用于初免加强疫苗的水疱性口炎病毒.pdf

本发明涉及水疱性口炎病毒(VSV)基质(M)蛋白突变体。一种突变体M蛋白，包括在位置（21）变为谷氨酸的甘氨酸，在位置（111）变为苯丙氨酸的亮氨酸和在位置（51）变为精氨酸的甲硫氨酸。另一种M蛋白突变体，包括在位置（22）变为谷氨酸的甘氨酸和在位置（48）和（51）变为精氨酸的甲硫氨酸。又一种VSVM蛋白突变体，包括在位置（22）变为谷氨酸的甘氨酸，在位置（110）变为苯丙氨酸的亮氨酸和在位置（48）和（51）变为精氨酸的甲硫氨酸。本发明还指向具有这些M突变体的重组VSVs(rVSV)和基于具有本发明的M突变体的rVSV的疫苗。这些具有突变体M的新型rVSVs被显著减毒并丧失了毒性，包括神经毒性，且能够诱导针对目标抗原的免疫应答。此外，具有第一种描述的M突变体的rVSV印第安纳血清型在31℃下能够有效复制，且在约37℃或更高时复制能力差或不能复制。

权利要求书
1.  一种水疱性口炎病毒(VSV)的改性的基质(M)蛋白，其特征在于该改性的M蛋白包含选自由下述组成的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO：3，其至少包括下述取代物：G21E/L111F/M51R；和(ii) SEQ ID NO：8，其至少包括下述取代物：G22E/M48R+M51R。

2.  权利要求1的改性的M蛋白，其特征在于SEQ ID NO:8进一步包括以下取代物：L110F。

3.  权利要求1的改性的M蛋白，其特征在于所述改性的M蛋白包含选自由下述组成的氨基酸序列：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。

4.  一种重组VSV (rVSV)，其特征在于所述rVSV包含改性的基质(M)蛋白，该改性的M蛋白包含选自由下述组成的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO：3，其至少包括下述取代物：G21E/L111F/M51R；和(ii) SEQ ID NO：8，其至少包括下述取代物：G22E/M48R+M51R。

5.  权利要求4的rVSV，其特征在于该rVSV是表达外源病原体的蛋白的嵌合rVSV，且其中所述嵌合rVSV能够针对所述蛋白诱导免疫应答。

6.  权利要求5的rVSV，其特征在于所述病原体是病毒、真菌、细菌或寄生虫病原体。

7.  权利要求4的rVSV，其特征在于该rVSV基本上是非细胞溶解的和无致病性的。

8.  权利要求4的rVSV，其特征在于所述rVSV是重组水疱性口炎病毒印第安纳血清型(rVSVInd)，且其中改性的M蛋白包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，该SEQ ID NO：3至少包括下述取代物：G21E/L111F/M51R。

9.  权利要求8的rVSV，其特征在于该改性的M蛋白包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。

10.  权利要求8的rVSV，其特征在于该改性的M蛋白由包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列的基因编码。

11.  根据权利要求8-10任一项的rVSV，其特征在于该rVSVInd能够在允许的温度下产生VSVInd颗粒，且不能在非允许的温度下产生颗粒。

12.  权利要求4的rVSV，其特征在于所述rVSV是重组水疱性口炎病毒新泽西血清型(rVSVNJ)，且其中改性的M蛋白包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，该SEQ ID NO：8至少包括下述取代物：G22E/M48R+M51R。

13.  权利要求12的rVSV，其特征在于改性的M蛋白由具有SEQ ID NO：6的核苷酸序列的基因编码。

14.  权利要求12的rVSV，其特征在于改性的M蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：9。

15.  权利要求12的rVSV，其特征在于改性的M蛋白进一步包括以下取代物：L110F。

16.  权利要求15的rVSV，其特征在于改性的M蛋白由具有SEQ ID NO：7的核苷酸序列的基因编码。

17.  权利要求15的rVSV，其特征在于改性的M蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：10。

18.  一种疫苗，其特征在于该疫苗包含有效量的一种或多种减毒rVSVs，该一种或多种减毒rVSVs包括改性的基质(M)蛋白，该改性的M蛋白包含选自由下述组成的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO：3，其至少包括下述取代物：G21E/L111F/M51R；和(ii) SEQ ID NO：8，其至少包括下述取代物：G22E/M48R+M51R。

19.  权利要求18的疫苗，其特征在于所述rVSV是重组水疱性口炎病毒印第安纳血清型(rVSVInd)，且其中改性的M蛋白包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，该SEQ ID NO：3至少包括下述取代物：G21E/L111F/M51R。

20.  权利要求19的疫苗，其特征在于改性的M蛋白包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。

21.  权利要求19的疫苗，其特征在于改性的M蛋白由包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列的基因编码。

22.  权利要求19-20任一项的疫苗，其特征在于该rVSVInd能够在允许的温度下产生VSVInd颗粒，且不能在非允许的温度下产生颗粒。

23.  权利要求18的疫苗，其特征在于所述rVSV是重组水疱性口炎病毒新泽西血清型(rVSVNJ)，且其中改性的M蛋白包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，该SEQ ID NO：8至少包括下述取代物：G22E/M48R+M51R。

24.  权利要求23的疫苗，其特征在于改性的M蛋白由具有SEQ ID NO：6的核苷酸序列的基因编码。

25.  权利要求23的疫苗，其特征在于改性的M蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：9。

26.  权利要求23的疫苗，其特征在于改性的M蛋白进一步包括以下取代物：L110F。

27.  权利要求26的疫苗，其特征在于改性的M蛋白由具有SEQ ID NO：7的核苷酸序列的基因编码。

28.  权利要求26的疫苗，其特征在于改性的M蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：10。

29.  权利要求18-28任一项的疫苗，其特征在于rVSV是表达外源病原体的蛋白的嵌合rVSV，且其中所述嵌合rVSV能够针对所述蛋白诱导免疫应答。

30.  权利要求29的疫苗，其特征在于疫苗包含减毒嵌合rVSVs的混合物，其中混合物中的至少两种嵌合rVSVs表达外源病原体的不同蛋白。

31.  权利要求29的疫苗，其特征在于病原体是病毒、真菌、细菌或寄生虫病原体。

32.  权利要求29的疫苗，其特征在于病原体是慢病毒。

33.  根据权利要求33的疫苗，其特征在于慢病毒是HIV且表位是HIV蛋白。

34.  权利要求29的疫苗，其特征在于病原体是HCV且表位是HCV蛋白。

35.  权利要求18-34任一项的疫苗，其特征在于所述疫苗能够诱导体液、细胞和粘膜免疫应答。

36.  权利要求18-35任一项的疫苗，其特征在于所述疫苗进一步包括佐剂。

37.  一种在受试者中诱导免疫应答的方法，其特征在于该方法包含对受试者施用：(a)有效量的包含一种血清型的减毒rVSV的一种疫苗，该一种血清型的减毒rVSV具有第一改性的M蛋白，该第一改性的M蛋白包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，该SEQ ID NO：3至少包括下述取代物：G21E/L111F/M51R；和(b)有效量的包含另一种血清型的减毒rVSV的另一种疫苗，该另一种血清型的减毒rVSV具有第二改性的M蛋白，该第二改性的M蛋白包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，该SEQ ID NO：8至少包括下述取代物：G22E/M48R+M51R。

38.  权利要求37的方法，其特征在于第二M蛋白进一步包括以下取代物：L110F。

39.  权利要求37的方法，其特征在于在对患者施用(b)前对受试者施用(a)。

40.  权利要求39的方法，其特征在于在诱导过程中对受试者施用(b) 多于一次。

41.  权利要求37的方法，其特征在于对受试者施用(a)和在施用(a)后约第3周、第8周和第16周时对受试者施用(b)。

42.  权利要求37的方法，其特征在于在对受试者施用(a)前对受试者施用(b)。

43.  权利要求42的方法，其特征在于在诱导过程中对受试者施用(a) 多于一次。

44.  权利要求42的方法，其特征在于对受试者施用(b)且在施用(b)后约第3周、第8周和第16周时对受试者施用(a)。

45.  权利要求37的方法，其特征在于该两种rVSVs是表达外源病原体的蛋白的嵌合rVSV，且其中该两种rVSVs能够针对蛋白诱导免疫应答。

46.  权利要求45的方法，其特征在于病原体是病毒、真菌、细菌或寄生虫病原体。

47.  权利要求45的方法，其特征在于病原体是慢病毒。

48.  根据权利要求37的方法，其特征在于慢病毒是HIV且蛋白是HIV蛋白。

49.  权利要求48的方法，其特征在于一种血清型的rVSV和另一种血清型的rVSV包括表面糖蛋白(G)基因和RNA依赖的RNA聚合酶(L)基因，且其中用于表达HIV蛋白的基因是插入G基因和L基因之间的HIV基因。

