一种用以促进甲壳类动物生殖腺成熟、交配行为、产卵的多肽 【技术领域】
本发明涉及一种用以促进甲壳类动物生殖腺成熟、交配行为、产卵的多肽，尤其涉及一种用以促进甲壳类动物分泌甲基法呢烯酸酯(MF)的多肽及其应用，属于基因工程领域。
背景技术
养殖业系为一固有产业，在全世界均扮演重要的角色，这是因为它和人们的生活息息相关；养殖业主要的贡献为提供人们丰富多样的食物选择，以及优良的蛋白质来源；近年来，为了因应时代的潮流，养殖业逐渐朝高科技产业发展。
中国台湾的虾类养殖产业自1969年草虾、砂虾等人工繁养殖技术开发成功后，开始蓬勃发展，草虾在1987年的产量，就高达95,000公吨，独占全世界的鳌头，赢得养虾王国的美誉，但在缺乏妥善的规划、养殖管理的疏失及整个养殖大环境恶化等多重影响下，造成产业发展失序。
1988年中国台湾草虾受到草虾杆状病毒(Monodon baculovirus，MBV)的感染，产量骤减达三分之二以上，除了重创了台湾的养虾事业之外，南美白虾也因此受到了重视；白虾原产于中南美洲太平洋沿岸的热带水域，主要分布于秘鲁北部至墨西哥湾沿岸，具有成长率高、适应性强、抗病力佳以及离水存活时间长等优点，是全球三大养殖虾种之一；1994年在中国台湾商业化养殖后，产量逐年增加；2004年产量为11,025公吨，产值达新台币19亿2千万元；同年，草虾之产量仅有1,519公吨，产值为4亿1千7百万元(中国台湾地区渔业统计年报、2004。行政院农业委员会渔业署)，显见白虾已取代草虾，成为中国台湾与世界的主要养殖虾种。
虽在80年代已开发出种虾人工饲料，但能有效使种虾卵巢成熟的人工催熟饲料仍待开发。中国台湾草虾种虾资源不足，种虾大多依靠外海捕获或由东南亚各国进口；现在大部分人工饲养于鱼场的白虾种虾仍需靠单边眼柄移除及投喂大量冷冻生饵以达到催熟的目的；在野生种虾资源逐渐减少，且有感染病毒的可能性和种虾产地国限制出口下，如何提高种虾的培育率、改善催熟技术及建立优良种虾品系等，是养殖虾类急待解决的课题。
一、甲壳类动物体内与性成熟有关的构造
甲壳类动物体内的X器官与窦腺复合体(X-organ sinus gland complex)为主要神经内分泌器官，它参与许多重要生理调节作用，包含碳水化合物及能量代谢、抑制卵巢的成熟、抑制甲壳类脱壳并且影响生长、抑制大颚器官分泌、影响复眼色素的变化及身体体色的控制等(Garcia，U.，Arechiga，H.，1998.Regulation of crustacean neurosecretory cell activity.Cell.Mol.Neurobiol.18，81-99.)。这些生理的调节因子包括：甲壳类升醣激素(crustacean hyperglycemic hormone，CHH)，生殖腺(卵黄生成)抑制激素(gonad/vitellogenesis-inhibiting hormone，GIH/VIH)，脱壳抑制激素(molt-inhibiting hormone，MIH)，大颚器官抑制激素(mandibularorgan-inhibiting hormone，MOIH)，甲壳类升醣激素前体相关多肽(CHHprecursor related peptide，CPRP)及与色素作用有关的红色素凝集激素(red pigment concentrating hormone，RPCH)、色素分散激素(pigmentdispersing hormone，PDH)、远程视网膜色素激素(distal retinalpigment hormone，DRPH)、红色素细胞浓缩(concentration oferythrophore，ECH)、黑色素分散(disperser of melanin pigment，MDH)(Huberman，A.，2000.Shrimp endocrinology.A review.Aquaculture 191，191-208；Keller，R.，1992.Crustaceanneuropeptides：structures，functions and comparative aspects.Experientia 48，439-448)。
而甲壳类动物的Y器官(又称为脱壳腺体，molting gland)则是位在甲壳类动物的头胸甲前端，眼柄正侧后方的鳃腔(anterior branchial chamber)内，呈浅乳黄色，为成对的器官；Y器官可合成脱壳激素(ecdysteroids)，主要功用在促进脱壳，其与X器官的脱壳抑制激素(MIH)有相互拮抗的作用；甲壳类动物会受到脱壳抑制激素(MIH)抑制Y器官释放的脱壳激素，进而抑制脱壳而影响成长(Keller，R.，1992.Crustacean neuropeptides：structures，functions and comparative aspects.Experientia 48，439-448)。大颚器官(mandibular organ，MO)则位于甲壳类动物的头胸甲下方的大颚基部，由大颚基部藉由腱(tendon)与食道内侧基部的肌肉连接，为一成对的器官(Sagi，A.，Homola，E.，Laufer，H.，1991.Methylfarnesoate in the prawn Macrobrachium rosenbergii：Synthesis bythe mandibular organ in vitro，and titers in the hemolymph.Comp.Biochem.Physiol.99 B，879-882.)；大颚器官可分泌甲基法呢烯酸酯(methyl farnesoate，MF)，会受X器官所分泌的大颚器官抑制激素(MOIH)抑制其分泌(Wainwright，G.，Webster，S.G.，Rees，H.H.，1998.Neuropeptide regulation of biosynthesis of the juvenoid，methylfarnesoate，in the edible crab，Cancer pagurus.Biochem.J.334(Pt 3)，651-657.)。甲基法呢烯酸酯(MF)与甲壳类动物的变态、生殖、脱壳、雄性交配行为及胁迫(stress)反应等均有密切关系(Abdu，U.，Takac，P.，Laufer，H.，Sagi，A.，1998.Effect of methyl farnesoate onlate larval development and metamorphosis in the prawnMacrobrachium rosenbergii(Decapoda，Palaemonidae)：A juvenoid-like effect？Biol.Bull.195，112-119.；Laufer，H.，Biggers，W.J.，Ahl，J.S.，1998.Stimulation of ovarian maturation in the crayfishProcambarus clarkii by methyl farnesoate.Gen.Comp.Endocrinol.111，113-118.；Lovett，D.L.，Clifford，P.D.，Borst，D.W.，1997.Physiological stress elevates hemolymph levels of methylfarnesoate in the green crab Carcinus maenas.Biol.Bull.193，266-267.；Sagi，A.，Homola，E.，Laufer，H.，1993.Distinctreproductive types of male spider crabs Libinia emarginata differin circulating and synthesizing methyl farnesoate.Biol.Bull.185，168-173.)。
二、甲壳类动物的甲基法呢烯酸酯(MF)的化学结构与功用
在许多甲壳类动物体内都被发现有甲基法呢烯酸酯(MF)存在(Laufer，H.，Borst，D.W.，Baker，F.C.，Carrasco，C.，Sinkus，M.，Reuter，C.C.，Tasi，L.W.and Schooley，D.A.，1987a.Identification of ajuvenile hormone-like compound in a crustacean.Science 235，202-205.；Laufer，H.，Homola，E.and Landau，M.，1987b.Control ofmethyl famesoate in crustacean manbidular organs.Amer.Zool.27，69.；Borst，D.W.，Laufer，H.，1990.Methyl farnesoate：a JH-likecompound in crustaceans.In Gupta，A.P.(eds.)，MorphogenicHormones of Arthropods：Discoveries，Synthesis，Metabolism，Evolution，Modes of Action and Techniques.Rutgers UniversityPress，New Brunswick，NJ，pp.181.；Borst，D.W.，Kissee，L.，Ramlose，D.，1987b.The synthesis of methyl farnesoate(MF)bymandibular organs(MO)of two crabs.Am.Zool.27，69a.；Tobe，S.S.，Young，D.A.，Khoo，H.W.，1989a.Production of methylfarnesoate by the mandibular organs of the mud crab，Scyllaserrata：Validation of a radiochemical assay.Gen.Comp.Endocrinol.73，342-353.；Tobe，S.S.，Young，D.A.，Khoo，H.W.，Baker，F.C.，1989b.Farnesoic acid as a major product of releasefrom crustacean mandibular organs in vitro.J.Exp.Zool.249，165-171.；Ding，Q.，Tobe，S.S.，1991.Production of farnesoic acidand methyl farnesoate by mandibular organs of the crayfish，Procambarus clarkii.Insect Biochem.21，285-291.；Smith，P.A.，Clare，A.S.，Rees，H.H.，Prescott，M.C.，Wainwright，G.，Thorndyke，M.C.，2000.Identification of methyl farnesoate in the cyprislarva of the barnacle，Balanus amphitrite，and its role as ajuvenile hormone.Insect Biochem.Mol.Biol.30，885-890.)，由文献得知甲基法呢烯酸酯(MF)普遍存在于甲壳类动物中，这与昆虫中普遍存在的青春激素III(juvenile hormone III，JH III)情形是一致的；甲基法呢烯酸酯(MF)是属于昆虫青春激素(juvenile hormone，JH)家族中的成员之一，其中与这家族中最常见的青春激素III(JH III)最为类似。Laufer等人(1987)利用气相层析质谱仪(gas chromatography/mass spectrometry，GC/MS)定出甲基法呢烯酸酯(MF)的化学结构(Laufer，H.，Homola，E.andLandau，M.，1987b.Control of methyl famesoate in crustaceanmanbidular organs.Amer.Zool.27，69.)。如图1所示，甲壳类的甲基法呢烯酸酯(MF)(1)与昆虫的青春激素III(JH III)(2)分子结构类似，甲壳类的甲基法呢烯酸酯(MF)仅在第十与第十一个碳上少一个环氧基(Borst，D.W.，Ogan，J.，Tsukimura，B.，Claerhout，T.，Holford，K.C.，2001.Regulation of the crustacean mandibular organ.Am.Zool.41，430-441.)；因此，甲基法呢烯酸酯(MF)又称为类青春激素(JH-like)(Bede，J.C.，Goodman，W.G.，Tobe，S.S.，1998.Insect juvenile hormone 3in the Sedge，Cyperus iria L.：diatribution and possiblebiological significance.Pure Appl.Chem.70，1-9.)；因为青春激素(JHs)于昆虫成长及生殖上是重要的调控因子，因此Borst以及Laufer推测甲基法呢烯酸酯(MF)在甲壳类动物上也具有类似的功能(Borst，D.W.，Laufer，H.，1990.Methyl farnesoate：a JH-like compound in crustaceans.InGupta，A.P.(eds.)，Morphogenic Hormones of Arthropods：Discoveries，Synthesis，Metabolism，Evolution，Modes of Action andTechniques.Rutgers University Press，New Brunswick，NJ，pp.181.)。甲基法呢烯酸酯(MF)在稚虾及卵黄前期(previtellogenic)活性低，而在卵黄生成期(vitellogenic)则有大量活性表现，但至排卵前甲基法呢烯酸酯(MF)量减少；而在性成熟的甲壳类体内，甲基法呢烯酸酯(MF)的表现量与雌、雄的生殖生理调控均有关(Rodriguez，E.M.，Greco，L.S.L.，Medesani，D.A.，Laufer，H.，Fingerman，M.，2002.Effect of methylfarnesoate，alone and in combination with other hormones，onovarian growth of the red swamp crayfish，Procambarus clarkii，during vitellogenesis.Gen.Comp.Endocrinol.125，34-40.；Sagi，A.，Homola，E.，Laufer，H.，1991.Methyl farnesoatein the prawnMacrobrachium rosenbergii：Synthesis by the mandibular organ invitro，and titers in the hemolymph.Comp.Biochem.Physiol.99 B，879-882.；Wainwright，G.，Webster，S.G.，Wilkinson，M.C.，Chung，J.S.，Rees，H.H.，1996.Structure and significance of mandibularorgan-inhibiting hormone in the crab，Cancer pagurus.involvementin multihormonal regulation of growth and reproduction.J.Biol.Chem.271，12749-12754.)。
公蜘蛛蟹(Libinia emarginata)具有两种生殖型态：磨损背甲型(abraded)及无磨损型(unabraded)；测量它们血淋巴中甲基法呢烯酸酯(MF)合成速率(Homola，E.，Sagi，A.，Laufer，H.，1991.Relationship ofclaw form and exoskeleton condition to reproductive system sizeand methyl farnesoate in the male spider crab，Libinia emarginata.Invert.Reprod.Dev.20，219-225.)及含量，发现大部分磨损背甲型显着高于无磨损型，而观察其交配行为，确实也是磨损背甲型占有主动和优势地地位(Sagi，A.，Homola，E.，Laufer，H.，1993.Distinct reproductivetypes of male spider crabs Libinia emarginata differ incirculating and synthesizing methyl farnesoate.Biol.Bull.185，168-173.；Laufer，H.，Ahl，J.S.B.，1995.Mating behavior andmethyl farnesoate levels in male morphotypes of the spider crab，Libinia emarginata(leach).J.Exp.Mar.Biol.Ecol.193，15-20)；因此，Laufer等人推论雄性甲壳类动物体内的甲基法呢烯酸酯(MF)与生殖型态的分化及生殖行为等均有直接而密切关系(Laufer，H.，Ahl，J.B.S.，Sagi，A.，1993b.The role of juvenile hormones in crustaceanreproduction.Amer.Zool.33，365-374.；Olmstead，A.W.，Leblanc，G.A.，2002.Juvenoid hormone methyl farnesoate is a sexdeterminant in the crustacean Daphnia magna.J.Exp.Zool.293，736-739.)。
