云南臭蛙皮肤抗氧化多肽AOP-OA3及其制备方法与应用技术领域
本发明属于生物医学领域,具体地说,涉及一种云南臭蛙皮肤抗氧化多肽AOP-OA3
及其制备方法与应用。
背景技术
抗氧化剂是阻止氧气不良影响的物质,它是一类能帮助捕获并中和自由基,从而
祛除自由基对人体损害的一类物质。目前已经发现了大量的抗氧化剂,这些抗氧化剂可以
被分为以下两大类:1)非基因编码的小分子无助,如维生素E、维生素C、谷胱甘肽等;2)基因
编码的大分子物质,如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、硫氧还蛋白等。这些抗氧化剂已经被
广泛应用于各种领域,包括健康、食品、化妆品及各种工业中,比如作为燃料和润滑剂的稳
定剂防止氧化,也可加在汽油中起到防止聚合从而避免引擎积垢形成的目的,单在2007年,
工业用途的抗氧化剂的就创造了大约37亿美元的收入。基于抗氧化剂的重要性,科学家们
一直在孜孜不倦的寻找着新型抗氧化剂。
两栖动物是水生动物过度到陆生动物之间的重要类群,其皮肤裸露,表面没有毛
发覆盖,直接面对各种生存压力,承当着诸多重要的生物学功能,比如抵御微生物入侵、体
色调节、水盐平衡调节等。已经有大量的研究证据表明,两栖动物的皮肤能分泌大量的活性
物质(主要是蛋白和多肽)使得其能完成这些重要的生物学功能。最近,在两栖动物滇蛙的
皮肤中发现了一类新型的抗氧化剂,其化学本质为多肽,和传统的两大类抗氧化剂不同,其
由基因编码,但分子量却很小。此后,在一些两栖动物皮肤中也发现了这一类物质,但和传
统的抗氧化剂相比,我们对这一类新型抗氧化剂的结构和功能了解还知之甚少。
云南臭蛙是中国特有的一种两栖动物,广泛分布于强紫外照射的云贵高原,根据
其生境,我们推测其皮肤能分泌高效的新型抗氧化多肽使得其能抵御紫外照射所造成的伤
害。对这些多肽的挖掘、结构和功能的研究一方面为我们理解两栖动物适应高海拔强紫外
照射生境提供新的分子线索,另外一方面能为我们提供新的、具有自主知识产权的抗氧化
剂。
发明内容
有鉴于此,本发明针对上述的问题,提供了一种云南臭蛙皮肤抗氧化多肽AOP-OA3
及其制备方法与应用,制备得到的云南臭蛙皮肤抗氧化多肽AOP-OA3具有结构新颖、简单、
活性强的特点。
为了解决上述技术问题,本发明公开了一种云南臭蛙皮肤抗氧化多肽AOP-OA3,抗
氧化多肽AOP-OA3的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还公开了一种上述云南臭蛙皮肤抗氧化多肽AOP-OA3的制备方法,包括以
下步骤:
1)原料预处理:取云南臭蛙皮肤分泌物,溶解于质量浓度为0.9%的生理盐水,真
空冷冻干燥浓缩至干粉,-80℃保存备用;
2)Sephadex G50分子筛:将步骤1)中制备得到的云南臭蛙皮肤分泌物冻干粉溶解
于去离子水中,上Sephadex G50柱子,用Tris-HCl缓冲液进行洗脱,流速为2.0毫升/10分
钟,每10分钟收集一管,测定其在280纳米下的吸光度,收集合并具有抗氧化活性的洗脱峰;
3)高效液相色谱反相层析:将步骤2)中制备得到的洗脱液上样于Hypersil ODS2
柱子,实验仪器为Waters 1525高压液相系统,在流速为1毫升/分钟的条件下,用乙腈在线
性梯度条件下进行洗脱,监测波长为215纳米,收集合并具有抗氧化活性的洗脱峰,浓缩干
燥后得到目标物。
进一步地,步骤2)中的Sephadex G50柱子预先用20mM、pH6.8、含0.1M NaCl的
Tris-HCl缓冲液平衡24h。
进一步地,步骤3)中的Hypersil ODS2色谱柱需预先用含0.1%三氟乙酸的超纯水
平衡。
进一步地,步骤3)中的乙腈为含0.1%三氟乙酸的乙腈。
进一步地,步骤3)中的线性梯度洗脱具体为:乙腈浓度从0%升至60%所消耗的时
间为60分钟。
本发明还公开了一种上述的云南臭蛙皮肤抗氧化多肽AOP-OA3在制备与抗氧化相
关的药物、保健品、化妆品中的应用。
与现有技术相比,本发明可以获得包括以下技术效果:
1)本发明从中国产云南臭蛙的皮肤中得到了1个新的抗氧化多肽AOP-OA3,其抗氧
化活性很强,约为维生素E的280倍。将本发明的云南臭蛙皮肤抗氧化多肽AOP-OA3全序列结
构经蛋白质数据库进行搜寻比较,未发现有任何相同多肽。
2)云南臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA3具有结构简单、抗氧化活性强的特点。
3)纯化得到的云南臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA3在自由基ABTS+清除实验中显示了
较强的抗氧化活性,揭示本发明云南臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA3有潜在的应用前景。