50.  权利要求49的方法，其特征在于HIV基因选自由gag、env和pol组成的一组HIV基因。

51.  权利要求45的方法，其特征在于病原体是HCV且蛋白是HCV蛋白。

52.  权利要求51的方法，其特征在于一种血清型的rVSV和另一种血清型的rVSV包括表面糖蛋白(G)基因和RNA依赖的RNA聚合酶(L)基因，且其中用于表达HCV蛋白的基因被插入rVSV的G基因和L基因之间。

53.  权利要求45的方法，其特征在于该两种疫苗包含减毒嵌合rVSVs的混合物，其中混合物中的至少两种减毒嵌合rVSVs表达病原体的不同蛋白。

54.  权利要求37-53任一项的方法，其特征在于两种疫苗(a)和(b)的每一种都诱导体液、细胞和粘膜免疫应答。

55.  权利要求37-54任一项的方法，其特征在于疫苗(a)的一种血清型是印第安纳且疫苗(b)的另一种血清型是新泽西。

56.  权利要求37-54任一项的方法，其特征在于疫苗(a)和疫苗(b)的每一种进一步包含佐剂。

57.  一种初免-加强联合疫苗，其特征在于该初免-加强联合疫苗包含：(a)有效量的包含一种血清型的减毒rVSV的疫苗，该一种血清型的减毒rVSV具有包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的第一改性的M蛋白；和(b)有效量的包含另一种血清型的rVSV的疫苗，该另一种血清型的rVSV具有包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列的第二改性的M蛋白。

58.  权利要求57的初免-加强联合疫苗，其特征在于第二M蛋白进一步包括以下取代物：L110F。

59.  权利要求57的初免-加强联合疫苗，其特征在于(a)是初免疫苗且(b)是加强疫苗。

60.  权利要求57的初免-加强联合疫苗，其特征在于(b)是初免疫苗且(a)是加强疫苗。

61.  权利要求57的初免-加强联合疫苗，其特征在于该两种减毒rVSVs是表达外源病原体的蛋白的嵌合rVSV，且其中该两种嵌合rVSVs能够针对蛋白诱导免疫应答。

62.  权利要求61的初免-加强联合疫苗，其特征在于病原体是病毒、真菌、细菌或寄生虫病原体。

63.  权利要求61的初免-加强联合疫苗，其特征在于病原体是慢病毒。

64.  权利要求63的初免-加强联合疫苗，其特征在于慢病毒是HIV且蛋白是HIV蛋白。

65.  权利要求64的初免-加强联合疫苗，其特征在于一种血清型的rVSV和另一种血清型的rVSV包括表面糖蛋白(G)基因和RNA依赖的RNA聚合酶(L)基因，且其中用于表达HIV蛋白的基因被插入G基因和L基因之间。

66.   权利要求65的初免-加强联合疫苗，其特征在于HIV基因选自由env、gag和pol组成的一组HIV基因。

67.  权利要求61的初免-加强联合疫苗，其特征在于病原体是HCV且表位是HCV蛋白。

68.  权利要求67的初免-加强联合疫苗，其特征在于一种血清型的rVSV和另一种血清型的rVSV包括表面糖蛋白(G)基因和RNA依赖的RNA聚合酶(L)基因，且其中用于表达HCV蛋白的基因被插入G基因和L基因之间。

69.  权利要求67的初免-加强联合疫苗，其特征在于该HCV蛋白是结构或非结构的HCV蛋白。

70.  权利要求61-69任一项的初免-加强联合疫苗，其特征在于两种疫苗的每一种都包含减毒嵌合rVSVs的混合物，且其中混合物中的至少两种减毒嵌合rVSVs具有病原体的不同蛋白。

71.  权利要求57-70任一项的初免-加强联合疫苗，其特征在于两种疫苗的每一种都能够诱导体液、细胞和粘膜免疫应答。

72.   权利要求57-71任一项的初免-加强联合疫苗，其特征在于疫苗(a)的血清型是印第安纳且疫苗(b)的血清型是新泽西。

73.  权利要求57-72任一项的初免-加强联合疫苗，其特征在于疫苗(a)和疫苗(b)的每一种进一步包含佐剂。

74.  一种试剂盒，包含：(a)至少一种剂量的有效量的包含rVSVInd的疫苗，该rVSVInd具有包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的改性的M蛋白，和(b)至少一种剂量的有效量的包含rVSVNJ的疫苗，该rVSVNJ具有包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列的改性的M蛋白。