在母蜘蛛蟹(L.emarginata)及淡水长臂大虾卵巢发育过程中，甲基法呢烯酸酯(MF)有明显升高的现象(Sagi，A.，Homola，E.，Laufer，H.，1991.Methyl farnesoate in the prawn Macrobrachium rosenbergii：Synthesis by the mandibular organ in vitro，and titers in thehemolymph.Comp.Biochem.Physiol.99 B，879-882.；Liu，L.，Laufer，H.，Gogarten，P.J.，Wang，M.，1997.cDNA cloning of a mandibularorgan inhibiting hormone from the spider crab Libinia emarginata.Invert.Neurosci.3，199-204)，表示它有刺激卵黄生合成(vitellogenesis)的能力；在蜘蛛蟹中，第二期卵黄生成开始(secondaryvitellogenesis)时，其血淋巴中含有最高量的甲基法呢烯酸酯(MF)，在体外(in vitro)实验中发现，经甲基法呢烯酸酯(MF)处理过的卵，会增加卵径(Wainwright，G.，Webster，S.G.，Wilkinson，M.C.，Chung，J.S.，Rees，H.H.，1996.Structure and significance of mandibular organ-inhibiting hormone in the crab，Cancer pagurus.involvement inmultihormonal regulation of growth and reproduction.J.Biol.Chem.271，12749-12754；Wainwright，G.，Webster，S.G.，Rees，H.H.，1998.Neuropeptide regulation of biosynthesis of the juvenoid，methylfarnesoate，in the edible crab，Cancer pagurus.Biochem.J.334(Pt 3)，651-657)。
甲基法呢烯酸酯(MF)也可刺激甲壳类动物的Y器官分泌脱壳激素，以含有高量大颚器官的培养液中离体培养黄金蟹(Cancer magister)的Y器官，发现在此培养液中的Y器官会分泌大量脱壳激素(Tamone，S.L.，Chang，E.S.，1993.Methyl farnesoate stimulates ecdysteroid secretion fromcrab Y-organs in vitro.Gen.Comp.Endocrinol.89，425-32)，推测甲基法呢烯酸酯(MF)也与调控脱壳周期有关；青蟹(Carcinus maenas)在低渗透压或其它紧迫压力下，会提高甲基法呢烯酸酯(MF)含量(Lovett，D.L.，Clifford，P.D.，Borst，D.W.，1997.Physiological stress elevateshemolymph levels of methyl farnesoate in the green crab Carcinusmaenas.Biol.Bull.193，266-267.；Lovett，D.L.，Verzi，M.P.，Clifford，P.D.，Borst，D.W.，2001.Hemolymph levels of methylfarnesoate increase in response to osmotic stress in the greencrab，Carcinus maenas.Comp.Biochem.Physiol.A.Mol.Integr.Physiol.128，299-306.)，推测甲壳类动物会暂时性的调节生物体内的紧迫反应与甲基法呢烯酸酯(MF)有关。
由上述研究得知甲基法呢烯酸酯(MF)可调控许多功能，包含甲壳类幼生变态、生殖、脱壳及紧迫(stress)反应等均有密切关系；因此，甲基法呢烯酸酯(MF)可认定为甲壳类动物体内重要的荷尔蒙之一。
三、甲基法呢烯酸酯(MF)的生化代谢途径
甲基法呢烯酸酯(MF)属于萜类(terpene)，含有三个异戊二烯单体，称为倍半萜(sesquiterpene，15C)，于十足目甲壳类动物中，由大颚器官所分泌释放(Laufer，H.，Borst，D.W.，Baker，F.C.，Carrasco，C.，Sinkus，M.，Reuter，C.C.，Tasi，L.W.and Schooley，D.A.，1987a.Identification of a juvenile hormone-like compound in a crustacean.Science 235，202-205；Borst，D.W.，Laufer，H.，1990.Methylfarnesoate：a JH-like compound in crustaceans.In Gupta，A.P.(eds.)，Morphogenic Hormones of Arthropods：Discoveries，Synthesis，Metabolism，Evolution，Modes of Action and Techniques.RutgersUniversity Press，New Brunswick，NJ，pp.181；Borst，D.W.，Ogan，J.，Tsukimura，B.，Claerhout，T.，Holford，K.C.，2001.Regulationof the crustacean mandibular organ.Am.Zool.41，430-441)。
如图2所示，甲壳类甲基法呢烯酸酯(MF)(1)与昆虫青春激素III(JHIII)(2)生化代谢途径是先由法呢基焦磷酸(farnesyl diphosphate，FDP)(201)经磷酸酶(phosphatase)(211)或焦磷酸酶(pyrophosphatase)(212)催化，产生法呢醇(farnesol)(202)；接着以法呢醇脱氢酶(farnesoldehydrogenase)(213)以及烟碱醯胺腺嘌呤双核苷酸(nicotinamide adeninedinucleotide，NAD+)(214)催化，转化成法呢醛(farnesal)(203)，再经由法呢醛脱氢酶(farnesal dehydrogenase)(215)以及烟碱醯胺腺嘌呤双核苷酸(NAD+)(214)催化而形成法呢烯酸(farnesoic acid)(204)；由此可分为两个代谢路径：法呢烯酸(farnesoic acid)(204)经由甲基转移酶(methyltransferase)(216)与S-腺甘硫氨酸(S-Adenosyl-methionine，SAM)(217)进行甲基化作用(methylation)，以及环氧酶(epoxidase)(218)与氧气(O2)(219)及NADPH+H+(220)进行环氧化作用(epoxidation)路径，最终皆会合成昆虫青春激素III(JH III)(2)(Bede，J.C.，Goodman，W.G.，Tobe，S.S.，1998.Insect juvenile hormone 3 in the Sedge，Cyperus iria L.：diatribution and possible biological significance.Pure Appl.Chem.70，1-9)。昆虫中的鳞翅类(Lepidoptera)大多是先进行环氧化作用产生环氧法呢烯酸(epoxyfarnesoic acid)(205)，再进行甲基化作用路径为主，其它种类的昆虫则是先进行甲基化作用产生甲基法呢烯酸酯(MF)(1)，再进行环氧化作用或是两者皆可的路径来合成昆虫青春激素III(JHIII)(2)(Homola，E.，Chang，E.S.，1997a.Distribution andregulation of esterases that hydrolyze methyl farnesoate inHomarus americanus and other crustaceans.Gen.Comp.Endocrinol.106，62-72.；Homola，E.，Chang，E.S.，1997b.Methyl farnesoate：Crustacean juvenile hormone in search of functions.Comp.Biochem.Physiol.117B，347-356；Weinberger，C.，1996.A model forfarnesoid feedback control in the mevalonate pathway.TrendsEndocrinol.Metab.7，1-6.)。
在甲壳类动物体中，甲基法呢烯酸酯(MF)是由法呢烯酸经由甲基化作用后合成；甲基法呢烯酸酯(MF)在昆虫体内，为青春激素III(JH III)合成的前驱物质，即生化代谢过程中的中间产物，但在甲壳类动物体中则是最终产物(Bede，J.C.，Teal，P.E.，Goodman，W.G.，Tobe，S.S.，2001.Biosynthetic pathway of insect juvenile hormone III in cellsuspension cultures of the sedge Cyperus iria.Plant Physiol.127，584-93.)。甲壳类动物体中法呢烯酸甲基转化酶(farnesoic acid O-methyltransferase，FAMeT)会伴随着S-腺甘硫氨酸(SAM)辅因子的作用，在甲壳类生化合成过程中扮演着最终产物甲基法呢烯酸酯(MF)合成的关键步骤(Wainwright，G.，Webster，S.G.，Rees，H.H.，1998.Neuropeptideregulation of biosynthesis of the juvenoid，methyl farnesoate，inthe edible crab，Cancer pagurus.Biochem.J.334(Pt 3)，651-657)。
综上所述，现有的研究结果与公开的文献中仅指出甲基法呢烯酸酯(MF)和动物体的生殖、产卵、交配行为的可能的关联性，但并未揭示和水产甲壳类动物法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)与甲基法呢烯酸酯(MF)生化、代谢的任何相关性。
四、目前对虾类种虾催熟方法
很多水产养殖国家包括中国台湾在内，种虾资源缺乏，其种虾来源多依靠外海捕获及东南亚各国进口。而人工催熟种虾需依靠生饵投喂及将种虾单边眼柄移除(unilateral eyestalk ablation，uESA)使其达到生殖成熟。几乎每一种海生虾类都可藉由单边眼柄移除方式使其性成熟以促进生殖，单边眼柄移除方式可在短时间降低许多抑制激素，例如脱壳抑制激素(MIH)、大颚器官抑制激素(MOIH)、生殖腺抑制激素(GIH)的分泌，进而促进成熟及脱壳，目前商业孵化场也广泛使用此技术。
但单边眼柄移除也会造成一些副作用，包含：1)约有10％的种虾在经眼柄移除后也无法使卵巢发育够成熟而造成损失；2)眼柄移除后母虾的卵巢成熟能力失去控制；3)眼柄移除后会造成代谢疲劳，母虾不再具有卵巢成熟能力，造成生殖寿命减短；4)眼柄移除后会使代谢脱离常轨，造成产卵量逐渐减少、繁殖力及孵化率下降，且会产生较虚弱后代。
眼柄移除后虽可在短时间降低许多抑制激素(脱壳抑制激素(MIH)、大颚器官抑制激素(MOIH)、生殖腺抑制激素(GIH))的分泌，但也会降低眼柄内其它调控激素，例如甲壳类升醣激素(CHH)、甲壳类升醣激素前体相关胜肽(CPRP)、色素分散激素(PDH)、红色素凝集激素(RPCH)等的分泌，使虾子内分泌失调造成健康状况下降，也有些经移除眼柄的种虾在一星期之后陆续开始死亡，因此眼柄移除对种虾来说是一种代谢耗尽(metabolism burn out)的伤害(Bray，W.A.，Lawrence，A.L.，1992.Reproduction of Penaeusspecies in captivity.In：Fast，A.W.and Lester，J.L.(eds.)Marine shrimp culture：principle and practices.Elsevier，Netherl ands，pp.93-170)。
目前一般养殖用白虾苗所需的种虾多半为人工养成，但目前用于种虾培育的市售配合饲料并非白虾专用，以致育成种虾的生殖力参差不齐，影响种虾品质甚大。使用非白虾专用的市售配合饲料所育成的雄虾，其精子大多为畸形，严重影响其交配及授精(曾宝顺、林明男、丁云源、2005。白虾发展与技术创新：白虾配合饲料之开发。行政院农业委员会水产试验所，基隆，77-85页)；投喂小卷、乌贼、蚵仔及海虫等生饵，虽可改善精子的品质及数量，但因其成本高且有感染病毒的风险，加上营养成分随季节变化，有品质不一、货源不稳定及保存不易等各项问题。因此，如何在不剪除眼柄以减少生理代谢伤害与副作用的前提下，来达到性成熟目的以改进种虾催熟、种虾的产卵率，以及虾苗品质与数量，正是目前养殖业中面对种虾繁殖的一大课题。
由此可见，现有的种虾催熟方式仍有诸多缺失，实非一良善的设计，而亟待加以改良。
本发明人鉴于现有种虾繁殖方式所衍生的各项缺点，乃亟思加以改良创新，并经多年苦心孤诣潜心研究后，终于成功研发完成本发明一种用以促进甲壳类动物生殖腺成熟、交配行为、产卵的多肽。
【发明内容】
为克服现有技术所存在的问题，本发明目的即在于提供一种用以促进甲壳类动物生殖腺成熟、交配行为、产卵的多肽，该多肽为法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)，具有如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，藉以提升甲基法呢烯酸酯(MF)促进其生殖力达到配子的品质藉以促进该动物产卵量、产卵率与繁殖力，使该动物的子代(种苗)更为健康，并增加养殖的产量。
本发明多肽片段可取自天然的甲壳类，尤其是水生甲壳动物体中，或以现有的化学合成法合成，亦可以现有的分子生物学方法制备。
本发明的次一目的为提供一种用以促进甲壳类动物生殖成熟的组合物，其包含一多肽片段，以及一药理上可接受的载物，其中该多肽片段具有如SEQ ID NO：1或SEQID NO：2所示的氨基酸序列。
本发明前述的动物，水生甲壳类动物，在此所称之养殖甲壳类系指可藉由人工饲养的甲壳类，较佳为水产养殖业者所养殖的对虾类与蟹类。作为前述的养殖甲壳类，在此可举出的例子包含美国龙虾(Homarus americanus)、锦龙虾(Panulirus ornatrus)、草虾(Giant tiger prawn，Penaeusmonodon)，南美白虾(Western white prawn，Litopenaeus vannamei)，蓝虾(Western blue prawn，Litopenaeus stylirostris)，中国对虾(Chinesewhite prawn，Fenneropenaeus chinensis)，印度白虾(Indian whiteprawn，Fenneropenaeus indicus)，日本对虾(Japanese kuruma prawn，Marsupenaeus japonicus)、旭蟹(Ranina ranina)、克氏原螯虾(Procambarus clarkia)、黄道蟹(Cancer pagurus)，青锯蟹(Scyllaserrata)、中华绒螯(Eriocheir sinensis H.Milne Edwards)等，但并不仅限于此。
本发明的另一目的是提供一种用以编码如前述的用以促进甲壳类动物生殖成熟的多肽的核苷酸片段，其具有如SEQID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。
本发明的又一目的是提供一种促进甲壳类生殖成熟的方法，其步骤包含：(1)提供一催熟剂，该催熟剂包含如SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2所示的多肽；(2)提供一动物；以及(3)将该催熟剂投予至该动物的体内。该催熟剂可进一步包含一药理上可接受的载物。
前述的多肽可取自天然的甲壳动物尤其是水生甲壳动物体中，或以现有的化学合成法合成，亦可以现有的分子生物学方法制备，方法如下：(a)提供如SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：5所示的核苷酸片段；(b)提供一表达载体；(c)将该核苷酸片段与该表达载体重组为一重组表达载体；(d)将该重组表达载体送入宿主细胞中；以及(e)使该宿主细胞表现该多肽，该宿主细胞可以是大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)、酵母菌及动物细胞，但不仅限于此。
以大肠杆菌(E.coli)为例，可选定大肠杆菌系统的表达载体后， 再选定该表达载体中适当的限制酶切位(restriction enzyme site)，以该限制酶剪切该表达载体，亦以该限制酶剪切含有可编码本发明的多肽的核苷酸序列的核苷酸片段，将前述经限制酶剪切后的表达载体及核苷酸片段进行接合反应(ligation)。接着将含有可编码本发明的多肽的核苷酸序列的大肠杆菌系统表达载体转化(transform)入大肠杆菌菌体中，大肠杆菌可为E.coli BL21TM(DE3)pLysS，转化可用电转化(electro-transformation)或热休克(heat shock)等任何习知转化技术来进行，转化后用诱导物(inducer)诱导大肠杆菌表现本发明的多肽，诱导物可为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)等习知诱导物。
