一种快速筛选高烟碱烟草突变体的方法.pdf

本发明公开了一种快速筛选高烟碱烟草突变体的方法，属于生物技术领域。包括以下步骤：1）将烟草M2代种子点播在茉莉酸甲酯水溶液上，2)15天后筛选根长显著受抑制的单株，3)将步骤2）筛选出的单株移到MS营养液中培养20天，4)将步骤3）的烟株移到含营养土的假植盘中，30天后将其移栽大田，5）大田种植，常规管理6)在三个不同时间点测定烟碱含量7）自交收种。本发明在20天内完成了4000份中烟100突变体的高烟碱材料，并获得了5份高烟碱烤烟材料，最高的烟碱含量达到了7.09%，为目前烤烟型烟草最高的烟碱含量，本发明极大提高了筛选烟草突变体的效率，减轻了高烟碱烟草的筛选工作量，提高了生产效益。

权利要求书
1.  一种快速筛选高烟碱烟草突变体的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将烟草M2代种子点播在茉莉酸甲酯水溶液上；
(2)15天后筛选根长显著受抑制的单株；
(3)将步骤(2)筛选出的单株移到液体培养基中培养20天；
(4)将步骤(3)的烟株移到含营养土的假植盘中，30天后将其移栽大田；
(5)大田种植，施肥；
(6)在三个不同时间段测定烟碱含量；
(7)自交收种。

2.  如权利要求1所述的快速筛选高烟碱烟草突变体的方法，其特征在于：所述步骤(1) 中，所使用的茉莉酸甲酯浓度为10μM，添加的茉莉酸甲酯水溶液为10mL。

3.  如权利要求1所述的快速筛选高烟碱烟草突变体的方法，其特征在于：所述步骤(1) 中，培养皿、海绵以及滤纸均经过121℃高温灭菌处理20分钟，且封口避免水分蒸发。

4.  如权利要求1所述的快速筛选高烟碱烟草突变体的方法，其特征在于：所述步骤(3) 中，所述液体培养基中含有MS营养液。

5.  如权利要求1所述的快速筛选高烟碱烟草突变体的方法，其特征在于：所述步骤(3) 中，液体培养基中不添加蔗糖，并对所述液体培养基进行121℃高温灭菌处理20min。