75.  权利要求62的试剂盒，其特征在于(a)和(b)配制于一种药学可接受的载体中。

76.  一种分离的肽，其包含选自如SEQ ID NOs：4、9和10列出的氨基酸序列的组的氨基酸序列。

77.  一种用于编码权利要求76的分离的肽的分离的核苷酸序列。

说明书用于初免-加强疫苗的水疱性口炎病毒
发明领域
本发明整体涉及生物技术和免疫学。特别的，本发明涉及水疱性口炎病毒(VSV)的新型基质(M)蛋白，涉及表达新型M蛋白的减毒重组VSVs，并涉及基于VSV的初免-加强疫苗，该初免-加强疫苗针对由具有外源基因的重组VSV表达的外源抗原的长期体液、细胞介导的和粘膜诱导免疫应答。
发明背景
水疱性口炎病毒(VSV) 是一种负链RNA病毒，其感染大部分哺乳动物细胞并在受感染细胞中表达高达总蛋白60%的病毒蛋白[Kim，G.N.和C.Y. Kang. Virology 357:41，2007]。在自然界中，VSV感染猪、牛和马，并在口和足附近导致水痘性疾病。虽然已有报道人感染VSV，但是VSV在人类中没有导致任何严重的症状 [Fields，B. N.和K.Hawkins. N Engl J Med 277:989，1967；Johnson，K.M.等人，Am J Trop Med Hyg 15:244，1966]。
VSV编码5种蛋白，核壳蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、表面糖蛋白（G）和RNA依赖性RNA聚合酶（L）。VSV的N、P和L蛋白正义和反义基因组RNA和mRNA的合成所必需的，后者是VSV蛋白合成需要的。
由VSV基质(M)蛋白阻断宿主细胞蛋白合成会诱导细胞死亡。将水疱性口炎病毒印第安纳(Indiana)血清型(VSVInd)中的M蛋白第51位的甲硫氨酸残基改变为精氨酸(M51R)，并将水疱性口炎病毒新泽西(New Jersey)血清型(VSVNJ) M基因中的第48位(Met48)和51位的(Met51)甲硫氨酸改变为精氨酸能够使得VSV M蛋白的这一功能失效 (Kim，G和Kang，C.，Virology，357:41-53，2007)。虽然在M蛋白中具有这些Met至Arg突变的VSV已经显著降低了细胞病变效应，但是它们还是在细胞中复制和生产后代病毒并感染动物。VSVInd奥赛(Orsay)毒株的一个温度敏感(ts)M基因突变体，tsO23，已在37oC和39oC下的小鼠胶质细胞系中表现出受限的复制(Rabinowitz，S.等人，Infection and Immunityy 33:120-125，1981)。已证实tsO23的温度敏感性是39oC下以子弹形结构为特征的病毒组装启动不正确或缺失的结果(Flood，E.等人，Virology 278:520-533，2000；Lyles，D.等人，Virology，217:76–87，1996)。此外，即使在直接接种到脑部以后，tsO23在小鼠中还是丧失了其神经毒性 (Rabinowitz，S.等人，Infection and Immunity，33:120-125，1981)。
VSV奥赛毒株的野生型M和tsO23的M之间存在着三个氨基酸的不同，其是在第21个氨基酸的甘氨酸(G)至谷氨酸(E) (G21E)，在第111个氨基酸的亮氨酸(L)至苯丙氨酸(F) (L111F)，和在第227个氨基酸的组氨酸(H)至酪氨酸(Y) (H227Y) (Morita，K.等人，J. Virol. 61:256-263，1987)。在回复子中F111的单氨基酸回复至L显示F111看起来在tsO23的温度敏感性中起主要作用。然而，另两个突变也可能具有一些作用，因为在111位由F至L的单回复没有将病毒完全恢复至其野生型表型(Morita，K.等人，J. Virol. 61:256-263，1987；Li，Y.等人，J. Virol. 62:3729-3737，1988)。
目前，研究组已开发了能够复制的、组装缺陷的VSV，其具有G糖蛋白(G)基因缺失(ΔG)或G和M基因同时缺失(ΔMG)作为更安全的疫苗载体(Kahn，J.等人，J. Virol. 75:11079-11087，2001；Schwartz，J.等人，Virology 366:166-73，2007)。然而，具有G基因缺失或G和M基因缺失，VSV载体需要提供反式(in trans) G或M和G蛋白用于生产组装缺陷VSV。为了降低生产疫苗的成本，需要产生能够生产可以以高滴度复制的病毒疫苗载体的系统。因此，所需要的是全长VSV载体系统，其已经丧失了它的毒性（无致病性），且仍然能够在31oC下体外复制至高滴度，在非允许的温度下不能正确组装，并针对其表达的目标基因诱导良好的免疫应答。
本发明进一步和其它目标将根据下述发明概述、发明讨论和实施方式及其实施例实现。
发明概述
      发明人已经产生了水疱性口炎病毒(VSV)的新的基质(M)蛋白突变体，包括VSV印第安纳血清型(VSVInd)和VSV新泽西血清型(VSVNJ)。这些具有突变体M蛋白的新的VSVs基本上是非细胞溶解的、显著减毒的和无致病性的，包括神经毒性(更安全)。进一步的，这些具有突变体M蛋白的新的VSVs能够针对目标抗原或表位诱导免疫应答。免疫应答可以是体液的、细胞的和粘膜的免疫应答。此外，具有M突变体的VSVInd可以在31oC下组装并从受感染的细胞中释放，但是它们在37oC或更高温度下不能正确组装，且病毒从受感染细胞中的释放较之野生型VSVInd而言显著降低了约1000或10,000倍。
据此，在一个实施方式中，本申请涉及水疱性口炎病毒(VSV)的改性的基质(M)蛋白。在一个实施方式中，改性的M蛋白包含选自由下述组成的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO：3，其至少包括下述取代物：G21E/L111F/M51R；和(ii) SEQ ID NO：8，其至少包括下述取代物：G22E/M48R+M51R。在本发明的一个方面，本发明的改性的M蛋白包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，该SEQ ID NO:8至少包括下述取代物：G22E/L110F/M48R+M51R。
在本发明的改性的M蛋白的另一个实施方式中，改性的M蛋白包含选自由下述组成的氨基酸序列：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。
在另一个实施方式中，本申请提供了一种重组VSV (rVSV)。在一个实施方式中，该rVSV包含改性的基质(M)蛋白，该改性的M蛋白包含选自由下述组成的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO：3，其至少包括下述取代物：G21E/L111F/M51R；和(ii) SEQ ID NO：8，其至少包括下述取代物：G22E/M48R+M51R。
在本发明的一个实施方式中，rVSV是一种表达外源病原体的蛋白的嵌合rVSV，且其中所述嵌合rVSV能够针对所述蛋白的诱导免疫应答。
在本发明rVSV的另一个实施方式中，病原体是病毒、真菌、细菌或寄生虫病原体。
在本发明rVSV的另一个实施方式中，rVSV基本上是非细胞溶解的和无致病性的。
在本发明的一个实施方式中，rVSV是一种重组水疱性口炎病毒印第安纳血清型(rVSVInd)，且改性的M蛋白包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，该SEQ ID NO：3至少包括下述取代物：G21E/L111F/M51R。
在本发明的rVSVInd的另一个实施方式中，改性的M蛋白包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
在本发明的rVSVInd的另一个实施方式中，改性的M蛋白由包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列的基因编码。
在本发明rVSV的另一个实施方式中，前述任一实施方式的rVSVInd能够在允许的温度下产生VSVInd颗粒，且不能在非允许的温度下产生颗粒。
在本发明的另一个实施方式中，rVSV是一种重组水疱性口炎病毒新泽西血清型(rVSVNJ)，且改性的M蛋白包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，该SEQ ID NO：8至少包括下述取代物：G22E/M48R+M51R。
在本发明的rVSVNJ的另一个实施方式中，改性的M蛋白由具有SEQ ID NO：6的核苷酸序列的基因编码。
在本发明的rVSVNJ的另一个实施方式中，改性的M蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：9。
在本发明的rVSVNJ的另一个实施方式中，改性的M蛋白包括以下取代物：G22E/L110F/M48R+M51R。
在本发明的rVSVNJ的另一个实施方式中，改性的M蛋白由具有SEQ ID NO：7的核苷酸序列的基因编码。
在本发明的rVSVNJ的另一个实施方式中，改性的M蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：10。
在一个实施方式中，本发明提供了一种疫苗。在一个实施方式中，本发明的疫苗包含有效量的一种或多种减毒rVSVs，该一种或多种减毒rVSVs包括改性的基质(M)蛋白，该改性的M蛋白包含选自由下述组成的氨基酸序列：(i) SEQ ID NO：3，其至少包括下述取代物：G21E/L111F/M51R；和(ii) SEQ ID NO：8，其至少包括下述取代物：G22E/M48R+M51R。