以酵母菌为例，则可选定酵母菌系统的表达载体及该表达载体中适当的限制酶切位后，以该限制酶剪切该表达载体，亦以该限制酶剪切含有可编码本发明的多肽的核苷酸序列的核苷酸片段，将以限制酶剪切后的表达载体及核苷酸片段进行接合反应。接着将含有可编码本发明的多肽的核苷酸序列的酵母菌系统的表达载体转化入酵母菌中，转化可用任何习知转化技术来进行，例如可先去除酵母菌的细胞壁，使酵母菌形成原生质球状体(spheroplast)再进行转化，或是用碱性阴离子(如LiCl或RbCl)加上热休克来处理酵母菌以进行转化，转化后用诱导物诱导酵母菌表现本发明的多肽，诱导物可为IPTG等习知诱导物。
以动物细胞为例，可选定动物细胞系统的表达载体及该表达载体中适当的限制酶切位后，以该限制酶剪切该表达载体，亦以该限制酶剪切含有可编码本发明的多肽的核苷酸序列的核苷酸片段，将以限制酶剪切后的表达载体及核苷酸片段进行接合反应。接着将含有可编码本发明的多肽的核苷酸序列的动物细胞系统的表达载体转染入动物细胞中，该动物细胞可为昆虫细胞或哺乳动物细胞，转染可用任何习知转染技术来进行，如用微脂粒感染法(lipofection)或磷酸钙(calcium phosphate)法来表现本发明的多肽。
此外，为使以本发明的促进甲壳类生殖成熟的方法处理的甲壳动物的生殖成熟有效提升，前述的催熟剂可经由口服、注射的方式投予至该动物的体内。口服可以是直接口服或添加于饲料中。当以口服方式投予时，为避免该催熟剂于通过该动物的消化道时，被消化道中的消化液所破坏，该催熟剂可进一步藉由现有技术将其进行微包埋处理，以增强其对抗消化液的能力；或是以纤维素(cellulose)或其它材质、微渗透帮浦(micro-osmotic pump)做为缓释放该催熟剂达到长效促进生殖成熟的目的。作为本发明前述注射方式的例子，包括肌肉注射(IM)及腹腔注射(IP)等，但并不仅限于此。于一较佳实施例中，以腹腔注射方式投予至动物体内时，可使其能发挥最大的效果。
【附图说明】
请参阅以下有关本发明一较佳实施例的详细说明及其附图，将可进一步了解本发明的技术内容及其目的功效；有关该实施例的附图为：
图1为青春激素III(JHIII)与甲基法呢烯酸酯(MF)的化学结构；
图2为昆虫青春激素III(JHIII)的生化代谢合成图(Bede，J.C.，Goodman，W.G.，Tobe，S.S.，1998.Insect juvenile hormone 3 in theSedge，Cyperus iria L.：diatribution and possible biologicalsignificance.Pure Appl.Chem.70，1-9.)；
图3为白虾法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因体DNA序列及示意图；白虾法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因全长含有1413个核苷酸，有两个外显子(exon，大写字母区域表示)及一个插入子(intron，以灰色小写字母区域表示)；其中外显子1(exon1)与外显子2(exon2)分别为426个及799个核苷酸，插入子含188个核苷酸；
图4为草虾法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因体DNA序列及示意图；草虾法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因全长含有1082个核苷酸，有两个外显子(exon，大写字母区域表示)及一个插入子(intron，以灰色小写字母区域表示)；其中外显子1(exon1)与外显子2(exon2)分别为469个及441个核苷酸，插入子含172个核苷酸；
图5为法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因实时定量聚合酶连锁反应(real-time quantitative PCR)的标准曲线；利用LightCycler Software 3.5软件绘FAMeT基因的标准曲线，质体DNA浓度范围为10-4~10-8μg/μl；图5A：扩增曲线图；图5B：melting curve；图5C：标准曲线；标准曲线(线性回归)的Slope＝-3.227，Intercept＝5.777，error＝0.0812(即error＜0.1)，r＝-1，皆在标准范围内，因此此标准曲线是可用的；Meltingcurve图显示单一侦测点，可知针对白虾FAMeT基因所设计的primer具有专一性；
图6为草虾各组织的法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因的表现模式；以Semi-Quantitative RT-PCR做定量分析：图6A(i)利用FAMeT基因专一性引子进行RT-PCR电泳分析结果；(ii)将RT-PCR产物进行南方氏转渍(Southerntransfer)，再以FAMeT基因专一性DIG-labeled probe进行分析的结果；(iii)以β-actin作为internal control；图6B：草虾各组织间FAMeT基因的相对表现量(Relative expression＝FAMeT基因表现量/β-actin基因表现量)，并以Duncan’s Multiple Range Test统计分析具显着差异(p＜0.05)；
图7为白虾各组织的法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因的绝对表现量的表现模式，并以Duncan’s Multiple Range Test统计分析具显着差异(p＜0.05)；
图8为草虾法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因在各个脱壳周期中眼柄组织的表现模式，分析草虾各个脱壳周期中眼柄的FAMeT基因表现；图8A：(i)利用FAMeT基因专一性引子进行RT-PCR电泳分析结果；(ii)以β-actin作为internal control；图8B：草虾在各个脱壳周期中FAMeT基因的相对表现量(Relative expression＝FAMeT基因表现量/β-actin基因表现量)，并以Duncan’s Multiple Range Test统计分析具显着差异(p＜0.05)；
图9为白虾眼柄移除后法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因鳃组织的表现模式；图9A：(i)利用FAMeT基因专一性引子进行RT-PCR电泳分析结果；(ii)将RT-PCR产物进行南方氏转渍，再以FAMeT基因专一性DIG-labeled probe进行分析的结果；(iii)以β-actin作为internal control；图9B：白虾眼柄移除后FAMeT基因的相对表现量(Relative expression＝FAMeT基因表现量/β-actin基因表现量)，并以Duncan’s Multiple Range Test统计分析具显着差异(p＜0.05)；
图10为白虾移除眼柄后对甲基法呢烯酸酯(MF)表现的影响；以HPLC做定量分析Duncan’s Multiple Range Test统计分析，所得数据以平均值±标准偏差(Mean±SD)表示；a、b、c表示具显着差异(p＜0.05)；
图11为重组白虾法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)白质的大肠杆菌表现菌株的建构示意图；
图12为重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)蛋白质最适诱导培养液的探讨；利用Nutrient Broth、N-Z Amine Broth及LB Broth三种培养液分别诱导rFAMeT；在种菌后第3小时添加0.08mM IPTG诱导rFAMeT蛋白的表现，继续培养12小时后收集菌液，利用15％的SDS-PAGE检视诱发结果，箭号表示rFAMeT；
图13为重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)蛋白质最适诱导时间点探讨；在接种后第3、6、9小时分别添加0.08mM IPTG诱导rFAMeT蛋白的表现，继续培养12、9、6小时后收集菌液，利用15％的SDS-PAGE检视诱发结果，箭号表示rFAMeT；第1道：空白对照组(BL21(DE3)pLysS)；第2、4、6道：可溶性蛋白；第3、5、7道：不可溶性蛋白；
图14为重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)蛋白质最适诱导诱导的IPTG浓度探讨；在接种后第3小时分别添加0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mM IPTG诱导rFAMeT蛋白的表现，继续培养12小时后收集菌液，利用15％的SDS-PAGE检视诱发结果，箭号表示rFAMeT；第1道：空白对照组(BL21(DE3)pLysS)；第2~7道：不可溶性蛋白；
图15为重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)蛋白质最适诱导诱导的IPTG浓度探讨(续)；在接种后第三小时分别添加0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mM IPTG诱导rFAMeT蛋白的表现，继续培养12小时后收集菌液，利用15％之SDS-PAGE检视诱发结果，箭号表示rFAMeT；第1道：空白对照组(BL21(DE3)pLysS)；第2~7道：不可溶性蛋白；
图16为重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)蛋白质最适收菌之时间点探讨；在接种后第3小时分别添加0.08mM IPTG诱导rFAMeT蛋白的表现，继续培养后分别在第2、4、6、8、10、12小时收集菌液，利用15％的SDS-PAGE检视诱发结果，箭号表示rFAMeT；图16A：总蛋白；图16B：可溶性蛋白；图16C：不可溶性蛋白；第1道：空白对照组(BL21(DE3)pLysS)；第2~7道：不可溶性蛋白；
图17为重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)蛋白质浓度定量后的结果；rFAMeT蛋白质经定量后，利用15％之SDS-PAGE检视诱发表现rFAMeT蛋白质结果，箭号表示rFAMeT；第1道：10μg总蛋白；第2道：10μg可溶性蛋白；第3~5道：10、20、30μg不可溶性蛋白；
图18为经由Ni-NTA亲合性胶体纯化重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)蛋白质后的结果；经由Ni-NTA亲合性胶体纯化rFAMeT后，利用15％的SDS-PAGE检视诱发结果，箭号表示rFAMeT；第1~9道：Ni-NTA亲合性胶体纯化不同的分段(fraction)；
图19为重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)蛋白质的SDS-PAGE电泳与西方点渍法免疫呈色分析；图19A：利用15％的DS-PAGE检视诱发结果；图19B：西方点渍法免疫呈色反应结果；箭号表示rFAMeT；第1道：空白对照组(BL21(DE3)pLysS)；第2道：没有IPTG诱导的不可溶性蛋白；第3~5道：分别以0.08mM IPTG诱导8、6、4小时后萃取的不可溶性蛋白；
图20为注射重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)蛋白质对白虾血淋巴中甲基法呢烯酸酯(MF)表现的影响；rFAMeT注射量为1μg/g body weight，以HPLC做MF定量分析，并以Duncan’s Multiple Range Test统计分析，所得数据以平均值±标准偏差(Mean±SD)表示；a、b、c、d表示具显着差异(p＜0.05)，ab表示差异不显着(p＞0.05)；
图21为注射不同剂量重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)蛋白质对白虾血淋巴中甲基法呢烯酸酯(MF)表现的影响；rFAMeT注射量为0、1、10、25、50μg/g body weight，以HPLC做MF定量分析，并以Duncan’s Multiple RangeTest统计分析，所得数据以平均值±标准偏差(Mean±SD)表示；a、b、c、d、e表示具显着差异(p＜0.05)；
图22为注射重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)蛋白质及眼柄移除对白虾血淋巴中甲基法呢烯酸酯(MF)表现的影响；以HPLC做MF定量分析，并以Duncan’s Multiple Range Test统计分析，所得数据以平均值±标准偏差(Mean±SD)表示；a、b、c、d表示具显着差异(p＜0.05)；
图23A为白虾母虾各成熟期；图23B为白虾母虾卵巢中卵成熟期。
附图标记说明：1甲基法呢烯酸酯；2青春激素III；201法呢基焦磷酸；202法呢醇；203法呢醛；204法呢烯酸；205环氧法呢烯酸；211磷酸酶；212焦磷酸酶；213法呢醇脱氢酶；214烟碱醯胺腺嘌呤双核苷酸(NAD+)；215法呢醛脱氢酶；216甲基转移酶；217 S-腺苷硫氨酸；218环氧酶；219氧气；220NADPH+H+。
本发明的最较佳实施方式
实施例1 本发明之胜肽片段(法呢烯酸甲基转化酶，FAMeT)的制备
1.对虾法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因cDNA序列选殖
本实验利用TRIzol reagent(Invitrogen，USA)抽取草虾(Giant tigerprawn，Penaeus monodon)与南美白虾(Litopenaeus vannamei)眼柄的总RNA(total RNA)，经RNA电泳分析后，利用SuperScript II RT-PCR System(Invitrogen，USA)进行草虾与白虾的法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因序列的选殖。首先由搜寻基因数据库(GeneBank)寻找其它已知物种的法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因序列，并利用GCG program寻找相似性高的序列，设计一对退化性引子(degenerated primer)，进行反转录聚合酶连锁反应(RT-PCR)。取一小部分反应产物经由1.2％胶体电泳分析，当出现与预期基因片段大小相符的产物时，将所剩下的产物经由低熔点琼脂胶体电泳后，将所需胶体的产物由胶体上切下，进行胶体萃取以取得纯化的特定大小DNA片段，此纯化片段与选殖载体pGEM-T-easy(pGEM-T-easy cloning kit，Promega，USA)进行接合反应，再转化入宿主细胞(E.coli JM109)中；经由小量培养后抽取选殖载体进行定序，将序列资料利用美国生物信息中心(NCBI)网站之BLAST程序进行比对。经由以上步骤选殖出含有正确的草虾与白虾的法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)部分cDNA序列的选殖株后，并将该选殖株再次转化入宿主细胞(E.coli JM109)中复制，抽取高纯度质粒保存，以便进行后续实验。
1.1引物(primer)设计
PCR引物的设计是根据GCG线上比对甲壳类之法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)的核苷酸序列及氨基酸序列，选出2个相似性(homology)最高的区域作为设计引物的参考。首先依据2001年Silva Gunawardene等人从沙虾(Metapenaeus ensis)的神经中分离出的法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因，利用NCBI基因数据库(Gene bank)搜寻比对并设计退化引物(degeneratedprimer)P1及P2，引物序列如SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8所示。根据PCR所得的序列再设计专一性更高之引物(gene specific primer)P3及P4，引物序列如SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10所示，再进行PCR分析。
1.2反转录酶反应(Reverse Transcription)
取5μg之total RNA于200μl微量离心管中加入1μl的oligo(dT)18、10mM dNTPs，并加DEPC水将总体积调整至12μl，于65℃反应5分钟，然后迅速置于冰上。再加入5×cDNA systhesis buffer 4μl、0.1M DTT2μl、RNase inhibitor 1μl及SuperScript II 1μl(200units/μl)，均匀混合，于42℃反应60分钟以合成cDNA，再以70℃作用15分钟以终止反应。
1.3聚合酶连锁反应(PCR)