6.  如权利1所述的快速筛选高烟碱烟草突变体的方法，其特征在于：所述步骤(5)中， 大田种植按照株距0.5米，行距1.2米，每行25株进行。

7.  如权利1所述的快速筛选高烟碱烟草突变体的方法，其特征在于：所述步骤(5)中采 用的肥料中，N、P、K的质量比例为1:1:1。

8.  如权利1所述的快速筛选高烟碱烟草突变体的方法，其特征在于：所述步骤(5)中施 肥采用基肥和追肥，基肥和追肥各占50％，追肥在移栽后30d使用。

9.  如权利1所述的快速筛选高烟碱烟草突变体的方法，其特征在于：所述步骤(6)中， 三个时间段分别是现蕾时、打顶后15天和打顶后45天。

10.  如权利1所述的快速筛选高烟碱烟草突变体的方法，其特征在于：所述步骤(7)中， 自交收种为45天后不再摸杈，待侧枝生长至开花、自交套袋、留种。

说明书一种快速筛选高烟碱烟草突变体的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种快速筛选高烟碱烟草突变体的方法。
背景技术
烟碱是烟草的一种主要次生代谢物，是卷烟产品中的主要嗜好性成分，烟草种子中 不含烟碱、烟草幼苗以及打顶前烟碱含量都很低，打顶后烟碱含量急剧上升，在烤烟类 型中，烟碱含量一般占干重的2～4％。
烤烟是卷烟产品的主要原料，近年来，随着烟草“减害降焦”战略的实施，国产卷 烟的焦油释放量和烟气危害性指数逐步降低，但与此同时，卷烟的“香气、劲头、浓度” 亦有所下降。为了补偿降低焦油之后卷烟“香气、劲头、浓度”的不足，通常在卷烟中 掺配晾晒烟。然而，掺配晾晒烟又导致卷烟烟气较粗糙、杂气和刺激性较大、余味欠干 净舒适，更为严重的是会导致TSNAs含量增高，烟气危害性指数上升(颜克亮，曾晓鹰， 胡巍耀，高锐，徐安传，唐丽.晾晒烟叶模块在烤烟型卷烟中的应用.中国烟草学报,2012, 1:19-25)，因此烟草企业迫切需要提高烤烟的烟碱含量，以在低焦油的前提下保持卷烟 的香气、劲头、浓度。另外，目前市场上出现的一些新型烟草制品，如低温卷烟，由于 燃烧温度低，烟碱释放不足，也对烤烟有高烟碱含量的需求。
虽然一些栽培措施，如种植密度、施肥种类及配比、打顶抹杈时期和留叶数、成熟 度以及烘烤过程温湿度都影响着烤烟最终的烟碱含量，但可使烟碱含量增高的栽培调制 方法，“高烟碱”通常意味着“低品质”，如蛋白质含量高、香气质差、烟气粗糙、杂 气重、刺激性大等。1990年代，我国烤烟生产过度强调“大肥大水”，导致烟叶烟碱、 蛋白质含量过高，影响了可用性。因此，需要利用生物技术手段，从内在遗传特性入手， 创制新的高烟碱种质。
对种子理化诱变可产生可遗传的变异，然后根据需求从变异后代中选择有利用价值 的种质资源是一项具有应用前景的育种途径。但由于诱变一般产生的都是不利性状，产 生优良性状突变体的概率很小，因此从诱变后代中筛选符合目标需要的材料工作量很大。 目前，高烟碱突变材料的快速选方法还没有建立，通过大田期直接测定每个烟草单株打 顶后烟碱含量来确定其烟碱水平，这种方法需要将所筛选的材料全部种植，由于烟草植 株高大，筛选一个5000份的突变群体(每份材料需25个单株)需要近70亩土地种植， 庞大的材料群体需经过播种、假植、大田常规栽培措施管理、打顶摸杈等过程，耗费很 大，而且每个单株叶片采收后测定烟碱含量也非常费时费钱，筛选效率很低。
茉莉酸类化合物包括茉莉酸、茉莉酸甲酯，是广泛存在于高等植物体内的一种植物 生长调节物质，也被称为伤诱导激素，即植物受伤后产生了一种激素。有研究表明，烟 草打顶后烟碱含量的急剧上升就是由于烟草打顶后能产生茉莉酸类物质(Pluskota1WE, Qu N,Maitrejean M,Boland W,Baldwin IT.Jasmonates and its mimics differentially  elicit systemic defence responses in Nicotiana attenuate.Journal of Experimental  Botany.2007,58:4071-4082)，而且对烟草外施茉莉酸甲酯或者进行叶片损伤，烟碱 合成的关键酶在高烟碱烟草品种中表达量增强，而在低烟草品种则变化不大(Dewey R E, Xie J.Molecular genetics of alkaloid biosynthesis in Nicotiana tabacum. Phytochemistry,2013，94：10-27；Cane KA,Mayer M,Lidgett AJ,Michael AJ,Hamill  JD.Molecular analysis of alkaloid metabolism in AABB v.aabb genotype Nicotiana  tabacum in response to wounding of aerial tissues and methy jasmonate treatment  of cultured roots.Functional Plant Biology.2005,32:305-320)，因此，可以根 据烟草对茉莉酸类物质的敏感程度筛选出高烟碱的材料。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种快速筛选高烟碱烟草突变体的方法，能够快速 获得高烟碱材料，大幅减少高烟碱突变体筛选的工作量，节省了时间和资金，提高了生 产效益。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
1)将烟草M2代种子点播在茉莉酸甲酯水溶液上；
2)15天后筛选根长显著受抑制的单株；
3)将步骤2)筛选出的单株转移液体培养基中培养20天；
4)将步骤3)的烟株转移到含营养土的假植盘中，30天后将其移栽大田；
5)大田种植，施肥；
6)分三个时间点取样测定单株的烟碱含量；
7)自交收种。
所述步骤1)中，茉莉酸甲酯为市售，用50％的无水乙醇溶解成100mM/mL的母液， 使用时，在1L灭菌的蒸馏水中添加100μL茉莉酸甲酯母液至终浓度为10μM/L。将0.2cm 厚的海绵剪成直径9cm的圆形，铺在直径为9cm的培养皿中，海绵上放置同样大小的滤 纸，121℃高温灭菌20分钟，培养皿中倒入10mL茉莉酸甲酯溶液，每个培养皿均匀点 播种子30粒，点完后用保鲜膜对培养皿进行封口以避免水分蒸发。培养条件是，温度 25℃培养，光周期为16小时光照/8小时黑暗。
所述步骤2)中，用普通直尺测量根长，选出根长显著受抑制的单株。
所述步骤3)中，液体培养基为含有MS营养液的培养基，MS为市场市售，称取4.74g MS粉末加入到1L蒸馏水中，加热溶解后121℃高温灭菌20min，以避免细菌滋生。
所述步骤5)中，在烟株现蕾时开始打顶，打去未开片的2～3片顶叶和花蕾，打顶 后每周摸杈一次。
所述步骤6)中，三个时间点分别为，现蕾时、打顶后15天、打顶后45天。现蕾时 取中部叶(从底叶数第9片叶)测定烟碱含量，打顶后15天取上部叶(上部第一片叶)， 打顶后45天取中部叶(从底叶数第10片叶)，叶片取回后经过60℃烘烤1天，去除烟 筋，用磨样器磨成粉末，过600目筛，称取1g粉末，测定烟碱含量，烟碱含量测定方法 采用紫外分光光度法进行，方法参照李维莉等的进行(李维莉，马银海，段姚俊，徐济仓. 紫外分光光度法测定烟草中的游离烟碱.安徽农业科学,2012,40:3600-3601)。每个样 品重复三次。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明在20天内完成了4000份中烟100突变体的高烟碱材料，并获得了5份高 烟碱烤烟材料，最高的烟碱含量达到了7.09％，为目前烤烟型烟草最高的烟碱含 量，本发明极大提高了筛选烟草突变体的效率，减轻了高烟碱烟草的筛选工作量， 提高了生产效益。
2.本发明中的高烟碱材料的筛选可以在培养皿中进行，操作方便，节省了时间和费 用。
3.本发明的烟碱含量测定分别在打顶前(现蕾时)、打顶后15天、打顶后45天进 行了3次取样重复测定，保证前期高烟碱筛选的准确性。
4.本发明也可以用于其他烤烟品种的高烟碱突变材料筛选或者用于烟草高烟碱品 种改良和遗传研究。
附图说明
图1是筛选出的11MZE273654-3和对照材料(中烟100)在清水和10μM茉莉酸 甲酯上的根长对比图；
图2a是高烟碱突变体打顶前的烟碱含量柱状图；
图2b是高烟碱突变体打顶后15天的烟碱含量柱状图；
图2c是高烟碱突变体打顶后45天的烟碱含量柱状图。
图1中，a为中烟100在清水上的根长；b为11MZE273654-3在清水上的根长；c为 中烟100在10μM茉莉酸甲酯上根长；d为11MZE273654-3在10μM茉莉酸甲酯上根 长。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。
1.点播突变体种子
从烟草突变体库中取4000份突变二代(M2)种子进行高烟碱烤烟材料筛选，每份种 子取30粒，点播在含10μM茉莉酸甲酯的培养皿中培养，同时做清水对照。另外，除 了点播突变体，每天再点播3份未突变的中烟100种子作为平行对照。
2.茉莉酸甲酯敏感突变体筛选
烟草种子点播到培养皿中，5天开始露白，7天根开始生长，15天时分别测定突变体 和中烟100(对照)在含10μM茉莉酸甲酯和清水上的根长，如表1所示，表1中突变 体在清水对照上的根长为30个单株的平均值，中烟100为90个单株的平均值。
表1 突变体和中烟100的根长测量数据