在本发明的疫苗的另一个实施方式中，rVSV是一种重组水疱性口炎病毒印第安纳血清型(rVSVInd)，且改性的M蛋白包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，该SEQ ID NO：3至少包括下述取代物：G21E/L111F/M51R。
在本发明的疫苗的另一个实施方式中，rVSVInd的改性的M蛋白包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
在本发明的疫苗的另一个实施方式中，rVSVInd的改性的M蛋白由包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列的基因编码。
在本发明的疫苗的另一个实施方式中，该rVSVInd能够在允许的温度下产生VSVInd颗粒，且不能在非允许的温度下产生颗粒。
在之前发明的疫苗的另一个实施方式中，rVSV是一种重组水疱性口炎病毒新泽西血清型(rVSVNJ)，且改性的M蛋白包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，该SEQ ID NO：8至少包括下述取代物：G22E/M48R+M51R。
在本发明的疫苗的另一个实施方式中，rVSV是rVSVNJ且改性的M蛋白由具有SEQ ID NO：6的核苷酸序列的基因编码。
在本发明的疫苗的另一个实施方式中，rVSV是rVSVNJ且改性的M蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：9。
在本发明的疫苗的另一个实施方式中，rVSV是rVSVNJ且改性的M蛋白包括以下取代物：G22E/L110F/M48R+M51R。
在本发明的疫苗的另一个实施方式中，rVSV是rVSVNJ且改性的M蛋白由具有SEQ ID NO：7的核苷酸序列的基因编码。
在本发明的疫苗的另一个实施方式中，rVSV是rVSVNJ且改性的M蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：10。
在本发明的疫苗的另一个实施方式中，根据前述任一实施方式的rVSV是一种表达外源病原体的蛋白的嵌合rVSV，且该嵌合rVSV能够针对所述蛋白诱导免疫应答。
在本发明的疫苗的另一个实施方式中，rVSV包含减毒嵌合rVSVs的混合物，其中混合物中的至少两种嵌合rVSVs表达外源病原体的不同蛋白。
在本发明的疫苗的另一个实施方式中，病原体是病毒、真菌、细菌或寄生虫病原体。
在本发明的疫苗的另一个实施方式中，病原体是慢病毒。
在本发明的疫苗的另一个实施方式中，慢病毒是HIV且表位是HIV蛋白。
在本发明的另一个实施方式中，病原体是HCV且表位是HCV蛋白。
在本发明的一个实施方式中，前述任一实施方式的疫苗能够诱导体液、细胞和粘膜免疫应答。
在本发明的另一个实施方式中，根据前述任一实施方式的疫苗进一步包括佐剂。
在一个实施方式中，本发明提供了一种在受试者中诱导免疫应答的方法。在本发明的一个实施方式中，该方法包括对受试者施用：(a)有效量的包含一种血清型的减毒rVSV的疫苗，该一种血清型的减毒rVSV具有第一改性的M蛋白，该第一改性的M蛋白包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，该SEQ ID NO：3至少包括下述取代物：G21E/L111F/M51R；和(b)有效量的包含另一种血清型的减毒rVSV的另一种疫苗，该另一种血清型的减毒rVSV具有第二改性的M蛋白，该第二改性的M蛋白包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，该SEQ ID NO：8至少包括下述取代物：G22E/M48R+M51R。在本发明的一个方面，该第二改性的M蛋白包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，该SEQ ID NO:8至少包括下述取代物：G22E/L110F/M48R+M51R。
在本发明方法的另一个实施方式中，在对患者施用(b)前对受试者施用(a)。
在本发明方法的另一个实施方式中，在诱导过程中对受试者施用(b) 多于一次。
在本发明方法的另一个实施方式中，对受试者施用(a)且在施用(a)后约第3周、第8周和第16周时对受试者施用(b)。
在本发明方法的另一个实施方式中，在对受试者施用(a)前对受试者施用(b)。
在本发明方法的另一个实施方式中，在诱导过程中对受试者施用(a) 多于一次。
在本发明方法的另一个实施方式中，对受试者施用(b)且在施用(b)后约第3周、第8周和第16周时对受试者施用(a)。
在本发明方法的另一个实施方式中，疫苗(a)的rVSV和疫苗(b)的rVSV是表达外源病原体的蛋白的嵌合rVSV，且其中这两种rVSVs能够针对该蛋白诱导免疫应答。
在本发明方法的另一个实施方式中，病原体是病毒、真菌、细菌或寄生虫病原体。
在本发明方法的另一个实施方式中，病原体是慢病毒。
在本发明方法的另一个实施方式中，慢病毒是HIV且蛋白是HIV蛋白。
在本发明方法的另一个实施方式中，一种血清型的rVSV和另一种血清型的rVSV包括表面糖蛋白(G)基因和RNA依赖的RNA聚合酶(L)基因，且其中用于表达HIV蛋白的基因是插入G基因和L基因之间的HIV基因。
在本发明方法的另一个实施方式中，HIV基因选自包含gag、env和pol的一组HIV基因。
在本发明方法的另一个实施方式中，病原体是HCV且蛋白是HCV蛋白。
在本发明方法的另一个实施方式中，一种血清型的rVSV和另一种血清型的rVSV包括表面糖蛋白(G)基因和RNA依赖的RNA聚合酶(L)基因，且其中用于表达HCV蛋白的基因被插入rVSV的G基因和L基因之间。
在本发明方法的另一个实施方式中，疫苗(a)和疫苗(b)包含减毒嵌合rVSVs的混合物，其中混合物中的至少两种减毒嵌合rVSVs表达病原体的不同蛋白。
在本发明方法的另一个实施方式中，(a)和(b)两种疫苗的每一种都诱导体液、细胞和粘膜免疫应答。
在本发明方法的另一个实施方式中，疫苗(a)的rVSV血清型是印第安纳，疫苗(b)的rVSV血清型是新泽西。
在本发明方法的另一个实施方式中，疫苗(a)和疫苗(b)的每一种都进一步包含佐剂。
在一个实施方式中，本发明提供了一种初免-加强联合疫苗。在一个实施方式中，该初免-加强联合疫苗包含：(a)有效量的包含一种血清型的减毒rVSV的疫苗，该一种血清型的减毒rVSV具有包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的第一改性M蛋白；和(b)有效量的包含另一种血清型的rVSV的疫苗，该另一种血清型的rVSV具有包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列的第二改性M蛋白。
在本发明的初免-加强联合疫苗的一个实施方式中，疫苗(a)是初免疫苗，疫苗(b)是加强疫苗。
在本发明的初免-加强联合疫苗的另一个实施方式中，疫苗(b)是初免疫苗，疫苗(a)是加强疫苗。
在本发明的初免-加强联合疫苗的另一个实施方式中，两种减毒rVSVs是表达外源病原体的蛋白的嵌合rVSV，且这两种嵌合rVSVs能够针对蛋白诱导免疫应答。
在本发明的初免-加强联合疫苗的另一个实施方式中，病原体是病毒、真菌、细菌或寄生虫病原体。
在本发明的初免-加强联合疫苗的另一个实施方式中，病原体是慢病毒。
在本发明的初免-加强联合疫苗的另一个实施方式中，慢病毒是HIV且蛋白是HIV蛋白。
在本发明的初免-加强联合疫苗的另一个实施方式中，一种血清型的rVSV和另一种血清型的rVSV包括表面糖蛋白(G)基因和RNA依赖的RNA聚合酶(L)基因，且其中用于表达HIV蛋白的基因被插入G基因和L基因之间。
在本发明的初免-加强联合疫苗的另一个实施方式中，HIV基因选自由env、gag和pol组成的一组HIV基因。
在本发明的初免-加强联合疫苗的另一个实施方式中，病原体是HCV且表位是HCV蛋白。
在本发明的初免-加强联合疫苗的另一个实施方式中，一种血清型的rVSV和另一种血清型的rVSV包括表面糖蛋白(G)基因和RNA依赖的RNA聚合酶(L)基因，且其中用于表达HCV蛋白的基因被插入G基因和L基因之间。
在本发明的初免-加强联合疫苗的另一个实施方式中，HCV蛋白是结构或非结构的HCV蛋白。
在本发明的初免-加强联合疫苗的另一个实施方式中，两种疫苗的每一种都包含减毒嵌合rVSVs的混合物，且混合物中的至少两种减毒嵌合rVSVs具有病原体的不同蛋白。
在本发明的初免-加强联合疫苗的另一个实施方式中，两种疫苗的每一种都能够诱导体液、细胞和粘膜免疫应答。
在本发明的初免-加强联合疫苗的另一个实施方式中，疫苗(a)的血清型是印第安纳且疫苗(b)的血清型是新泽西。
在本发明的初免-加强联合疫苗的另一个实施方式中，疫苗(a)和疫苗(b)的每一种都进一步包含佐剂。
在一个实施方式中，本发明提供了一种试剂盒，其包含：(a)至少一种剂量的有效量的包含rVSVInd的疫苗，该rVSVInd具有包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的改性的M蛋白；和(b)至少一种剂量的有效量的含rVSVNJ的疫苗，该rVSVNJ具有包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列的改性的M蛋白。