将RT做好的cDNA模板(template)，以Taq polymerase进行聚合酶连锁反应(PCR)扩增分析。取1μl cDNA加入10mM dNTPs 0.5μl、10×PCRbuffer 2.5μl、专一性引子(gene specific primer，GSP)各0.5μl及1μlTaq polymerase加入二次灭菌水将总体积调整至25μl。将反应管置入DNA热循环机(DNA thermal cycler，GeneAmp PCR system 2700)中，设定以下条件反应：94℃解离2分钟；94℃解离30秒；55℃退火0秒；72℃合成1分钟；解离、退火、合成步骤重复35个循环后保存在4℃下。取反应后的PCR产物5~15μl，以1.5％琼脂胶体进行电泳分析，经溴化乙锭(ethidiumbromide，EtBr)染色10分钟后，以水退染约10分钟，置于照相系统KodakElectrophoreisis Documentation and Analysis system 290(Kodak EDAS290)定量分析及撷取影像。
1.4胶体萃取(Gel extraction)
准备1.5％低熔点琼脂胶体1.5g agarose溶在100ml 1×TAE buffer中以高温溶解，待冷却至55℃后倒注入制胶器中，冷却固定以备用。取已制好的1.5％低熔点琼脂胶体，置于电泳槽中，加入1×TAE buffer，液面需高于胶体表面1mm，取45μl的RT-PCR产物与5μl DNA loading dye均匀混合后注入琼脂胶体中，在85V电流下约60分钟，至蓝色染剂到胶体2/3处，将胶体取出，以溴化乙锭(ethidium bromide，EtBr)染色，并置于照相系统下拍照，将所需的大小片段的DNA，利用刀片自胶体上切下，将切下的胶体秤重。使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)进行胶体萃取；加入3倍胶体重量的QG buffer，置于55℃水浴槽中10分钟溶解胶体，每2~3分钟摇晃一次，待胶体溶解后，加入等量的异丙醇(isopropanol)均匀摇晃，将液体放入QIAGEN之spin column中，离心11,000g 1分钟，移除滤液并加入750μl PE buffer清洗多于胶体，离心11,000g 1分钟，将旧微量离心管移除换上新的1.5ml微量离心管，加入EB buffer(10mM Tris-Cl，pH8.5)或二次灭菌水20μl于spin column中静置15~30分钟，离心12,000g 5分钟，将DNA片段萃取下来，并将溶液保存在-20℃备用。
1.5分析与定序(Auto-sequence)
取已纯化的小量质体DNA，以Taq polymerase进行聚合酶连锁反应(PCR)扩增分析。取0.5μl plasmid DNA加入10mM dNTPs 0.5μl、10×PCRbuffer 2.5μl、各0.5μl的专一性引物T7 primer(forward)及SP6primer(reverse)及1μl Taq polymerase加入二次灭菌水将总体积调整至25μl。将反应管置入DNA热循环机(DNA thermal cycler，GeneAmp PCRsystem 2700)中，设定以下条件反应：94℃解离2分钟；94℃解离30秒；55℃退火30秒；72℃合成1分钟；解离、退火、合成步骤重复30个循环后保存在4℃下。取反应后的PCR产物5~15μl，以1.5％琼脂胶体进行电泳分析反应，经以溴化乙锭(EtBr)染色，置于照相系统及撷取影像，以确定DNA能正确接合。
将确定的菌株，小量培养于3ml LB/Ampicillin液态培养液中，委托源资生物技术公司以自动定序仪ABI PRISM Model 377 automated DNASequencer使用ABI PRISMTM Dye Terminator Cycle方法(PE AppliedBiosystems)分析。定序分析所得的序列以软件NTI Vector 8.0及国家卫生研究院所提供的巨分子序列分析服务GCG(http://gcg.nhri.org.tw：8003/gcg-bin/seqweb.cgi)核酸分析软件的网页接口软件Seq Web，利用Gap、Bestfit、FrameAlign、Pileup、Blast、GrowTree、Map、Translate、Reverse、BackTranslate等分析项目进行线上比对分析。
2.草虾及南美白虾之法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因全长eDNA的克隆
2.1以5’RACE(Rapid amplification of 5’cDNA ends，5’RACE)克隆草虾及南美白虾的法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因cDNA 5’端序列
2.1.1第一股cDNA的合成(First-strand eDNA synthesis)
以5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version 2.0(Invitrogen，USA)进行第一股cDNA的合成。取500ng纯化后poly(A)+mRNA，在微量离心管中加入1μl的GSP primer(2 pmole)，1μl的10mM dNTPs(10mM each dATP，dGTP，dCTP and dTTP at neutral pH)，以RNase-free water将总体积调整至12μl，于65℃中反应5分钟后立即置于冰上，加入4μl的5×First strand buffer、2μl的0.1M DTT及1μlRibonuclease Inhibitor，将溶液混合均匀并置于42℃中2分钟预热，再加入1μl(200U)的Reverse Transcriptase(Superscript II，Life Co.，USA)，将溶液混合均匀，然后在42℃下反应50分钟，最后将样本加热至70℃、15分钟，然后以phenol/chloroform方法纯化一次，将产物保存于-20℃中。
2.1.2使用TdT对纯化的cDNA加尾(TdT Tailing of cDNA)
取20ng纯化好的cDNA(5pmole)，在微量离心管中分加入：5μl的5×tailing buffer、2.5μl 2mM dCTP、10μl purified cDNA sample，以DEPC-treated water将总体积调整至24μl，于94℃反应3分钟、迅速放置冰上1分钟，加入1μl TdT均匀混合，置于PCR机器37℃反应60分钟，然后以65℃热反应10分钟来终止反应。
2.1.3 dC-tailed cDNA的聚合酶连锁反应(PCR of dC-tailed cDNA)
在PCR分析中，使用的引物为法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因的专一性引子(GSP)、Anchor及AUAP等。将下列试药加入微量离心管中进行反应：2.5μl 10×PCR reaction buffer、4μl 1.25mM dNTPs、1μl 50mM MgCl2、10μM forward primer及reverse primer各0.4μl、1μlTaq DNApolymerase(5U/μl)，加入无菌水将总体积调整至25μl；混合后，置入DNA热循环机(DNA thermal cycler，GeneAmp PCR system 2700)中，设定反应条件为：94℃解离4分钟；94℃解离30秒；55℃退火30秒；72℃合成1分钟；解离、退火、合成步骤重复35个循环后，最后以72℃ 10分钟完成反应，保存在4℃下。然后以1.2％琼脂醣胶体进行电泳分析，将可能的DNA片段接入pGEMT-easy TA cloning vector中，如前述步骤进行载体构建及定序反应。
2.2 3’RACE(Rapid amplification of 3’cDNA ends，3’RACE)
2.2.1第一股cDNA的合成(First-strand cDNA synthesis)
取500ng纯化后poly(A)+mRNA，在0.2ml微量离心管中加入1μl的oligo(dT)18(500μg/ml)或架桥引物(adaptor primer)，1μl的10mMdNTPs，以RNase-free water将总体积调整至12μl，于65℃中反应5分钟后，立即置于冰上，加入4μl的5×First strand缓冲液、2μl的0.1M DTT及1μl Ribonuclease Inhibitor，将溶液混合均匀并置于42℃中2分钟预热，再加入1μl(200U)的Reverse Transcriptase(Superscript II，Life Co.，USA)，将溶液混合均匀，在42℃下反应60分钟，最后加热70℃、15分钟以终止反应，并将cDNA保存于-20℃中备用。
2.2.2多聚合酵素连锁反应(PCR)与巢式(Nested)PCR
在PCR分析中，以设计好的架桥引物(adaptor primer)与法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因专一性引物(GSP)进行PCR反应，将下列试药加入微量离心管中进行反应：2.5μl 10×PCR reaction buffer、4μl 1.25mM dNTPs、1μl 50mM MgCl2、10μM forward primer及reverse primer各0.5μl、1μlTaq DNA polymerase(5U/μl)，加入二次灭菌水将总体积调整至25μl。混合后，置入DNA热循环机(GeneAmp PCR system 2700)中反应，反应条件如上述所示，利用1.2％琼脂醣胶体进行电泳分析，将目标的DNA片段接入pGEMT-easy TA cloning vector中，如前述步骤进行载体构建及定序反应。
2.2.3定序结果与分析
将已克隆的DNA片段定序结果与已知其它甲壳类的法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因，以NCBI中的GeneBank序列做BLAST，比较核苷酸与氨基酸序列之间的相似性。
A.草虾及南美白虾的法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因(cDNA)序列与比对结果
分子克隆南美白虾的法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)cDNA约有750 bp序列，利用5’RACE、3’RACE技术，选殖出南美白虾的法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因全长的cDAN序列，如SEQ ID NO：3所示，该cDNA序列全长由1221个核苷酸所组成，包含9个核苷酸的5’未转录区域(5’UTR)、368个核苷酸的3’未转录区域(3’UTR)及840个核苷酸的转译区域(codingregion)，可转译出280个胺基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，分子量为32kDa。
草虾的法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)cDNA克隆到约有750bp序列，再以草虾眼柄基因文库(cDNA Library)中筛选比对出草虾的法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因之5’、3’端未转录区域(5’，3’untranslation region，5’，3’UTR)，而得到草虾的法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因全长的cDAN序列，如SEQ ID NO：5所示，该cDAN序列共有1221个核苷酸，包含51个核苷酸的5’未转录区域(5’UTR)及840个核苷酸的转译区域，可转译成280个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，分子量为32kDa。
以GCG之SeqWeb及NTI Vector 8.0核酸分析软件，将草虾、南美白虾、沙虾(Metapenaeus ensis)、黄道蟹、美国龙虾与加州龙虾(Californiaspiny lobster，Panulirus interruptus)等甲壳类动物的法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)胺基酸序列作比较，各物种的法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)胺基酸序列的相似度(similarity)如表一所示。
表一各种甲壳类动物的法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)胺基酸序列相似度
从表一中可以看到，SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2所示序列的法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)多肽，其序列和所有进行比对的动物之法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)都具有很高的相似性(similarity)。凭此推论可知，本发明的多肽亦应能促进其它甲壳类之动物的生殖成熟。
B.草虾及南美白虾的法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因体(Genomic DNA)定序结果
将白虾与草虾基因体DNA(genomic DNA)以PCR技术进行序列克隆，克隆到一DNA片段，长度约为400bp，将此片段以GCG program指令程序比对，确实为白虾与草虾法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因体DNA序列。
白虾法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因体DNA序列如SEQ ID NO：4及图3所示，含有两个外显子(exon)，及一个插入子(intron)；其中外显子1(exon 1)与外显子2(exon 2)分别为426个、799个核苷酸所组成，插入子(intron)由188个核苷酸所组成。
草虾法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因体DNA序列如SEQ ID NO：6及图4所示，也含有两个外显子(exon)，及一个插入子(intron)；其中外显子1(exon 1)与外显子2(exon 2)分别为469个、441个核苷酸所组成，插入子(intron)则由172个核苷酸所组成。
实施例2 白虾与草虾法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因在各组织间的表现模式
以半定量反转录聚合酶连锁反应(semi-quntitative RT-PCR)技术，分析法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)在白虾与草虾之各组织之间的表现分布情形。
3.抽取草虾与白虾各组织的total RNA
分别取种虾体型的草虾(平均体长约17公分；平均体重约22公克)与白虾(平均体长约22公分；平均体重约27克)之眼柄(eyestalk)、血淋巴(hemocyte)、脑(brain)、鳃(gill)、肝胰脏(hepatopancreas)、肌肉(muscle)、表皮(epidermis)、大颚器官(mandibular organ)、肠(gut)、心脏(heart)、卵巢(ovary)、睪丸(testis)，先以DEPC水清洗，加入10倍体积的TRIzol reagent，用剪刀先将组织剪碎再用均质棒打碎，加入1/5的氯仿(chloroform)，强力摇晃30秒，置于室温下静置10分钟，在4℃下以12000×g离心15分钟，吸取上清液至新的微量离心管中，加入2倍体积的异丙醇，均匀混合，置于室温下静置10分钟，在4℃下以12000×g离心15分钟，将RNA溶解在20μl DEPC水中，置于55℃下溶解10分钟，测量RNA浓度与纯度比值，并储存在-80℃冰箱中备用。
3.1半定量反转录聚合酶连锁反应(Semi-quantitative RT-PCR)
将萃取出来的RNA每管定量至5μgtotal RNA，加入1μl的oligo(dT)18、10mM dNTPs，加入5×First Strand Buffer 4μl及1μl AMV(24units/μl)，均匀混合至20μl，于42℃反应60分钟以合成cDNA，在以70℃作用15分钟以终止反应。以做好的cDNA为模板，设计已知法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因序列的专一性引物P3、P4，引物序列如SEQ ID NO：9及SEQID NO：10所示，作为PCR扩增分析，以溴化乙锭(EtBr)染色，将产物进行电泳照相(Kodak Electrophoresis Documentation and Analysis system290，Kodak EDAS 290)分析。实验所得的数据，以SAS(StatisticAlaIysis System)软件，运用单变量分析(One-way analysis ofvariance)，利用Duncan’s Multiple Range Test与sigma-plot V.7.1软件来做定量及统计分析。
3.2南方氏点墨法分析(Southern transfer)
3.2.1转渍(Transfer)
