如， 可以首先 将所述骨替代材料浸没在含有柠檬酸三钠的溶液中， 然后浸没在含有柠檬酸的溶液中， 然 后将所述骨替代材料浸没在含有磷酸二氢钠的溶液中， 这之后， 将这样处理的材料浸没在 含有右旋糖。
23、的溶液中， 并且最后， 将所述材料浸没在含有腺嘌呤的溶液中。 单组分溶液可以 以任意顺序应用到所述骨替代材料的表面上。 备选地， 还可以在涂覆步骤之前制备两种、 三 种或四种上文提及的试剂的溶液。 0042 在试剂不溶于水的情形中， 作为对骨替代材料应用涂覆的备选方法， 可以提及化 学气相沉积和暴露于干燥的结晶试剂。 0043 按照第三方面， 本发明提供了一种提供有至少一个涂层的骨替代材料， 其中所述 涂层可通过将所述骨替代材料浸没在包含柠檬酸三钠、 柠檬酸、 磷酸二氢钠、 右旋糖和腺嘌 呤的水溶液中获得。所述水溶液与上文所规定的相同。 0044 涂层的厚度没有特别限制， 并且可以在几个微米至。
24、几个毫米之间。涂层的厚度取 决于涂覆溶液的浓度和涂覆的条件。 通常， 可以说， 较高浓缩的涂覆溶液增加骨替代材料上 的涂层的厚度。 备选地， 如果意欲增加骨替代材料上的涂层的量， 则可以按需要那样经常重 复涂覆步骤。 0045 此外， 涂覆有上文定义的试剂、 特别是上文定义的包含柠檬酸三钠、 柠檬酸、 磷酸 二氢钠、 右旋糖和腺嘌呤的涂覆溶液的骨替代材料的表面优选是超亲水性的。涂覆的骨替 代材料的可湿性可以通过按照座滴法 (Sessile-Drop-Method) 测量接触角进行确定。根据 本发明的涂覆的骨替代材料在时间 t 0s( 水滴与表面的首次接触的时间 ) 表现出低于 30的接触角， 。
25、特别是约 20的接触角。然而， 水滴在几秒钟内完全扩散在表面上， 诸如低 于 50ms， 更具体地约 5 至 10ms 完全扩散。这样的湿润行为是亲水性表面所特有的。 0046 在第四方面， 本发明涉及用于在安装骨替代材料的方法中使用的试剂盒， 其中所 述试剂盒包括骨替代材料、 柠檬酸三钠、 柠檬酸、 磷酸二氢钠、 右旋糖和腺嘌呤。 0047 可能的是， 按照第四方面所述的试剂盒包含作为以干燥粉末的形式包装的干燥的 试剂的柠檬酸三钠、 柠檬酸、 磷酸二氢钠、 右旋糖和腺嘌呤。所述干燥粉末可以分开包装或 作为两种或更多种或所有干燥的试剂的混合物包装。在涂覆骨替代材料之前， 这些干燥的 粉末可以溶。
26、解在适量的水中以制备上文定义的涂覆溶液。 0048 按照本发明第四方面的更优选的实施方案， 所述试剂盒包含含有柠檬酸三钠、 柠 檬酸、 磷酸二氢钠、 右旋糖和腺嘌呤的水溶液。优选地， 所述试剂盒包含根据上述优选的实 施方案的水溶液。例如， 要包含在本发明的试剂盒中的水溶液由下述组成 ： 2.63 至 5.26g/ l 柠檬酸三钠、 0.327 至 0.654g/l 柠檬酸、 0.222 至 0.444g/l 磷酸二氢钠、 3.19 至 6.38g/l 右旋糖和 0.0275 至 0.055g/l 腺嘌呤， 并且其余的是水。 实施例 说 明 书 CN 104428015 A 6 5/5 页 7 。
27、0049 实施例 1 0050 已经使用膜形式的骨替代材料是一种可生物降解的聚氨脂 脲。该材料已被涂覆有具有下述组成的涂覆溶液 ： 0051 -2.63g/l 柠檬酸三钠， 0052 -0.327g/l 柠檬酸， 0053 -0.222g/l 磷酸二氢钠， 0054 -3.19g/l 右旋糖， 和 0055 -0.0275g/l 腺嘌呤。 0056 所述骨替代材料已被浸没在所述涂覆溶液中 10 分钟。然后， 施加 600mbar 的低真 空。10 分钟后， 将所述骨替代材料从所述涂覆溶液中取出， 并且在 37干燥 20 分钟。 0057 为了确定与所述骨替代材料的表面直接接触的血液的凝结， 将。
28、涂覆的材料暴露于 新鲜的 ( 即， 未凝结的 ) 人血液。凝结特性作为允许骨整合的有益条件的指征。因此， 将涂 覆的材料放置在 Eppendorf 小瓶中， 并且加入血液。10 分钟后， 去除所述材料， 并且在甲醛 溶液中固定。将这样固定的材料在 4保存过夜。 0058 为了比较的原因， 将膜形式的但未提供有上述涂层的相同的骨替代材料 用血液以与上文所述相同的方式处理。 0059 图 1a 显示所述骨替代材料暴露于未凝结的血液后的 SEM 照片 ( 放大倍数 1,000- 倍 )， 其中所述材料未提供有根据本发明的涂层。 0060 图 1b 显示根据本发明的骨替代材料暴露于未凝结的血液后的 S。
29、EM 照片 ( 放大倍 数 1,000- 倍 )。 0061 从图1a与图1b的比较清楚可见， 与未处理的骨替代材料相比， 在根据本发明的骨 替代材料的表面上， 血液蛋白包被、 血小板激活和纤维蛋白纤维连接得到极大地改善。 0062 实施例 2 0063 Cerasorb 明胶型的骨替代材料已经以与实施例 1 所述相同的方式进行涂覆。 0064 将涂覆的骨替代材料用血液以与实施例 1 所述相同的方式进行处理。 0065 此外， 为了比较的原因。将未涂覆的骨替代材料用血液以相同的方式进行处理。 0066 血液处理的骨替代材料的表面显示在图 2a 和 2b 中。由图 2a 与图 2b 的比较清楚 看出， 与未处理的骨替代材料相比， 在根据本发明的骨替代材料的表面上， 血液蛋白包被、 血小板激活和纤维蛋白纤维连接得到极大地改善。 说 明 书 CN 104428015 A 7 1/2 页 8 图 1a 图 1b 说 明 书 附 图 CN 104428015 A 8 2/2 页 9 图 2a 图 2b 说 明 书 附 图 CN 104428015 A 9 。