在本发明试剂盒的另一个实施方式中，(a)和(b)配制于一种药学可接受的载体中。
在又一个实施方式中，本发明提供了一种分离的肽，其包含选自列为SEQ ID NOs：4、9和10的一组氨基酸序列的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本发明提供了用于编码SEQ ID NOs：4、9和10的分离的肽的分离的核苷酸序列。
附图简述
仅以实例的方式描述各实施方式，并参考附图，其中：
图1显示了在M基因中具有突变（mutations）的印第安纳(Ind)血清型水疱性口炎病毒(VSV)的基因组织(organization)。
图2显示了在M基因中具有突变的新泽西(NJ)水疱性口炎病毒(VSV)的基因组。
图3显示了用于从cDNA回收VSV的反向遗传学系统。
图4显示了在允许的温度下[图A)和C)]和半允许的温度下[图B)和D)]，在感染重组VSVs的幼仓鼠肾(BHK)细胞[图A)和B)]和感染rVSV的人成神经细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中，rVSVInd的M蛋白中突变L111F的裂解量效应。
图5是表示在31oC和37oC下的BHK21细胞中，rVSVNJ的M蛋白中突变M48R+M51、G22E、G22E/M48R+M51R、G22E/L110F、G22E/L110F/M48R+M51R的裂解量效应的图表。
图6A)是表现rVSVInd的rVSV蛋白表达水平的蛋白质印迹分析：1. WT、2. M51R、3. G21E、4. G21E/M51R、5. G21E/L111F和6. G21E/L111F/M51R。
图6B)是表现rVSVNJ的rVSV蛋白表达水平的蛋白质印迹分析：1. WT、2. M48R+M51R、3. G22E、4. G22E/M48R+M51R、5. G22E/L110F和6. G22E/L110F/M48R+M51R。
图7包括受到具有野生型M基因的rVSVInd(图7B和I)和感染在M基因具有不同突变的rVSVInd (图7A、D、E、F、G、H、K、L、M和N) 感染的BHK21细胞图片和未感染的BHK21细胞图片(图7C和J)。细胞在31oC (图7A-G)或37oC (图7H-N)下温育。
图8包括受到在M基因具有不同突变的(图8C、D、E、F、I、J、K和L)或具有野生型M基因(图8A和G)的rVSVInd感染的SH-SY5Y细胞的图片和未感染的SH-SY5S细胞的图片(图8B和H)。细胞在31oC (图8A-F)或37oC (图8G-L)下温育。
图9包括受到在M基因具有不同突变的(图9A、D、E、F、G、H、K、L、M和N)或具有野生型M基因(图9B和I)的rVSVNJ感染的BHK21细胞的图片以及未感染的BHK21细胞图片(图9C和J)。细胞在31oC (图9A-G)或37oC (图9H-N)下温育。
图10包括受到在M基因具有不同突变的(图10A、D、E、F、G、H、K、L、M、和N)或具有野生型M基因(图10B和I)的rVSVNJ感染的SH-SY5Y细胞图片，和未感染的SH-SY5Y细胞图片(图10C和J)。细胞在31oC (图10A-G)或37oC (图10H-N)下温育。
图11包括显示在瑞士韦伯斯特小鼠中通过内侧（intralateral）脑室注射进行的神经毒性研究的图表：A) UV-辐射的rVSVInd G21E/L111F/M51R、B) rVSVInd WT、C) rVSVInd M51R和D) rVSVInd G21E/L111F/M51R。
图12包括显示在瑞士韦伯斯特小鼠中通过内侧（intralateral）脑室注射进行的神经毒性研究的图表：A) rVSVNJ WT、B)rVSVNJ M48R+M51R、C) rVSVNJ G22E/M48R+M51R和D) rVSVNJ G22E/L110F/M48R+M51R。
图13 (SEQ ID NOs：11-15) A)显示了将HIV-1 Gag-En基因克隆入rVSV的cDNA克隆。图13B)是感染表达Gag-En和具有M基因不同突变的rVSVs并在31oC下温浴的BHK细胞的蛋白质印迹分析。图13C)是感染表达Gag-En和具有M基因不同突变的rVSVs并在37oC下温浴的BHK细胞的蛋白质印迹分析。
图14描述了接种管理模式和接种组列表。
图15描述了用二甲亚砜(DMSO)刺激的如插图所示的不同接种组的肽特异性CD8+ IFN γ+ T细胞的频率图。
图16是用VSV N刺激的如插图所示的不同接种组的VSV N肽特异性CD8+ IFN γ+ T细胞的频率图。
图17是用HIV-1 Gag刺激的如插图所示的不同接种组的HIV-1 Gag肽特异性CD8+ IFN γ+ T细胞的频率图。
图18是显示如插图所示的不同接种组的HIV-1 Gag特异性抗体应答的图表。
图19是用不同剂量的表1中的rVSV接种的不同接种组的VSV N肽特异性CD8+ IFN γ+ T细胞的频率图。
图20是用不同剂量的表1中的rVSV接种的不同接种组的HIV-1 Gag肽特异性CD8+ IFN γ+ T细胞的频率图。
图21是显示用不同剂量的表1中的rVSV接种的不同接种组的HIV-1 Gag特异性抗体应答的图表。
图22 (SEQ ID NOS：16-26)显示了将连接至编码gp120和gp41的人B细胞和T细胞表位的核苷酸的HIV-1 gag基因克隆入rVSVInd G21E/L111F/M51R和rVSVNJ G22E/M48R+M51R的cDNA克隆。
图23 (分别为SEQ ID NOS：11-15和27-31)显示了将连接至编码gp41、nef、gp120、RT、Tat和Rev的人B细胞和T细胞表位的核苷酸的HIV-1 gag基因克隆入rVSVInd G21E/L111F/M51R和rVSVNJ G22E/M48R+M51R的cDNA克隆。其还显示了将HIV-1 pol和env基因克隆入rVSVInd G21E/L111F/M51R和rVSVNJ G22E/M48R+M51R的cDNA克隆。
图24显示了用表达Gag A、B、C、En和RT的rVSVInd G21E/L111F/M51R感染并在31oC和37oC下温育的BHK21细胞的蛋白质印迹分析。
图25显示了用表达Gag A、B、C、En和RT的rVSVNJ G22E/M48R+M51R感染并在31oC和37oC下温育的BHK21细胞的蛋白质印迹分析。
图26显示了用表达HIV-1 pol基因的rVSVInd G21E/L111F/M51R或rVSVNJ G22E/M48R+M51R感染的BHK21细胞的蛋白质印迹分析。
图27显示了用表达HIV-1 gp160mss基因的rVSVInd G21E/L111F/M51R或rVSVNJ G22E/M48R+M51R感染的BHK21细胞的蛋白质印迹分析。
图28包括描述在表6的不同接种组：G1、G2、G3、G4、G5和不含Env P18的G5中的VSV N和HIV-1蛋白肽特异性CD8+ T细胞应答的图表。
图29是描述表6的G6接种组中的VSV N和HIV-1蛋白肽特异性CD8+ T细胞应答的图表。显示了VSV N肽和用于刺激脾细胞的来自HIV-1蛋白的肽的氨基酸序列(SEQ ID NOS：32 - 37)。
图30显示了表6的接种组中诱导的针对HIV-1 Gag (图30A)和Gp120 (图30B)的体液免疫应答，其通过酶联免疫吸附分析法(ELISA)进行测定。
图31描述了克隆入rVSVInd(GLM)和rVSVNJ(GM)和rVSVNJ(GLM)的HCV结构蛋白基因。
图32显示了对来自rVSVInd(GLM)、rVSVNJ(GM)、rVSVNJ(GLM)的HCV Core (图32A)、E1 (图32B)、E2 (图32C)和NS4B (图32D)蛋白表达的蛋白质印迹分析。
图33描述了克隆入rVSVInd(GLM)、rVSVNJ(GM)和rVSVNJ(GLM)的HCV非结构蛋白基因。
图34对来自rVSVInd(GLM)的HCV NS3在37oC和31oC下的表达(图34A)、NS5A在37oC下的表达(图34B)和NS5B(图34C)在37oC和31oC下的表达的蛋白质印迹分析。
图35显示了来自rVSVNJ(GM)的HCV NS3、NS4B、NS5A和NS5B在37oC的表达(图35A)和HCV NS5AB在37oC的表达(图35B)。蛋白表达通过蛋白质印迹分析进行检测。
发明详述
综述
除非另有说明，否则本文所用的所有科技术语具有本发明所属领域普通技术人员所普遍理解的相同含义。同样的，除了在权利要求中，除非另有说明，否则“或”的使用包括了“和”，反之亦然。非限制性术语不会被解释为限制性的，除非有明确表述或上下文清楚地显示了相反含义（例如“包括”、“具有”和“包含”一般表示“无限制地包括”）。在权利要求中包含的单数形式例如“一”、“一个”和“该”包括了复数指向，除非另有明确说明。“基本上由……组成”表示列举的任何元素都必然地被包括在内，会在相当程度上影响所列举的元素的基本特性和新型特性的元素被排除在外，且其他元素可选的可以被包括在内。“由……组成”表示除了所列举的那些元素外其他所有元素都被排除在外。由这些术语的每一个所定义的实施方式均落入本发明的范围内。
所有的数值名称（例如规模和重量（包括范围））都是约数，其一般可以0.1、1.0或10.0的增量发生适当变化(+)或(-)。所有的数值名称都可以被理解为其前面存在术语“约”。