将已定量的胶体经过清洗后，以变性缓冲液(denature buffer，0.5NNaOH，1.5M NaCl)摇晃20分钟，将DNA进行双股变性，再以中和缓冲液(neutralising buffer，0.5M Tris pH 7.0，1.5M NaCl)摇晃20分钟进行二次，然后以2x SSC浸泡5分钟，即可准备转渍。
剪好适合大小的尼龙膜(nylon membrane)及3M paper三张，并以2x SSC浸泡5分钟，将DNA胶体放置已贴好保鲜膜的转渍台上，依次由下而上分别为保鲜膜、胶体、尼龙膜、湿润的3M paper、适合大小的卫生纸，并以重物或书覆盖，进行转渍至隔夜使DNA藉由毛细现象而转印至尼龙膜上；转渍后，将尼龙膜以UV closslink处理，并用锡箔纸包好储存备用。
3.2.2探针的制备(DIG probe)
取已知白虾法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)的片段，设计专一性引物进行PCR反应得到250bp的片段产物，将此片段回收并纯化出来备作探针。将纯化后PCR产物稀释成总体积15μl，置于沸水中加热10分钟后，迅速将DNA置于冰上冷却，依序加入2μl hexanucleotide mix、2μl dNTPs、1μl Klenowenzyme，混合均匀并离心30秒，静置于37℃反应至少60分钟，加入2.0μl0.2M EDTA(pH 8.0)停止反应；加入2.5μl 4.0M LiCl和-20℃的100％酒精75μl，于-80℃放置30分钟；以13,000×g离心15分钟，再以70％酒精50μl洗涤沉淀物，然后真空干燥并将沉淀物溶解于50μl TE缓冲液中备用。
3.2.3前杂交处理(Pre-hybridization)
将尼龙膜(nylon membrane)放入杂交瓶(hybridize bottle)中，加入预杂交溶液(pre-hybridization solutions，5×SSC，0.1％N-lauroylsarcosine，0.02％SDS，1％Blocking reagent)，于42℃中摇荡反应30分钟。
3.2.4杂交处理(Hybridization)
将已被DIG标记的probe DNA置于沸水中加热10分钟后，迅速将probeDNA置于冰上冷却，加入于含有尼龙膜(nylon membrane)及pre-hybridization solution的杂交瓶中，于42℃中摇荡反应至隔天。
3.2.5洗涤和免疫侦测(Immunological detection)
将已经完成杂交步骤的尼龙膜(nylon membrane)以wash buffer作用1~5分钟。将尼龙膜置于100ml blocking solution中反应30分钟，将anti-DIG-AP conjugate以blocking solution稀释到75mU/ml的浓度(1∶10000稀释)；将尼龙膜置于50ml已经稀释的抗体溶液中反应30分钟，以100ml washbuffer洗尼龙膜两次，每次15分钟。
将尼龙膜(nylon membrane)置于20ml detection buffer中作用2~5分钟。将尼龙膜置于10ml新配制的color-substrate solution中，避光反应；尼龙膜上的颜色在2小时之内开始出现，并于16小时之后完全反应；当尼龙膜上的颜色清楚时，将尼龙膜置于50ml蒸馏水中5分钟，以终止反应的进行，将尼龙膜影印或照相记录实验结果。
含有10-4~10-8μg/μl浓度法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因的质粒，以实时定量聚合酶连锁反应(real-time quantitative PCR)进行各浓度定量后，以LightCycler Software 3.5软件绘出法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因的标准曲线，如图5所示，图5A为扩增曲线图；图5B为熔解曲线(meltingcurve)；图5C为标准曲线，标准曲线的误差(error)＜0.1，r＝-1，皆在标准范围内，故此标准曲线是可用的；图5B之熔解曲线图仅显示单一侦测点，可知针对白虾法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因所设计的引物的专一性相当高。
3.2.6结果
以半定量反转录酶-聚合酶连锁反应(semi-quntitvative RT-PCR)分析法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因各组织间表现情形，草虾(Penaeusmonodon)结果如图6所示，图6A(i)为利用法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因专一性引物进行RT-PCR电泳分析结果；图6A(ii)为将RT-PCR产物进行南方氏转渍，再以法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因专一性DIG-labeled probe进行分析的结果；图6A(iii)为以β-actin作为内部对照组(internalcontrol)的RT-PCR电泳分析结果；经过分析计算后结果如图6B所示，草虾在眼柄、心脏、脑、肝胰脏、卵巢、大颚器官(mandibular organ)、血淋巴、肌肉、肠、表皮、鳃，其FAMeT/β-actin相对表现量比值分别为0.36、0.53、1.30、0、1.34、0.40、0.57、0.55、0.89、0.69、0.74，以Duncan’s Multiple Range Test统计分析，其中在精巢表现量最高(p＜0.05)，依次为鳃、脑、肌肉、心脏，而眼柄的表现量最少，肝胰脏则没有侦测到信号。
白虾的法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因各组织间表现情形如图7所示，以实时定量反转录酶-聚合酶连锁反应(quntitvative RT-PCR)分析结果显示在白虾(Lipopenaeus vannamei)的大颚器官(mandibular organ)、胃、肠、肌肉、肝胰脏、脑、神经、鳃及生殖腺(精巢)等器官的法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因绝对表现量分别为0.07、0.05、0.08、0.06、0.0003、0.59、0.48、0.14、0.21(FAMeT mRNA copy number(x1020)/μg mRNA)，其中在脑及神经表现量最高(p＜0.05)，依次为精巢、鳃、肠、大颚器官、肌肉、胃，而肝胰脏的表现量最少，且眼柄、心脏则没有侦测到信号。
实施例3 草虾在脱壳周期中法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因表现模式
本实验抽取草虾各个脱壳周期的RNA，以半定量反转录酶聚合酶连锁反应(semi-quantitative RT-PCR)分析草虾法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)于各个不同脱壳周期的表现量。
4.1抽取草虾虾眼柄之total RNA
脱壳分期系参照(Smith，D.M.，W.Dell.，1985.Moult staging thetiger prawn Penaeus esculentus.Pp.”95 in Second AustralianNational Prawn Seminar，P.C.Rothlisberg，B.J.Hill，and D.J.Staple，eds.NPS2，Cleveland，Australia.)对澳洲产虎虾(Penaeus esculentusHaswll)的脱壳分期方法。在立体解剖显微镜下(90x)观察草虾尾扇(uropod)的刚毛发育(setal development)、刚毛结节(setal node)及表皮线(epidermal line)的形态变化作为分期之依据特征，脱壳周期分为脱壳后期(postmolt，A/B期)、脱壳间期(intermolt，C期)、脱壳前期(premolt，D0、D1、D2、D3期)。取不同脱壳周期的草虾，萃取眼柄mRNA，加入10倍体积的TRIzol reagent，利用均质机(polytron)将组织打碎，进行抽取。将RNA溶解于20μl DEPC水中，测量吸光质O.D.260/280数值，进行定量。接着以半定量反转录酶聚合酶连锁反应(semi-quantitative RT-PCR)分析草虾法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)于各个不同脱壳周期的表现量。
4.2结果
根据草虾各个脱壳周期尾柄刚毛变化图(Smith，D.M.，W.Dell.，1985.Moult staging the tiger prawn Penaeus esculentus.Pp.”95 inSecond Australian National Prawn Seminar，P.C.Rothlisberg，B.J.Hill，and D.J.Staple，eds.NPS2，Cleveland，Australia.)分析草虾于脱壳周期分期的A/B、C、D0、D1、D2、D3期中，法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)RNA的表现模式，结果如图8A所示，图8A(i)为利用法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因专一性引子进行RT-PCR电泳分析结果，图8A(ii)为以β-actin作为内部对照组之RT-PCR电泳分析结果；经过分析计算后结果如图8B所示，FAMeT/β-actin基因相对表现量比值依脱壳周期分期A/B、C、D0、D1、D2、D3期，分别为0.31、1.76、0.70、0.33、0.60、0.71，法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因于草虾脱壳间期(C期)中表现量最高，以Duncan’s MultipleRange Test统计分析，相较其它脱壳周期表现量具有显着差异(p＜0.05)，当进入脱壳前期(D期)则逐渐下降。
实施例4 白虾在眼柄移除后法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因表现模式
本实验先将白虾的单眼柄移除，在不同时间点抽取白虾RNA，以半定量反转录酶聚合酶连锁反应(semi-quantitative RT-PCR)分析白虾法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)于单眼柄移除后的表现情形。
5.1白虾虾眼柄total RNA的抽取
取成熟白虾以一只手握住虾体固定其头胸部，另一只手持以瓦斯焊枪高温烧烤镊子并夹取单眼柄并迅速压住伤口约五秒钟，此时伤口会因高热而立刻凝固，达到立即止血的效果。在移除眼柄后第0、1、6、9、12、18、24、48、72、146小时，抽取白虾取脑、鳃、大颚器官(MO)、雄生殖腺RNA，加入10倍体积的TRIzol reagent，利用均质机(polytron)将组织打碎，进行抽取。将RNA溶解于20μl DEPC水中，测量吸光质O.D.260/280数值，进行定量。接着以半定量反转录酶聚合酶连锁反应(semi-quantitative RT-PCR)分析白虾法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)于单眼柄移除后之表现情形。
5.2结果
分析白虾于眼柄移除后，法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)RNA的表现模式，结果如图9A所示，图9A(i)为利用法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因专一性引子进行RT-PCR电泳分析结果，图9A(ii)为将RT-PCR产物进行南方氏转渍，再以法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因专一性DIG-labeled probe进行分析之结果，图9A(iii)为以β-actin作为内部对照组之RT-PCR电泳分析结果；经过分析计算后结果如图9B所示，FAMeT/β-actin基因相对表现量比值依眼柄移除后第0、1、6、9、12、18、24、48、72、146小时，分别为0.86、0.92、0.95、0.75、1.02、1.12、1.30、1.35、1.34、1.65，在眼柄移除后之146小时，其法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因表现量相较于其它时间点表现量高，以Duncan’s Multiple Range Test统计分析，具有显着差异(p＜0.05)；实验结果显示，经眼柄移除后法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因表现量会随着时间越久即有明显上升的趋势。
实施例5 白虾在眼柄移除后对甲基法呢烯酸酯(MF)表现的影响
为了了解白虾于眼柄移除后，甲基法呢烯酸酯(MF)对生理上之影响，将白虾分别于在移除眼柄后第3天及第6天，使用1ml针筒(针头为”)自白虾之血窦(sinuses)抽取血淋巴液(haemolymph)进行HPLC分析。结果如图10所示，未剪眼柄白虾的甲基法呢烯酸酯(MF)在第3及第6天含量分别为1.12及1.25ng/ml haemolymph；而剪眼柄白虾的甲基法呢烯酸酯(MF)在第3及第6天含量分别为11.5及15.35ng/ml haemolymph。由此可知，在眼柄移除后，白虾的甲基法呢烯酸酯(MF)表现量相较于未剪眼柄者高，且以Duncan’s Multiple Range Test统计分析，两者具有显着之差异(p＜0.05)。此外，经眼柄移除后白虾的甲基法呢烯酸酯(MF)表现量也会随着时间呈现上升的趋势。
实施例6 重组白虾法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)蛋白质的大肠杆菌表达质粒的构建
将已选殖出来的白虾法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因转译区(codingregion)序列，设计专一性引物，利用聚合酶连锁反应(PCR)技术大量复制，经核酸定序及序列比对之后，确定为法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因序列，以酵素限制酶的剪切作用，将法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因克隆于商用载体pET28b(+)(Novagen，USA)中(如图11所示)，并转化于表现宿主(expression host)E.coli BL21(DE3)pLysS，以IPTG诱导此表达质粒，使大肠杆菌系统大量表现重组蛋白质。
6.1表达载体的构建(Expression vector construction)
6.1.1专一性引物的设计
从已克隆出的白虾法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因转译区序列中，设计正向(forward)与反向(reverse)的专一性引物：
正向引物EXP1(含有NdeI限制酶酶切位置)：
5’-CATATGGGCGATAGCTGGGCT-3’ (SEQ ID No：11)
NdeI
反向引物EXP2(含有XhoI限制酶酶切位置)：
5’-CTCGAGGAATTCGAACTTCCACTT-3’ (SEQID No：12)
XhoI
6.1.2聚合酶连锁反应(PCR)
取质体DNA为模板，以Taq polymerase进行聚合酶连锁反应(PCR)扩增分析。取0.5μl DNA加入10mM dNTPs 0.5μl、10×PCR buffer 2.5μl、专一性引物(EXP1、EXP2)各0.5μl及1μl Taq polymerase加入二次灭菌水将总体积调整至25μl。将反应管置入DNA热循环机(DNA thermalcycler；GeneAmp PCR system 2700)中，设定以下条件反应：94℃解离5分钟；94℃解离30秒；55℃退火30秒；72℃合成7分钟；解离、退火、合成步骤重复35个循环后保存在4℃下。取反应后的PCR产物5~15μl，以1.5％琼脂胶体进行电泳分析反应，经以溴化乙锭(EtBr)染色，置于照相系统Kodak Electrophoreisis Documentation and Analysis system 290(Kodak EDAS 290)分析及撷取影像。
6.1.3胶体萃取(Gel extraction)
以QIAGEN Gel Extraction kit纯化DNA，详细步骤如1.4所述。
6.1.4限制酶的酶切作用(Restriction enzyme digestion)
取适量10μg DNA，加入0.5μl限制酶NdeI(20U/μl)、0.5μl限制酶XhoI(20U/μl)、2μl 10×ligation buffer、0.2μl 100×BSA，再加灭菌水使总体积达20μl，于37℃反应3小时，回收DNA片段。而表现载体pET28b(+)也以相同条件进行酶切作用3小时，并回收载体DNA片段。
6.1.5表达载体与法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因的接合反应(Ligation)
将经限制酶(NdeI、XhoI)酶切过的DNA片段与pET28b(+)片段以3∶1(w/w)比例混合，加入反应液10×ligation buffer 1μl、T4 DNAligase 1μl，再加入灭菌水使总体积达10μl，于16℃反应16小时。