当然,实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解,构成本发明的一部分,本发
明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1为本发明云南臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA3的G50分子筛层析图;
图2为本发明云南臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA3的HPLC反相C18柱层析图,其中,3代
表AOP-OA3峰;
图3为本发明分离纯化云南臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA3的自由基ABTS+清除活性
图。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式,藉此对本发明如何应用技术手
段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1:云南臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA3分离纯化和鉴定
1、分离纯化
云南臭蛙活体采自云南保山,取其皮肤分泌物(溶解于质量浓度为0.9%的生理盐
水,这能最大化保持其生物学活性),真空冷冻干燥浓缩至干粉,-80℃保存备用。
第一步:Sephadex G50分子筛:按照上述方法获得皮肤分泌物冻干粉,溶解于去离
子水中,取1毫升(蛋白与多肽总含量为100毫克)上预先用20mM Tris-HCl缓冲液(pH=6.8,
含0.1M NaCl)平衡24小时的Sephadex G50(GE Healthcare,超细)柱子(长度40厘米,内径
宽度1.5厘米),用同样的缓冲液进行洗脱,流速为2.0毫升/10分钟,每10分钟收集一管,测
定其在280纳米下的吸光度,所得的分离纯化图谱如图1所示,其中AOP-OA3存在于图所示
峰。
第二步:高效液相色谱反相层析:
第一步所得样品上样于预先用超纯水(含体积浓度为0.1%的三氟乙酸)平衡好的
Hypersil ODS2柱子(伊利特,尺寸为4.6毫米×300毫米),实验仪器为Waters 1525高压液
相系统,在流速为1ml/min的条件下,用乙腈(含0.1%的三氟乙酸)在在线性梯度(0-60%,
60分钟)条件下进行洗脱,监测波长为215纳米,所得的分离纯化图谱如图2所示,图中“3”所
示为纯化的天然云南臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA3。
2、分子鉴定
氨基酸序列的测定:
纯化得到的云南臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA3在全自动蛋白质序列测定仪(岛津
PPSQ-31A)上经Edman降解法,测定了云南臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA3氨基酸全序列,结果表
明云南臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA3具有本发明SEQ ID NO:1所示的结构。
实施例2:云南臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA3的抗氧化活性
本发明利用自由基ABTS+清除活性实验检测拉云南臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA3的
抗氧化活性,结果表明云南臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA3具有较强的抗氧化活性
7mM的ABTS在水中和2.8mM的过硫酸钾混合,室温黑暗环境中反应6个小时,使得
ABTS被氧化成为ABTS+自由基,之后用去离子水稀释50倍,取50uL稀释液和50uL样品混合,
室温黑暗环境下反应30分钟,之后,在415nm波长下测其吸光度。自由基ABTS+的清除率(%)
用下述公式进行计算:(Ablank-Asample)×100/Ablank。不同浓度云南臭蛙抗氧化肽AOP-OA3的
抗氧化活性如图3所示。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例,但如前所述,应当理解发明并非
局限于本文所披露的形式,不应看作是对其他实施例的排除,而可用于各种其他组合、修改
和环境,并能够在本文所述发明构想范围内,通过上述教导或相关领域的技术或知识进行
改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围,则都应在发明所附权
利要求的保护范围内。