术语“施用”包括递送本发明化合物的任何方法，包括将药物组合物、疫苗或治疗剂递送到受治疗者系统，或者递送到受治疗者的特定部位内或特定部位上。本文使用的术语“全身性给药”、“全身性施用”、“外周给药”和“经外周施用”是指以不同于直接进入中枢神经系统的方法施用化合物、药物或其它物质，由此使之进入患者系统，从而进行代谢和其他类似过程，例如皮下给药。“胃肠外给药”和“胃肠外施用”是指不同于肠内给药和局部给药的给药方式，一般通过注射来进行，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸肌内注射和输注。
术语“氨基酸”为本领域所知。本文用于标明氨基酸和保护基的缩写一般根据IUPAC-IUB生物化学命名委员会的推荐(参见Biochemistry(1972)11：1726-1732)。对于本发明相关的氨基酸其名称为：M：甲硫氨酸，R：精氨酸，G：甘氨酸，E：谷氨酸，L：亮氨酸，F：苯丙氨酸。在某些实施方式中，用于本发明应用的氨基酸是存在于蛋白质中的天然存在的氨基酸或天然存在的含有氨基和羧基的这类氨基酸的合成代谢产物或分解代谢产物。特别合适的氨基酸侧链包括选自以下氨基酸的侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。
本文所用术语“抗体”包括例如任何同种型(IgG、IgA、IgM、IgE等)的完整抗体，包括多克隆抗体、单克隆抗体、重组抗体和人源化抗体；以及其特异性识别并能够结合蛋白质表位的片段。可以采用常规技术使抗体成为片段，并以相同方式筛选出可利用的片段。因此，该术语包括能够选择性与特定蛋白质反应的抗体分子的蛋白酶剪切部分区段或重组制备部分区段。这类蛋白酶解片段和/或重组片段的非限制性实例包括Fab、F(ab′)2、Fab′、Fv和含有通过肽接头连接的V[L]区和/或V[H]区的单链抗体(scFv)。scFv可以共价或非共价连接以形成具有两个或更多个结合位点的抗体。
本文使用的术语“表位”指在动物体内，优选的哺乳动物体内具有抗原性或免疫原性的多肽或蛋白质的位点或片段。具有免疫原性的表位是如本领域技术人员通过例如免疫分析等熟知的任何方法所确定的抗体免疫特异性结合的多肽或蛋白质的位点或片段。
本文在蛋白质试剂的上下文中使用的术语“片段”指包含肽、多肽或蛋白质的氨基酸序列的至少2个连续氨基酸残基、至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基、或至少250个连续氨基酸残基的氨基酸序列的肽或多肽。在一个实施方式中，全长蛋白质的片段保留该全长蛋白质的活性，例如免疫原性。在另一个实施方式中，全长蛋白质的片段不保留该全长蛋白质的活性，例如非免疫原性。
本文在核酸的上下文中使用的术语“片段”指包含编码肽、多肽或蛋白质的核酸序列的至少2个连续核苷酸、至少5个连续核苷酸、至少10个连续核苷酸、至少15个连续核苷酸、至少20个连续核苷酸、至少25个连续核苷酸、至少30个连续核苷酸、至少35个连续核苷酸、至少40个连续核苷酸、至少50个连续核苷酸、至少60个连续核苷酸、至少70个连续核苷酸、至少80个连续核苷酸、至少90个连续核苷酸、至少100个连续核苷酸、至少125个连续核苷酸、至少150个连续核苷酸、至少175个连续核苷酸、至少200个连续核苷酸、至少250个连续核苷酸、至少300个连续核苷酸、至少350个连续核苷酸、或至少380个连续核苷酸的核酸序列。在一个优选的实施方式中，核酸的片段编码保留完整蛋白活性例如免疫原性的肽或多肽。在另一个实施方式中，全长蛋白质的片段不保留该全长蛋白质的活性，例如非免疫原性。
本文使用的术语“基本上非细胞溶解的”表示重组水疱性口炎病毒(rVSV)不会显著损伤或杀死其感染的细胞。
本领域技术人员已知的术语“HIV”是指人免疫缺陷病毒。有两种类型的HIV：HIV-1和HIV-2。有许多不同的HIV-1毒株。HIV-1毒株可被分为三组：“主要(major)”组，即M组，“异常(outlier)”组，即O组和“新(new)”组，即N组。这三个组可代表三种独立进入人体的猿猴免疫缺陷病毒。在M组内有至少10个亚型或分化体：例如，分化体A、B、C、D、E、F、G、H、I、J和K。“分化体”是一组生物(例如一个种)，其成员有共同的衍生自共同祖先的同源特征。本申请任何提及HIV-1时都包括所有的这些毒株。
术语“非感染性的”是指降低到不存在感染能力。
本文使用的术语“受试者”或“患者”可交换使用。本文使用的术语“受试者”和“受试者们”指人或非人动物。
术语“递药装置”是指可用来施用受治疗者治疗药或药物的任何装置。递药装置的非限制性实例包括皮下注射器、多室注射器(multichamber syringe)、支架、导管、透皮贴剂、微针(microneedle)、微研磨器(microabrader)和可植入控释装置。在一个实施方式中，术语“递药装置”是指能够在注射前使两种化合物混匀的双室注射器。
本文所用术语“药学上可接受的”是指在合理医学判断范围内，适于与人组织和动物组织接触而无过度毒性、刺激性、变态反应或其它问题或并发症，并与合理的利益/风险比相当的化合物、物质、组合物和/或剂型。
本文所用术语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的物质、组合物或溶媒，例如参与将题述化合物从一种器官或身体的一部分运送或转运到另一种器官或身体的另一部分的液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂包封材料。在与制剂的其它成分相容并且对患者无害的意义上来说，各载体必须是“可接受的”。可用作药学上可接受的载体的物质的一些实例包括：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)西黄蓍胶粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；(9)油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格溶液(Ringer′s solution)；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；和(22)用于药物制剂的其它无毒相容性物质。
术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用，是指任何长度的聚合形的核苷酸，或是脱氧核糖核苷酸，或是核糖核苷酸或其类似物。下面是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、由联锁分析界定的基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸(branched polynucleotide)、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含改性核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，则核苷酸结构的改性可以在聚合物组装之前或之后进行。核苷酸序列可以被非核苷酸组分间隔开。多核苷酸可以在聚合后进一步被改性，例如通过与标记组分缀合。术语“重组”多核苷酸是指基因组、cDNA、半合成来源或合成来源的多核苷酸，其不是天然存在的多核苷酸或者与其它非天然排列的多核苷酸连接。“寡核苷酸”是指不超过约100个核苷酸的单链多核苷酸，例如不超过约75、50、25或10个核苷酸。
本文术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”(如果为单链)可互换使用，是指氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链或是支链，它可包含改性氨基酸，而且可被非氨基酸间隔开。该术语还包括已被改性的氨基酸聚合物，例如二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作，例如与标记组分缀合。
在某些实施方式中，本发明的多肽可以经化学合成、在无细胞系统中经核糖体合成、或者在细胞内经核糖体合成。可以采用各种本领域公认的方法进行本发明多肽的化学合成，包括分步固相合成、经由肽片段构象辅助再连接(conformationally-assisted re-ligation)的半合成、克隆或合成肽区段的酶促连接和化学连接。天然化学连接采用两个未受保护的肽区段的化学选择反应以产生瞬时硫酯连接的中间体。然后，该瞬时硫酯连接的中间体自发地进行重排，以提供在连接位点具有天然肽键的全长连接产物。全长连接产物在化学上与通过无细胞合成而产生的蛋白质相同。全长连接产物可以根据被允许的情况而进行重新折叠和/或氧化，以形成天然的含有二硫键的蛋白质分子(参见例如美国专利号6,184,344和6,174,530；以及T. W. Muir等，Curr. Opin. Biotech.(1993)：第4卷，第420页；M. Miller等，Science(1989)：第246卷，第1149页；A. Wlodawer等，Science(1989)：第245卷，第616页；L.H. Huang等，Biochemistry(1991)：第30卷，第7402页；M. Schnolzer等，Int. J. Pept. Prot. Res.(1992)：第40卷，第180-193页；K. Rajarathnam等，Science(1994)：第264卷，第90页；R. E. Offord，“Chemical Approaches to Protein Engineering(蛋白质工程的化学方法)”，载于Protein Design and the Development of New therapeutics and Vaccines，J. B. Hook，G. Poste主编，(Plenum Press，New York，1990)，第253-282页；C. J. A. Wallace等，J. Biol. Chem.(1992)：第267卷，第3852页；L. Abrahmsen等，Biochemistry(1991)：第30卷，第4151页；T. K. Chang等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1994)91：12544-12548；M. Schnlzer等，Science(1992)：第3256卷，第221页；和K. Akaji等，Chem. Pharm. Bull. (Tokyo)(1985)33：184)。