6.1.6转化作用(Transformation)
取出储存于-80℃的宿主细胞E.coli BL21TM(DE3)pLysS 100μl，加入已经接合好的DNA产物，置于冰上30分钟，然后于42℃水浴槽中热刺激90秒避免摇晃，迅速放在冰上，加入800μl SOC medium，于37℃恒温培养箱震荡培养2小时；将菌液均匀涂抹于LB/Kanamycin(50μg/ml)/Chloramphenical(34μg/ml)固态培养基上，倒置培养皿于37℃培养12~16小时。
6.1.7快速筛选(Fast selection)
挑选单一菌落接种于3ml LB/Kanamycin(50μg/ml)/Chloramphenical(34μg/ml)培养液中，于37℃震荡培养12~16小时，吸取菌液100μl以3,000×g离心10分钟，移除上清液后加入150μl灭菌水，于94℃反应5分钟，再以12,000×g离心10分钟，吸取上清液为模板，以市售T7 primer、T7 terminator primer及EXP1、EXP2为引子，进行聚合酶连锁反应(PCR)扩增分析，以1.5％琼脂胶体进行电泳分析，经溴化乙锭(EtBr)染色，置于照相系统Kodak Electrophoreisis Documentationand Analysis system 290(Kodak EDAS 290)分析及撷取影像，检视目标菌株重组质粒构建是否正确。
6.1.8分析与定序(Auto-sequencing)
将确定的菌株，小量培养于3ml LB/Kanamycin(50μg/ml)/Chloramphenical(34μg/ml)液态培养液中，委托源资生物技术公司以自动定序仪ABI PRISM Model 377 automated DNA Sequencer使用ABIPRISMTM Dye Terminator Cycle方法(PE Applied Biosystems)分析已确认克隆的基因。
6.2菌株保存、活化及培养
6.2.1菌种保存
为避免于固态培养基中不断重复转接(transfer)菌株，造成实验上再现性不佳，故以甘油保存同一批菌株，以作为每次实验的种源。
以三区划菌法将菌株接种在LB/Kanamycin(50μg/ml)/Chloramphenical(34μg/ml)固态培养基上，倒置培养皿于37℃培养12~16小时，取单一菌落接种于25ml LB/Kanamycin(50μg/ml)/Chloramphenical(34μg/ml)液态培养液中，于37℃恒温培养箱震荡培养12小时；加入等体积之甘油，混合均匀后分装于eppendorf中，保存于-20℃备用。
6.2.2种菌活化及种培养
由于种菌保存于-20℃下，菌体的生理代谢活性休止状态，所以必须先加以活化再种培养，才可获得较佳之生长及活性表现。取30μl之保存种菌，接种于3ml LB/Kanamycin(50μg/ml)/Chloramphenical(34μg/ml)液态培养液中，于37℃恒温培养箱震荡培养12小时，此为种菌活化(activation)。取30μl之活化种菌，接种于3ml LB/Kanamycin(50μg/ml)/Chloramphenical(34μg/ml)液态培养液中，于37℃恒温培养箱震荡培养12小时，此为种培养(seed culture)。
实施例7重组白虾法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)蛋白质最适诱导条件与蛋白质样品制备
7.1最适诱导条件的探讨
7.1.1最适诱导的培养液
取1ml种培养液(由上述实施例6所制得)分别接种于含有50ml培养液(Nutrient Broth、N-Z Amine Broth、LB Broth)的三角瓶中(均分别添加Kanamycin 50μg/ml、Chloramphenical 34μg/ml)，于37℃以200rpm转速下震荡恒温培养，在种菌后第3小时添加0.08mM IPTG诱导重组法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)蛋白的表现，继续培养12小时后收集菌液，利用15％的SDS-PAGE检视诱发结果。
7.1.2最适诱导的时间点
取1ml种培养液接种于含有50ml N-Z Amine Broth的三角瓶中，于37℃以200rpm转速下震荡恒温培养，在接种后第3、6、9小时分别添加0.08mM IPTG诱导重组法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)蛋白的表现，继续培养12、9、6小时后收集菌液，利用15％的SDS-PAGE检视诱发结果。
7.1.3最适诱导的IPTG浓度
取1ml种培养液接种于含有50ml N-Z Amine Broth的三角瓶中，于37℃以200rpm转速下震荡恒温培养，在接种后第三小时分别添加0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mM IPTG诱导重组法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)蛋白的表现，继续培养12小时后收集菌液，利用15％之SDS-PAGE检视诱发结果。
7.1.4最适收菌的时间点
取1ml种培养液接种于含有50ml N-Z Amine Broth的三角瓶中，于37℃以200rpm转速下震荡恒温培养，在接种后第三小时分别添加0.08mMIPTG诱导重组法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)蛋白的表现，继续培养后分别在第2、4、6、8、10、12小时收集菌液，利用15％的DS-PAGE检视诱发结果。
7.2内涵体分离与回溶
7.2.1内涵体分离
取诱导后的菌液以5,000×g离心10分钟收集菌体，以PBS清洗菌体数次，再加入适量的BugbusterTM Protein Extraction Reagent(Novagen，USA)与PBS混合至略微澄清。利用超音波震碎机(sonicator)于冰浴中破菌，功率设定25，每破菌10秒，休息10秒，共处理30分钟，此时的细菌破碎液即为总蛋白(total protein)。破碎液于4℃以12,000×g离心30分钟，上清液为可溶性蛋白(soluble protein)，沉淀部份为不可溶性蛋白(insolubleprotein)，再以PBS清洗沉淀部分2次，此即为内涵体的粗萃取物
7.2.2内涵体回溶
将内涵体的粗萃取物以含有6M urea之PBS(pH 12)均匀悬浮，置于冰上反应1小时使其溶解，溶解后的内涵体于4℃以17,000×g离心30分钟，收集上清液，测其蛋白质浓度及利用15％的SDS-PAGE检视诱发结果。
7.3内涵体纯化与复性
7.3.1亲和层析法
Ni-NTA亲合胶体乃藉由Ni与histidine的亲合性达到纯化的目的，此纯化方式称为固定化金属亲合性管柱层析法(immobilized metal affinitychromatography)。取5ml的His·Bind Resin(Novagen，USA)充填至管柱中，以自然重力将保存液之酒精去除，依序加入3倍胶体体积的灭菌水、5倍胶体体积的charge buffer(50mM NiSO4)、3倍胶体体积的binding buffer(5mM imidazole、0.5M NaCl、20mM Tris-HCl，pH 7.9)，将回溶后的内涵体以PBS对半稀释后将pH调至7.9，以0.45μm孔径的过滤模去除未溶解部分后通入管柱。再加入10倍胶体体积的binding buffer(5mM imidazole、0.5M NaCl、20mM Tris-HCl，pH 7.9)、6倍胶体体积的wash buffer(60mM imidazole、0.5M NaCl、20mM Tris-HCl，pH 7.9)清洗去除非专一性结合的蛋白质。最后以6倍胶体体积的elute buffer(1M imidazole、0.5M NaCl、20mM Tris-HCl，pH 7.9)流洗出目标蛋白。
7.3.2复性与脱盐
溶解后的内涵体可藉由缓慢移除变性剂而使蛋白质重新折迭回复成正确结构。将流洗出的目标蛋白置于透析膜中，以PBS缓冲溶液(pH 8.5)于4℃下透析，每三小时更换一次缓冲溶液，更换四次后透析至隔天，以去除变性剂及盐类。
在最适诱导的培养液上，分别于Nutrient Broth、N-Z Amine Broth、LB Broth中，添加适量IPTG诱导重组法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)蛋白表现。结果如图12所示，本实验的标的蛋白在不可溶性蛋白(insolubleprotein，如图12箭头标示处)中皆可被诱导出；于Nutrient Broth中的诱导效果较差(图12第2、3道)，而于N-Z Amine Broth(图12第4、5道)、LBBroth(图12第6、7道)中皆有较佳诱导效果，其中又以N-Z Amine Broth中诱导可得到最佳诱导效果。
在IPTG最适诱导的时间点上，于接种后第3、6、9小时分别添加适量IPTG诱导重组法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)蛋白的表现。结果如图13所示，在接种后第3小时，添加IPTG诱导重组法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)蛋白可得到最佳诱导效果(图13第3道)；且随着接种的时间增加，再添加IPTG进行诱导重组法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)蛋白表现时，得到结果为较差(图13第5、7道)。
在最适诱导的IPTG浓度上，于接种后3小时分别添加最终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mM IPTG，诱导重组法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)蛋白表现。结果如图14所示，在未添加IPTG(0mM)组别上无目标蛋白被诱导出(图14第2道)，而以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mM IPTG分别诱导后，皆有大量目标蛋白被成功诱导出，且彼此间并无显着差异(图14第3~7道)。IPTG个昂贵药品，若要大量生产必须考虑成本问题，故试着降低IPTG浓度，观察诱导结果是否有差异。于接种后第3小时分别添加最终浓度分别为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mM IPTG，诱导重组法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)蛋白表现。结果如图15所示，随着IPTG浓度增加，目标蛋白诱导量也会跟着增加，而在0.08mM IPTG诱导下，可得到最佳诱导效果(图15第6道)。
在最适收菌的时间点上，在种菌后第三小时分别添加0.08mM IPTG诱导重组法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)蛋白表现，继续培养后分别在第2、4、6、8、10、12小时收集菌液，进行分析。结果如图16所示，在总蛋白(totalprotein，图16A)、可溶性蛋白(soluble protein，图16B)及不可溶性蛋白(insoluble protein，图16C)结果中，皆可发现随着培养时间增加，所诱导出目标蛋白量也随之增加；尤其在不可溶性蛋白上结果特别明显；但在添加IPTG诱导第8小时后，目标蛋白诱导效果即无明显增加情况(图16C第5道)，故选择以IPTG诱导后第8小时，做为最适收菌时间点。
综合以上实验结果得知，将白虾法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)基因片段与表现载体pET28b(+)经由NdeI、XhoI剪切后再进行接合反应，转化至Escherichia coli BL21(DE3)pLysS表现宿主中，于37℃下以N-Z AmineBroth为培养液，培养第3小时后以0.08mM IPTG诱导8小时后可获得最佳表现量，此重组蛋白以不可溶的内涵体形式存在。
实施例8 蛋白质浓度的定量(BCA protein assay)与重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)表现量分析
8.1蛋白质浓度的定量
利用缩二脲反应(biuret reaction)的原理，即蛋白质的peptide bond在碱性的环境下，可以将两价的铜离子还原成一价，而一价的铜离子会与BCA(bicinchoninicacid)作用形成紫色的错化合物，并在550~570nm有吸光值，而在562nm有最强光值，在某特定范围内(20~2,000μg/ml)，是随着浓度上升而递增。
分别取100μl样品及蛋白质定量标准品(bovine serum albumin20~2,000μg/ml)，分别加入已配置好的working reagent(A∶B＝50∶1)2ml中，在37℃反应30分钟后待其冷却。利用分光光度计测量562nm吸光质，将未知样品结果代入标准曲线即可求得浓度。
8.2重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)表现量分析
重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)表现量分析是将蛋白质电泳胶片置于照相系统Kodak Electrophoreisis Documentation and Analysis system290(Kodak EDAS 290)定量分析及撷取影像，以纯化后的重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)作为标准品，比较重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)占不可溶性蛋白的比例。
8.2.1聚丙烯醯胶蛋白质电泳(SDS-PAGE)
先组装设置好玻璃片，依以下配方先制resolving gel(15％)，加入70％酒精来压平胶体，待干时间约为1个小时。之后将70％酒精移除，用灭菌水清洗胶缝，不要使70％酒精残余胶体上。再依配方制作stacking gel(5％)，待干时间约为1个小时。
SDS-PAGE配方：
待干后即可将蛋白质样品进行分析，样品分别加入同体积之2×samplebuffer后放入70℃水浴10分钟，迅速置于冰上。取20μl的蛋白质样品，进行SDS-PAGE实验。
蛋白质染色以commassie blue staining solution染色至隔夜，换置destaining solution，退染直到清楚辨识蛋白质样品。
8.2.2西方点渍法免疫呈色反应(Western blot hybridization)
跑完SDS-PAGE后把蛋白质转印至PVDF转印膜上，利用一次抗体对膜上的蛋白质做专一性结合，再用二次抗体对一次抗体进行专一性的结合；而因二次抗体上连结有呈色酵素(选用radish peroxidase，HRP)，经呈色后可得以侦测；因其利用专一性抗体与蛋白质结合，可再进一步确认诱导出的重组蛋白是否正确。
8.2.3转印(Transfer)
将蛋白质电泳结束后之胶片以transfer buffer浸泡平衡5分钟，另将PVDF膜以100％甲醇浸渍数秒后，同样以transfer buffer浸泡平衡5分钟，在负极导板上依序放上3M paper、胶片、PVDF膜与3M paper，再将正极导板盖上，以25伏特电压转印2小时。
8.2.4杂交与侦测(Hybridization and detection)
取出转印结束后之PVDF膜，以TBS漂洗5分钟倒掉溶液，再以blockingsolution缓慢震荡2小时(进行blocking)。结束后以TBS漂洗PVDF膜5分钟，加入10ml一次抗体溶(His·monoclonal antibody，1∶3000)，于室温下缓慢震荡杂交2小时。倒掉一次抗体溶液，以TBS清洗3次，每次5分钟，再加入二次抗体溶液(Goat Anti-mouse IgG-HRP conjugate，1∶5000)，于室温下缓慢震荡杂交2小时。倒掉二次抗体溶液，以TBS清洗3次，每次30分钟。倒掉TBS后加入呈色剂呈色，最后浸泡于蒸馏水以终止呈色反应，呈色结束后将PVDF膜自然风干，并照相记录实验结果。
在构建重组白虾法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)蛋白质大肠杆菌表现菌株时，在此菌株的C端加了6个histidine，因此可利用与之吸附的镍亲和性管柱(Ni-NTA)进行层析纯化。且Ni-NTA结合方式与蛋白质构型无关，且不会因变性剂存在而受影响，因此只要蛋白质具有His·Tag(6x histidine)，无论是还原态(native)或变性(denature)下，均可利用此方法进行纯化。
本实验以含有6M urea之PBS(pH 12)溶解内涵体，经稀释及调整pH后，注入His·Bind Resin(Novagen，USA)管柱进行纯化，所得纯化的法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)重组蛋白经15％SDS-PAGE蛋白质电泳分析后，结果如图17、图18所示，法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)重组蛋白的分子量约为36kDa。