如图1所示，由于茉莉酸甲酯对根的生长有抑制作用，当添加10μM的茉莉酸甲酯 培养15天后，中烟100的根长平均在2.11cm-2.24cm之间，但编号为11MZE273654、 11MZE274507、11MZE275288的单个株系中有5个单株对茉莉酸甲酯的表现更为敏感，其 根长只有1cm左右，选出11MZE273654-3、11MZE273654-12、11MZE274507-27、 11MZE275288-5、11MZE275288-25，11MZE273654-3和对照材料(中烟100)在清水和10μM 茉莉酸甲酯上的根长。
3.继续培养
将以上单株和中烟100对照转移到含10mL MS营养液的培养皿中继续培养，20天后 烟草已生长到四叶期，生长较为健壮。
4.假植
将突变体和对照烟株小心转移到含营养土的假植盘中，30天后将其移栽大田。
5.大田种植，施肥
试验在山东诸城茂庄农场进行，株距0.5米，行距1.2米，每行25株，试验按照 每亩施纯N 7kg(N、P、K的质量比例为1:1:1)的用量施肥，其中基肥和追肥各占50％， 追肥在移栽后30d使用，其他管理措施按照大田常规栽培进行。
6.烟碱含量测定
如图2a所示，移栽后60天烟草现蕾，取中部叶片烘干，测定烟碱含量，可以看出 未打顶时中烟100中部叶片的烟碱含量在为0.42％，而通过茉莉酸甲酯筛选出的 11MZE273654-3、11MZE273654-12、11MZE274507-27、11MZE275288-5、11MZE275288-25 单株烟碱含量在1.09％～1.35％，高于对照1～2倍。
现蕾后打顶，15天后，中烟100和这些筛选出的单株烟碱含量都明显升高，如图2b 所示，这是由于打顶产生了伤诱导激素—茉莉酸，茉莉酸能刺激烟草根部的烟碱合成， 从图2b中可以看出，这时中烟100的烟碱含量增加了近3倍，达到2.05％，而我们筛选 的几个单株的烟碱含量也急剧上升，11MZE273654-12的烟碱含量4.84％。
如图2c所示，继续常规的大田管理，打顶45天时测定中部烟叶烟碱含量，中烟100 的烟碱含量为3.81％，而筛选出的几个材料的烟碱含量最高的达到7.09％，其他几个单株 的烟碱含量也比对照高了0.5～1倍以上。
通过三次不同时间测定烟碱含量，通过种子筛选出的高烟碱突变材料表现出的烟碱 含量显著高于对照，表明该单株为高烟碱突变材料。
7.自交收种
45天后不再摸杈，待侧枝生长至开花、自交套袋、留种。