“VSV”用于指水疱性口炎病毒。
“rVSV”用于指重组水疱性口炎病毒。
术语“印第安纳”和“IND”用于指VSV血清型印第安纳 (VSVInd)。
术语“新泽西”和“NJ”用于指VSV血清型新泽西(VSVNJ)。
“MWT”、“M(WT)” 用于指野生型M蛋白。VSVInd野生型M基因的核苷酸序列可以包含由SEQ ID NO：1表示的核苷酸序列。VSVInd野生型M蛋白的氨基酸序列可以包含由SEQ ID NO：3表示的氨基酸序列。VSVNJ野生型M基因的核苷酸序列可以包含由SEQ ID NO：5表示的核苷酸序列。VSVNJ野生型M蛋白的氨基酸序列可以包含由SEQ ID NO：8表示的氨基酸序列。 “M51R”用于指VSVInd中的M(WT)，其在第51位具有甲硫氨酸变为精氨酸。  “G21E”用于指VSVInd中的M(WT)，其在第21位具有甘氨酸变为谷氨酸。 “L111F”用于指VSVInd中的M(WT)，其在第111位具有亮氨酸变为苯丙氨酸。“G22E”用于指VSVNJ中的M(WT)，其在第22位具有甘氨酸(G)变为谷氨酸(E)。“L110F”用于指VSVNJ中的M(WT)，其在第110位具有亮氨酸(L)变为苯丙氨酸(F)。“M48R+M51R”用于指VSVNJ中的M(WT)，其在第48和51位具有甲硫氨酸(M)变为精氨酸(R)。“rVSVInd M(G21E/L111F/M51R)”或“rVSVInd (GLM)” 用于指具有M(WT)的rVSVInd，其在第21位具有甘氨酸变为谷氨酸，在第111位的亮氨酸变为苯丙氨酸和在第51位的甲硫氨酸变为精氨酸。 “rVSVNJ M(G22E/M48R+M51R)”或“rVSVNJ (GM)”用于指具有M(WT)的rVSVNJ，其在第22位具有甘氨酸变为谷氨酸和在第48和51位甲硫氨酸变为精氨酸，“rVSVNJ M(G22E/L110F/M48R+M51R)”或“rVSVNJ (GLM)”用于指具有M(WT)的rVSVNJ，其在第22位具有甘氨酸变为谷氨酸、在第110位亮氨酸变为苯丙氨酸和在第48和51位甲硫氨酸变为精氨酸。
综述
发明人产生了新型M蛋白和能够产生该新型M蛋白的新型减毒rVSVs。本发明的新型蛋白可以包括：M(G21E/L111F/M51R)、M(G22E/M48R+M51R)和M(G22E/L110F/M48R+M51R)。本发明的新型减毒rVSVs可被用于蛋白表达和疫苗载体以及用于预防或治疗感染的方法。本发明的rVSV可被用于制备用于人和其它动物的感染性疾病的疫苗以诱导细胞和体液免疫应答。
分离的蛋白和M蛋白
在一个实施方式中，本发明涉及分离的蛋白和编码该分离的蛋白的核苷酸序列。从而，在一个实施方式中，本发明涉及一种分离的肽，包含选自以SEQ ID NOs：4、9和10列出的氨基酸序列的氨基酸序列。在另一个实施方式中，本发明涉及分离的核苷酸序列，其包含选自以SEQ ID NOs：2、6和7列出的多核苷酸的核苷酸序列。
在一个实施方式中，本发明涉及具有至少一种以下取代物的新型VSV M蛋：M(G21E/L111F/M51R)、M(G22E/M48R+M51R)和M(G22E/L110F/M48R+M51R)。在一个方面本发明涉及一种VSV M蛋白，其包含选自以SEQ ID NOs：4、9和10列出的氨基酸序列的氨基酸序列。在另一个实施方式中本发明涉及编码本发明的新型VSV M蛋白的核苷酸序列。该核苷酸序列可选自以SEQ ID NOs：2、6和7列出序列组。
预防或治疗感染的方法
提供了一种诱导免疫应答、预防或治疗感染的方法。在一个实施方式中，该方法可以包括对受试者施用：(a)有效量的包含一种血清型的减毒rVSV的一种疫苗，该一种血清型的减毒rVSV具有(i)第一改性的M蛋白，该第一改性的M蛋白包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，该SEQ ID NO：3至少包括下述取代物：G21E/L111F/M51R，和(ii)病原体的表位；和(b)有效量的包含另一种血清型的减毒rVSV的另一种疫苗，该另一种血清型的减毒rVSV具有：(i)第二改性的M蛋白，该第二改性的M蛋白包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，该SEQ ID NO：8至少包括下述取代物：G22E/M48R+M51R，和(ii)病原体的表位。在本发明的实施方式中，该方法可以包括在初步-加强免疫模式中对受试者施用(a)有效量的rVSVInd M(G21E/L111F/M51R)，和(b)有效量的rVSVNJ M(G22E/M48R+M51R)或rVSVNJ M(G22E/L110F/M48R+M51R)。
本文使用的术语“有效量”表示有效和以剂量存在且在一段时间内需要达到期望结果的量。
在某些实施方式中，在对受试者施用(b)之前对受试者施用(a)。
在某些实施方式中，在治疗或预防过程中对受试者施用(b) 多于一次。
在某些实施方式中，对有需要的受试者施用(a)并在施用(a)后约第3周、第8周和第16周对有需要的受试者施用(b)。
在某些实施方式中，在对受试者施用(a)前对受试者施用(b)。
在某些实施方式中，在治疗或预防过程中对受试者施用(a) 多于一次。
在某些实施方式中，对有需要的受试者施用(b)并在施用(b)后约第3周、第8周和第16周对有需要的受试者施用(a)。
重组病毒
在某些实施方式中，本发明涉及重组水疱性口炎病毒(rVSV)，其可以是全长的VSV，基本上非细胞溶解的，无致病性的，能够在受试者中诱导免疫应答，能够在允许温度下复制病毒颗粒至高滴度、在半允许温度下复制病毒颗粒至低滴度，以及在非允许温度下可以不能生产病毒，且其能够表达外源病原体的表位。本发明的rVSV可以能够诱导体液、细胞和粘膜免疫应答。
在一个实施方式中，本发明涉及rVSVInd和rVSVNJ。该rVSVInd可以是全长的、基本上非细胞溶解的rVSVInd M(G21E/L111F/M51R)，其能够在约31oC的允许温度下生产病毒颗粒，且其可以在约37oC的半允许温度下不能或很弱地生产病毒颗粒，以及在高于37oC、例如39oC的非允许温度下不能生产病毒颗粒。在某些实施方式中，rVSVInd可以包括M(G21E/L111F/M51R)。在某些实施方式中，rVSVInd可以包括含有核苷酸序列SEQ ID NO：2的M基因。
在某些实施方式中，rVSV是全长的、基本上非细胞溶解的rVSVNJ M (G22E/M48R+M51R)或M(G22/L110F/M48R+M51R)。在某些实施方式中，rVSV是基本上非细胞溶解的rVSVNJ，其包括M基因，其中M基因的核苷酸序列选自SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7。
本发明的rVSVs可使用本领域已知的技术制备。在一个实施方式中，rVSVs 可在适于rVSV在宿主中复制和表达的条件下被引入宿主细胞。从而，本发明还提供了一种细胞，其具有rVSVInd，其中病毒的M蛋白的氨基酸序列被改性以提供基本上非细胞溶解性，且还允许rVSVInd在允许温度下有效复制但在非允许温度下不能复制。
从而，本发明还涉及具有一种或多种本发明的重组VSVs的细胞。
本发明的疫苗或免疫原性组合物
本发明进一步以包含一种或多种本发明的rVSVs的疫苗或免疫原性组合物为特征。在一个实施方式中，本发明以如上所述的包含rVSVInd的疫苗或免疫原性组合物和包含rVSVNJ的疫苗或免疫原性组合物为特征。
在一个实施方式中，疫苗可以包括表达一种病原体的一种表位的rVSVs。在另一个实施方式中，疫苗可以包括表达一种病原体的不同表位的混合物或混合剂(cocktail) (见表6，接种组5和6)。
本发明的疫苗或免疫原性组合物适于在体内以生物相容性的形式给予受试者。本文使用的“适于在体内以生物相容性的形式给予”这一表述意味着待给予的物质的一种形式，其中治疗效果超越了任何的毒性效应。这些物质可被给予任何动物或受试者，优选人类。本发明的疫苗还可以作为可被冷冻运输的溶液进行提供。此外，疫苗可含有合适的防腐剂，如甘油，或者可以不用防腐剂进行配制。如果合适的话（即，对疫苗中的VSV没有损害），疫苗还可以含有合适的稀释剂、佐剂和/或载体。
疫苗的剂量可根据例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及在个体内抗体产生期望应答的能力等因素进行变化。还可以对疫苗的剂量进行变化以基于环境提供最优的剂量应答。