8.2.5蛋白质浓度的定量(BCA protein assay)与重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)表现量分析
为了了解重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)占不可溶性蛋白的比例，故利用蛋白质电泳胶片置于照相系统Kodak Electrophoreisis Documentationand Analysis system 290(Kodak EDAS 290)撷取影像及定量分析，以纯化后之重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)作为标准品以进行比较。结果如表二所示，以上述最适诱导条件进行重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)诱导，经纯化及复性后，每公升培养液可生产120.5mg重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)，表现量约不可溶性蛋白之43％。
表二 自内涵体萃取的蛋白质回收率(protein recovery)
a所有蛋白浓度以BCA protein assay套组定量
b以密度计(densitometer)定量
8.2.6西方点渍法免疫呈色反应(Western blot hybridization)
西方点渍法免疫呈色反应是利用专一性抗体与蛋白质结合，经呈色后可再进一步确认，所诱导出的重组蛋白是否正确。
在SDS-PAGE结果上显示，如图19A所示，每个蛋白质样品均可利用commassie blue染剂染出一整条色带，以0.08mM IPTG诱导之重组蛋白8、6、4小时，在36kDa左右皆有一明显色带呈现，且随诱导时间增加，色带有变粗现象。再利用西方点渍法免疫呈色反应做进一步确认，结果如图19B所示，在空白对照组(BL21(DE3)pLysS)(图19B第1道)及未添加IPTG诱导之蛋白质(图19B第2道)，经呈色后均无色带呈现；以0.08mM IPTG诱导的重组蛋白各样品，则皆有明显色带呈现，且呈色位置与结果与SDS-PAGE的结果有相同趋势(图19A、B第3~5道)；由此可再进一步确定，所诱导出的重组蛋白是正确的。
实施例9在利用重组法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)蛋白质注射后白虾甲基法呢烯酸酯(MF)表现型式
9.1预备实验
将诱导出的法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)重组蛋白质经纯化及复性后，以PBS稀释成1μg/g body weight，以1ml针筒(针头为”)由白虾背部肌肉注射，以注射PBS为对照组。分别注射后在第0、1、2、3、6天，使用1ml针筒(针头为”)自白虾的血窦(sinuses)抽取血淋巴液进行HPLC分析。
9.2白虾甲基法呢烯酸酯(MF)在利用各浓度重组法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)蛋白质注射后表现型式
将诱导出的法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)重组蛋白质经纯化及复性后，以PBS稀释成0、1、10、25、50μg/g body weight，以1ml针筒(针头为”)由白虾背部肌肉注射。分别注射后在第3、6天，使用1ml针筒(针头为”)自白虾之血窦(sinuses)抽取血淋巴液进行HPLC分析。
9.3白虾甲基法呢烯酸酯(MF)在利用重组法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)蛋白质注射及眼柄移除后表现型式
为了了解所生产出的重组法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)蛋白质是否会影响白虾产生甲基法呢烯酸酯(MF)的含量，故以诱导出的法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)重组蛋白质经纯化及复性后，以PBS稀释成1μg/g body weight，由白虾背部肌肉注射；并以注射PBS之白虾作为对照组。在注射后第0、1、2、3、6天，分别抽取血淋巴液进行HPLC分析；实验所得的数据，以SAS(Statistic Analysis System)软件，运用单变量分析(One-way analysisof variance)，利用Duncan’s Multiple Range Test比较各因子间显着差异程度(p＜0.05)，所得数据以平均值±标准偏差(Mean±SD)表示。
结果如图20所示，注射重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)后第0、1、2、3、6天白虾体内之甲基法呢烯酸酯(MF)值分别为1.34、2.78、3.97、9.86、28.03ng/ml haemolymph；而对照组(注射PBS)白虾体内的甲基法呢烯酸酯(MF)值则为1.15ng/ml haemolymph。由此可知，在注射重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)第3天及第6天后，白虾体内的甲基法呢烯酸酯(MF)表现量相较于第0、1、2天及对照组(注射PBS)确有明显上升的现象，且具有显着差异(p＜0.05)。经注射重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)后，白虾体内的甲基法呢烯酸酯(MF)表现量会随着时间呈现上升的趋势。
为了了解所生产出的重组法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)蛋白质在不同浓度下是否皆会影响白虾产生甲基法呢烯酸酯(MF)的含量，故以诱导出的法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)重组蛋白质经纯化及复性后，以PBS稀释成0(对照组)、1、10、25、50μg/g body weight，由白虾背部肌肉注射。在注射后第3天及第6天，分别抽取血淋巴液进行HPLC分析。
结果如图21所示，注射重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)后第3天，各组白虾血淋巴中甲基法呢烯酸酯(MF)含量分别为0.98、8.65、24.68、31.96、45.72ng/ml haemolymph；注射后第6天时，各组甲基法呢烯酸酯(MF)值分别为1.73、27.17、10.41、0.48、1.55ng/ml haemolymph。由此可知，在注射重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)各浓度在第3天后，其甲基法呢烯酸酯(MF)表现量相较于对照组(注射PBS)有明显上升，且具有显着差异(p＜0.05)，且注射重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)浓度愈高，甲基法呢烯酸酯(MF)表现量也愈高。在第6天时，除了注射重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)1μg/g body weight组别的甲基法呢烯酸酯(MF)含量有上升趋势外，其余注射重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)组(10、25、50μg/gbody weight)，其白虾的甲基法呢烯酸酯(MF)含量皆下降，甚至与对照组无显着差异。
为了了解注射重组法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)蛋白质与剪眼柄之间对白虾甲基法呢烯酸酯(MF)含量的影响，故以诱导出的法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)重组蛋白质经纯化及复性后，以PBS稀释成1μg/g body weight，由白虾背部肌肉注射。将实验分成5组，分别为：
对照组1：未做任何处理；
对照组2：PBS注射组；
实验组1：重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)注射组；
实验组2：剪眼柄(ESA)组；以及
实验组3：剪眼柄+重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)注射组。剪眼柄步骤与6.1相同，以1ml针筒(针头为”)将重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)由白虾背部肌肉注射。分别注射后在第3、6天，使用1ml针筒(针头为”)自白虾之血窦(sinuses)抽取血淋巴液进行HPLC分析。
结果如图22所示，在第3天时，对照组1、对照组2、实验组1、实验组2、实验组3之白虾体内的甲基法呢烯酸酯(MF)值分别为1.12、0.98、8.65、11.5、32.03ng/ml haemolymph；而在第6天时，各组之甲基法呢烯酸酯(MF)值则分别为1.25、1.73、27.17、15.35、39.57ng/ml haemolymph。由此可知，在第3、6天，各实验组甲基法呢烯酸酯(MF)表现量相较于对照组1及对照组2有明显上升，且有显着差异性(p＜0.05)。在第3天时，以实验组3(剪眼柄+重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)注射组)白虾的甲基法呢烯酸酯(MF)含量最高，且具有差异显着(p＜0.05)，而实验组1(重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)注射组)及实验组2(剪眼柄组)之间无显着差异；在第6天时，也是以实验组3(剪眼柄+重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)注射组)白虾的甲基法呢烯酸酯(MF)含量最高，而实验组1(重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)注射组)比实验组2(剪眼柄组)的表现量高，且具有显着差异(p＜0.05)。每一实验组在第6天时，其白虾体内的甲基法呢烯酸酯(MF)含量皆高于第3天的含量。
实施例10 在利用重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)蛋白质注射后白虾卵巢成熟度表现型式
分别以0.85％生理食盐水、单边眼柄移除(unilateral eyestalkablation，uESA)、重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)以背部肌肉注射(1μg/body wt)50克之成虾后，在二周内检查白虾种虾卵巢成熟度。
结果如表三所示，在注射0.85％甲壳类生理食盐水组(对照组)，卵巢均未达成熟程度(Phase I~IV)。在单边眼柄移除(unilateral eyestalkablation，uESA)组在第一期成熟者18只种虾，卵巢成熟第二阶段者为14只，第三期为14只第四期成熟为5只。在注射重组法呢烯酸甲基转化酶组在第一期成熟者14只种虾，卵巢成熟第二阶段者为10只，第三期为10只，第四期成熟为4只。结果显示，若不剪眼柄种虾无法达到卵巢成熟(第III期)。注射重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)可促进南美白虾种虾卵巢成熟。其中图23A为白虾母虾各成熟期；图23B为白虾母虾卵巢中卵成熟期。
表三 经生理食盐水、单边眼柄移除(unilateral eyestalk ablation，uESA)、重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)注射处理后白虾种虾卵巢成熟度
第一阶段：未成熟期(immature stage)
第二阶段：发育期(developing stage)
第三阶段：成熟期(mature stage)
第四阶段：产卵期(spent stage)
经生理食盐水、单边眼柄移除(unilateral eyestalk ablation，uESA)、重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)注射处理后白虾种虾达到卵巢成熟第一期所需时间(表四)结果显示单边眼柄移除(unilateral eyestalkablation，uESA)所需时间为6.5天，重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)注射处理后白虾种虾达到卵巢成熟第一期所需时间约为6.6天。若不剪眼柄种虾无法达到卵巢成熟(第I期)。
表四、经生理食盐水、单边眼柄移除(unilateral eyestalk ablation，uESA)、重组法呢烯酸甲基转化酶(rFAMeT)注射处理后白虾种虾达到卵巢成熟第一期所需时间
组别 白虾种虾达到 卵巢成熟第一期所需时间0.85％生理食盐水 -单边眼柄移除 6.5±0.5注射重组法呢烯酸甲基转化酶(1μg/body wt) 6.6±0.7
由上述说明及实施例可知，前述之胜肽可取自天然的甲壳类动物尤其是水生对虾动物体中，或以现有分子生物学方法利用微生物制备重组法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)。白虾及草虾在剪眼柄后甲基法呢烯酸酯(MF)与法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)均增加其表现量，显示法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)与甲基法呢烯酸酯(MF)与卵巢成熟成正相关。在剪眼柄与注射重组法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)均可增加白虾及草虾的甲基法呢烯酸酯(MF)含量，并增加卵巢成熟度。法呢烯酸甲基转化酶(FAMeT)在不同动物的序列比对证实了本发明多肽和所试验的甲壳类动物均具有高度相似性；因此，本发明所提供的多肽，确实具有促进生殖成熟的功能。
本发明所提供的一种用以促进甲壳类动物生殖腺成熟、交配行为、产卵的多肽，与其它现有技术相互比较时，更具有下列的优点：
1.本发明的组合物或多肽，可促进甲壳类生殖成熟，因此可增加动物产卵，提升动物的子代生长表现，并能减少因剪眼柄所造成的生理伤害与副作用。
2.本发明的组合物或多肽还可使动物初次开始生殖产卵的时间提早，以及缩短甲壳类连续产卵的时间间隔。
上列详细说明系针对本发明之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为之等效实施或变更，均应包含于本案之专利范围中。
【序列表】
<110>洋升生物科技股份有限公司
<120>一种用以促进甲壳类动物生殖腺成熟、交配行为、产卵的胜肽
<160>12
<210>1
<211>280
<212>PRT
<213>南美白虾(Litopenaeus vannamei)
<300>
<308>Genbank/AAX24111
<309>2006-12-01
<400>1
Met Gly Asp Ser Trp Ala Ser Tyr Gly Thr Asp Glu Asn Lys Gln Tyr
1 5 10 15
Arg Phe Arg Asp Ile Lys Gly Lys Thr Leu Arg Phe Gln Val Lys Ala
20 25 30
Ala His Asp Ala His Ile Ala Leu Thr Ser Gly Glu Glu Glu Thr Asp
35 40 45
Pro Met Leu Glu Val Phe Ile Gly Gly Trp Glu Gly Ala Ala Ser Ala
50 55 60
Ile Arg Phe Lys Lys Ala Asp Asp Leu Ala Lys Val Asp Thr Pro Asp
65 70 75 80
Ile Leu Ser Glu Glu Glu Tyr Arg Glu Phe Trp Ile Ala Phe Asp His
85 90 95
Asp Val Val Arg Val Gly Lys Gly Ala Glu Trp Glu Pro Phe Met Ser
100 105 110
Ala Thr Ile Pro Glu Pro Phe Asp Ile Thr His Tyr Gly Tyr Ser Thr
115 120 125
Gly Trp Gly Ala Thr Gly Trp Trp Gln Phe His Ser Glu Ile His Phe
130 135 140
Gln Thr Glu Asp Cys Leu Thr Tyr Asn Phe Ile Pro Val Tyr Gly Asp
145 150 155 160
Thr Phe Ser Phe Arg Val Ala Cys Ser Asn Asp Ala His Leu Ala Leu
165 170 175
Thr Ser Gly Pro Glu Glu Thr Ser Pro Met Tyr Glu Val Phe Ile Gly
180 185 190
Gly Trp Glu Asn Gln His Ser Ala Ile Arg Leu Ser Lys Glu Gly Arg
195 200 205
Gly Ser Gly Glu Asp Met Ile Lys Val Asp Thr Pro Asp Val Val Cys
210 215 220
Cys Glu Glu Glu Arg Lys Phe Tyr Ile Ser Phe Lys Asp Gly His Ile
225 230 235 240
Arg Val Gly Tyr Gln Asp Ser Asp Pro Phe Met Glu Trp Thr Asp Pro
245 250 255
Glu Pro Trp Lys Ile Thr His Ile Gly Tyr Cys Thr Gly Trp Gly Ala
260 265 270
Ser Gly Lys Trp Lys Phe Glu Phe
275 280
<210>2
<211>280
<212>PRT
<213>草虾(Penaeus monodon)
<300>
<308>Genbank/AAX24112
<309>2006-12-01
<400>2
Met Gly Asp Ser Trp Ala Ser Tyr Gly Thr Asp Glu Asn Lys Gln Tyr
1 5 10 15
Arg Phe Arg Asp Ile Lys Gly Lys Thr Leu Arg Phe Gln Val Lys Ala
20 25 30
Ala His Asp Ala His Leu Ala Leu Thr Ser Gly Glu Glu Glu Thr Asp
35 40 45
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50 55 60
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85 90 95
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
Thr Ser Gly Pro Glu Glu Thr Thr Pro Met Tyr Glu Val Phe Ile Gly
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Cys Glu Glu Glu Arg Lys Phe Tyr Val Ser Phe Lys Asp Gly His Ile
225 230 235 240
Arg Val Gly Tyr Gln Asp Ser Asp Pro Phe Met Glu Trp Thr Asp Pro
245 250 255
Glu Pro Trp Lys Ile Thr His Ile Gly Tyr Cys Thr Gly Trp Gly Ala
260 265 270
Thr Gly Lys Trp Lys Phe Glu Phe
275 280
<210>3
<211>1221
<212>DNA
<213>南美白虾(Litopenaeus vannamei)
<220>
<221>CDS
<222>(10)...(849)
<300>
<308>Genbank/AY823408
<309>2006-12-01
<400>3
taactcaaga tgggcgatag ctgggcttcc tacggtaccg atgagaacaa gcagtaccgc 60
ttcagggaca tcaagggcaa gaccctccgc ttccaggtga aggctgccca tgatgcccac 120
attgccctga cctccgggga ggaggagact gaccctatgc ttgaggtgtt cattggcgga 180
tgggagggcg ctgcctcggc catcaggttc aagaaagctg atgacttggc caaagtggac 240
accccagaca tcctaagtga agaagaatat cgtgaattct ggattgcctt tgaccatgat 300
gttgtccgtg ttggcaaggg tgctgagtgg gagccattca tgagtgccac cattccagag 360
cctttcgaca tcactcatta tggctacagt actggctggg gtgctactgg ctggtggcag 420
ttccatagtg agatccactt ccagactgag gactgcctca catacaactt cattcctgtg 480
tatggtgaca ccttttcctt cagagttgct tgtagcaatg atgcccatct agcactcacc 540
tccggcccag aggagacctc tccaatgtat gaagtgttca ttggtgggtg ggaaaaccag 600
cactctgcca ttcgtctcag caaggaggga aggggatctg gtgaggacat gatcaaggtc 660
gacacccctg atgtggtctg ctgtgaagag gagaggaagt tctacatctc cttcaaggat 720
ggccatatta gggtgggata ccaggacagc gatcccttca tggagtggac ggaccctgag 780
ccatggaaga ttacccacat tggctactgc acaggttggg gagcaagtgg aaagtggaag 840
ttcgaattct aagtcctact ttgtggcttt cttcacggaa tgcagtcatt ggcgtgaagt 900
caacaacccc aatttttttt ctttcttttt ttctttcttt tttattatat tttctcttag 960
gacacaaggt tttacatgtt tttggaatat ctttttcgac atgatgtata tcagttttgc 1020
atttattaac cttcaaaaat aatagcaatt taaaagtgca aagtgcatag attaatatgg 1080
gctaccagaa gtacgctcat tatttttgga agcaaatatt gaattaatga tattattgta 1140
acagacttgt tcagaacaaa tgtatcatga tgattattca aattaataaa cattaaacaa 1200
ataaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1221
<210>4
<211>1413
<212>DNA
<213>南美白虾(Litopenaeus vannamei)
<220>
<221>CDS
<222>(10)...(426)
<221>CDS
<222>(615)...(1036)
<400>4
taactcaaga tgggcgatag ctgggcttcc tacggtaccg atgagaacaa gcagtaccgc 60
ttcagggaca tcaagggcaa gaccctccgc ttccaggtga aggctgccca tgatgcccac 120
attgccctga cctccgggga ggaggagact gaccctatgc ttgaggtgtt cattggcgga 180
tgggagggcg ctgcctcggc catcaggttc aagaaagctg atgacttggc caaagtggac 240
accccagaca tcctaagtga agaagaatat cgtgaattct ggattgcctt tgaccatgat 300
gttgtccgtg ttggcaaggg tgctgagtgg gagccattca tgagtgccac cattccagag 360
cctttcgaca tcactcatta tggctacagt actggctggg gtgctactgg ctggtggcag 420
ttcatagtaa ggatgtattt tagttttacc cttatccacc ataaatagtt ttatgcttat 480
ccactataaa agtcccctta aaaataaaat atgttcaaag tcatgtgtgt ggggagggtg 540
atcagtattt gagtttatgc ataaagaatg attgggttat tcctcatata caaaacttgt 600
tttattcaca ccaggtgaga tccacttcca gactgaggac tgcctcacat acaacttcat 660
tcctgtgtat ggtgacacct tttccttcag agttgcttgt agcaatgatg cccatctagc 720
actcacctcc ggcccagagg agacctctcc aatgtatgaa gtgttcattg gtgggtggga 780
aaaccagcac tctgccattc gtctcagcaa ggagggaagg ggatctggtg aggacatgat 840
caaggtcgac acccctgatg tggtctgctg tgaagaggag aggaagttct acatctcctt 900
caaggatggc catattaggg tgggatacca ggacagcgat cccttcatgg agtggacgga 960
ccctgagcca tggaagatta cccacattgg ctactgcaca ggttggggag caagtggaaa 1020
gtggaagttc gaattctaag tcctactttg tggctttctt cacggaatgc agtcattggc 1080
gtgaagtcaa caaccccaat tttttttctt tctttttttc tttctttttt attatatttt 1140
ctcttaggac acaaggtttt acatgttttt ggaatatctt tttcgacatg atgtatatca 1200
gttttgcatt tattaacctt caaaaataat agcaatttaa aagtgcaaag tgcatagatt 1260
aatatgggct accagaagta cgctcattat ttttggaagc aaatattgaa ttaatgatat 1320
tattgtaaca gacttgttca gaacaaatgt atcatgatga ttattcaaat taataaacat 1380
taaacaaata aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1413
<210>5
<211>910
<212>DNA
<213>草虾(Penaeus monodon)
<220>
<221>CDS
<222>(52)...(891)
<300>
<308>Genbank/AY823409
<309>2006-12-01
<400>5
caaagaattc ggcacgaggc tcgattgtcc tctgctcgca agtaactcaa gatgggcgat 60
agctgggctt cctacggtac cgatgagaac aagcagtacc gcttcaggga catcaagggc 120
aagaccctcc ggttccaggt gaaggctgcc catgatgccc accttgccct gacctcaggg 180
gaggaggaga ctgaccctat gctggaggtg ttcattggcg gatgggaagg cgctgcctct 240
gccattaggt tcaagaaagc tgatgactta actaaagtgg acacccctga catcctgagt 300
gaagaagaat atcgtgaatt ctgggttgcc ttcgaccatg atgttatccg tgttggcaag 360
ggaggcgagt gggagccatt catgagtgcc accattccag agcctttcga catcactcat 420
tacggctaca gtactggctg gggtgctgtt ggctggtggc agttccatag tgaggtgcac 480
ttccaaactg aggactgcct cacgtacaac ttcattcctg tgtacggtga cacctttacc 540
ttcagtgttg cctgtagcaa tgatgcccat ctggcactca cctctggccc tgaggagacc 600
acacccatgt atgaagtgtt cattggtggt tgggaaaacc agcactctgc cattcgtctc 660
agcaaggagg gaaggggatc tggcgaggac atgatcaagg tcgacacccc cgacgttgtc 720
tgctgcgaag aggagaggaa gttctacgtc agcttcaagg acggccatat cagggtggga 780
taccaggaca gtgatccctt catggagtgg actgaccctg agccatggaa gatcacccac 840
attggttact gcacaggctg gggagcaact ggaaagtgga agttcgaatt ttaagtcctg 900
ctttgtggct 910
<210>6
<211>1082
<212>DNA
<213>草虾(Penaeus monodon)
<220>
<221>CDS
<222>(52)...(469)
<221>CDS
<222>(642)...(1063)
<400>6
caaagaattc ggcacgaggc tcgattgtcc tctgctcgca agtaactcaa gatgggcgat 60
agctgggctt cctacggtac cgatgagaac aagcagtacc gcttcaggga catcaagggc 120
aagaccctcc ggttccaggt gaaggctgcc catgatgccc accttgccct gacctcaggg 180
gaggaggaga ctgaccctat gctggaggtg ttcattggcg gatgggaagg cgctgcctct 240
gccattaggt tcaagaaagc tgatgactta actaaagtgg acacccctga catcctgagt 300
gaagaagaat atcgtgaatt ctgggttgcc ttcgaccatg atgttatccg tgttggcaag 360
ggaggcgagt gggagccatt catgagtgcc accattccag agcctttcga catcactcat 420
tacggctaca gtactggctg gggtgctgtt ggctggtggc agttccatag taaggatgta 480
ttttagctta tatgcttatt caccttaaaa gttctcttga aaggaaaata tgttcaaatt 540
cttgtatgta tgtagggggg gagggggttg agtttcgagt ttatgtataa agagattaat 600
taggccattc ctatactcaa gacttgtttt attcactcca ggtgaggtgc acttccaaac 660
tgaggactgc ctcacgtaca acttcattcc tgtgtacggt gacaccttta ccttcagtgt 720
tgcctgtagc aatgatgccc atctggcact cacctctggc cctgaggaga ccacacccat 780
gtatgaagtg ttcattggtg gttgggaaaa ccagcactct gccattcgtc tcagcaagga 840
gggaagggga tctggcgagg acatgatcaa ggtcgacacc cccgacgttg tctgctgcga 900
agaggagagg aagttctacg tcagcttcaa ggacggccat atcagggtgg gataccagga 960
cagtgatccc ttcatggagt ggactgaccc tgagccatgg aagatcaccc acattggtta 1020
ctgcacaggc tggggagcaa ctggaaagtg gaagttcgaa ttttaagtcc tgctttgtgg 1080
ct 1082
<210>7
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引子
<400>7
GGTACTGAYG AGAACAAGG 19
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引子
<400>8
CTGTCCACTC CATRAAGGGG T 21
<210>9
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引子
<400>9
GAATTCTGGG TTGCCTTCG 19
<210>10
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引子
<400>10
GTCACCGTAC ACAGGAATG 19
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引子
<400>11
CATATGGGCG ATAGCTGGGC T 21
<210>12
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引子
<400>12
CTCGAGGAAT TCGAACTTCC ACTT 24