试剂盒
本发明提供了用于例如预防或治疗感染的试剂盒。例如，试剂盒可以包含一种或多种如上所述的药物组合物或疫苗和可选的其使用说明。在又一个实施方式中，本发明提供了包含一种或多种药物组合物或疫苗和一种或多种用于实现这些组合物给药的装置的试剂盒。
对试剂盒组件进行包装，以用于手动或半自动或全自动地实践前述方法。在涉及试剂盒的其它实施方式中，本发明预期(contemplate)了包括本发明组合物的试剂盒和可选的其使用说明。这些试剂盒可具有多种用途，包括，例如造影、诊断、治疗和其它应用。
本发明rVSVs的优点和独特特征
本发明的新的和不寻常的特征：
rVSVInd M(G21E/L111F/M51)在允许温度下(约31oC)的常规组装和释放使其可能在允许温度下扩增新型突变体rVSVs至高滴度以制造病毒储备(stock)。rVSVInd M(G21E/L111F/M51)在非允许温度(约37oC (体温左右))下的组装缺陷通过在非允许温度下显著降低后代感染病毒的数量增加了在人和其它动物中使用rVSV的安全性。在rVSVIndM蛋白中之前存在M51R突变下增加这些突变进一步减轻了VSVInd的毒性。
在rVSVNJ的M蛋白中的三突变M(G22E/M48R+M51R)或四突变M(G22E/L110F/M48R+M51R)没有使得病毒对于病毒组装温度敏感。然而，对M48R+51R突变增加G22E突变或G22E/L110F使得VSVNJ更加减毒并显著减少致病性。
以上公开内容大概描述了本发明。可参考下述具体实施例获得更全面的了解。描述这些实施例仅用于阐释，不意味着限制本发明的范围。按照条件可能建议的或作为权宜之用也预期了形式的变化和等效物替换。虽然本文使用了具体的术语，但是这些术语被用作描述性的含义，而非用于限制。
实施例
通过下述实施例对本发明进行了进一步阐释，其不应以任何形式被解释为限制性的。
实施例1 –向rVSVInd和rVSVNJ的M基因中引入突变和通过反向遗传学回收重组VSV
向VSVInd (图1)和VSVNJ (图2)的M基因中引入突变。在各位点编码氨基酸的核苷酸序列通过大引物(mega-primer)PCR方法进行突变。每个突变表达为在一个具体位点处的一个氨基酸(例如，M51R中的M51)被另一个氨基酸(例如，M51R中的R)取代物。为了进一步减轻VSV的毒性，发明人将tsO23中的突变(G21E和L11F)与M基因中的甲硫氨酸至精氨酸突变(M51R)进行了组合，后者减少了M蛋白对细胞蛋白合成的抑制活性，此外，还降低了VSV颗粒在非允许(39 oC)和半允许(37 oC)温度下的组装。rVSVInd和rVSVNJ的M基因中核苷酸序列和氨基酸从野生型至突变体的变化见于表2、3、4和5。改变的核苷酸密码子用下划线标出，改变的核苷酸序列和氨基酸序列用粗体标出。
通过反向遗传学从cDNA质粒回收野生型和突变体重组水疱性口炎病毒 (rVSV)(图3)。VSV反向遗传学应用了表达噬菌体T7 (T7)的DNA依赖的RNA聚合酶的BHK21细胞，和编码VSV全长基因组RNA(pVSV)的一个质粒以及表达核壳体蛋白(pN)、磷酸蛋白(pP)和VSV聚合酶L蛋白(pL)的3个质粒。全长基因组RNA和N、P和L蛋白的信使RNA的转录处于T7 RNA聚合酶的控制之下。位于每个VSV的N、P和L基因上游的内部核糖体进入位点(IRES) 增强了蛋白的翻译。将质粒用LipofectamineTM 2000以10 μg的pN、10 μg的pP、5 μg的pL和15 μg的pVSV的浓度转染入BHK-T7细胞。当细胞表现出约50-70%的CPE时收集被转染细胞的培养基。
实施例2 –M基因中的突变L111F在半允许温度37°C下显著降低rVSVInd的裂解量
回收的病毒通过挑噬菌斑纯化3次，并通过在31oC下以0.1的MOI感染BHK21细胞扩增得到更大体积的存储病毒。发明人以MOI为3的rVSVs感染了BHK21细胞和人成神经细胞瘤细胞SH-SY5Y。在允许的温度(31°C)和半允许温度(37°C，体温)下培养感染的细胞以测定新型M突变体在病毒颗粒组装中的温度敏感性。在感染后每2小时从受感染细胞收集培养基直至10小时，通过用Vero E6细胞进行噬菌斑分析测定感染性病毒颗粒的数量。用于噬菌斑分析的受到突变体病毒感染的细胞在31°C下培养。在整个10小时的感染中野生型和所有突变体均同等良好地复制并产生相似的感染性病毒滴度(图4A和C)。然而，突变体rVSVInd、rVSVInd-G21E/L111F和rVSVInd-G21E/L111F/M51R在37oC下以较之rVSVInd的野生型或M51R突变体显著更低的滴度复制。野生型和新型M突变体rVSVInd-G21E/L111F/M51R之间生产感染性颗粒的差异程度大至4个log(图4B和D)。图4中的误差条表示均值的标准差。在图4B中感染后4小时、6小时、8小时和10小时的rVSVInd-G21E/L111F/M51R的病毒滴度的P值（通过将其与rVSVInd-WT的滴度相比获得）为p<0.0001、p=0.0055、p=0.0040和p=0.0015。在图4B中感染后4小时、6小时、8小时和10小时的rVSVInd-G21E/L111F的病毒滴度的P值（通过将其与rVSVInd-WT的滴度相比获得）为p<0.0001、p=0.0055、p=0.0041和p=0.0016。图4D中的P值为<0.005。通过使用双方(two-sided)独立t检验计算P值。
实施例3– rVSVNJ M基因中的突变G22E和L110F在37 °C下不降低rVSVNJ的裂解量。
以MOI为3的野生型和M基因突变体rVSVs感染BHK21细胞。在37°C (半允许温度)和31°C (允许温度)下培养，在感染后10小时收集培养基。通过用Vero E6细胞进行噬菌斑分析测定每种病毒的病毒滴度。表中显示了来自平行样本的平均病毒滴度。在31oC和37oC两种温度下野生型和所有rVSVNJ的M突变体均同等良好地复制(图5)，表明在rVSVNJ M基因中引入G22E和L110F突变没有影响37oC下的病毒组装和释放。图5中的误差条表示均值的标准差。
实施例4 –rVSVInd M基因中的L111F突变所导致的在半允许的温度下的组装缺陷不影响VSV蛋白的表达
以MOI为6的野生型和M基因突变体rVSVInd和rVSVNJ感染BHK21细胞。感染的细胞在37°C和31°C下培养6小时。感染后6小时裂解感染的细胞，在SDS-PAGE凝胶上载5 μg的总蛋白，通过蛋白质印迹分析使用兔抗VSVInd和VSVNJ血清(1:5000稀释)检测rVSV蛋白。结果显示虽然存在使得rVSVInd在37°C下的裂解量降低的突变(G21E/L111F和G21E/L111F/M51R中的L111F)，但是VSV的蛋白表达水平仍与野生型rVSVInd相当(图6A)。野生型和所有rVSVNJ的M突变体在31oC和37oC下均以相似的水平表达其蛋白(图6B)。
实施例5 – rVSVInd M基因中的组合突变G21E/L111F/M51R显著降低在BHK21细胞和人成神经细胞瘤细胞SH-SY5Y中的细胞致病性。
为了考察rVSVInd的M基因的L111F和M51R突变对细胞致病性的影响，发明人以0.1的rVSVInd MOI感染了BHK21细胞(图7)和人成神经细胞瘤细胞(图8)。VSV的典型细胞病变效果是受感染细胞的聚集(rounding-up)和细胞裂解。感染20小时后，将由rVSVInd-G21E/L111F/M51R导致的细胞病变效果与其它rVSVInd导致的效果进行了对比。在20小时感染中rVSVInd-G21E/L111F/M51R突变体表现出细胞病变效果减少最多，37oC下无聚集细胞或少量聚集细胞，突变L111F和M51R(图7N和图8L)的组合较之每种单一突变进一步减轻了病毒在BHK21和SH-SY5Y细胞中的细胞致病性。
实施例6 –具有M基因突变G22E/M48R+M51R和G22E/L110F/M48R+M51R的rVSVNJ导致的BHK21细胞中减少的细胞病变效果。
为了考察rVSVNJ的M基因的G22E、L110F和M48R+M51R突变对细胞致病性的影响，发明人以0.1的rVSVNJ MOI感染了BHK21细胞(图7)和人成神经细胞瘤细胞。感染20小时后，发明人比较了由rVSVNJ野生型和其它M突变体导致的细胞病变效果(细胞聚集和裂解)。在20小时感染中G22E/M48R+M51R突变体和G22E/L110F/M48R+M51R突变体表现出最小的37oC下细胞病变效果，突变G22E和M48R+M51R的组合进一步减轻了rVSVNJ在BHK21(图9L和9N)和SH-SY5Y细胞(图10L和10N)中的细胞致病性。
实施例7 –在M蛋白具有G21E/L111F/M51R突变的rVSVInd和具有G22E/M48R+M51R和G22E/L110F/M48R+M51R突变的rVSVNJ被减毒至在脑部注射该病毒的小鼠没有表现出神经病学迹象或任何症状（例如体重减轻）的程度。
在通过皮肤磨损或白蛉或蚊子叮咬导致的天然感染中，VSV在宿主动物中未表现出趋向神经性。然而，当野生型VSV被直接注射入小鼠或猴子的鼻子或脑部时，这些动物表现出神经病学症状。为了考察VSVs新型M突变体的神经毒性，发明人在瑞士韦伯斯特小鼠脑部的内侧（intralateral）脑室注射了1X106 PFU的突变体VSV和1X103 PFU的野生型VSV。发明人从Charles River实验室购买了5周大的具有内侧脑室移植的瑞士韦伯斯特小鼠。在到达动物笼一周后用病毒注射三只小鼠/组。病毒注射后，观察小鼠的神经病学迹象，并每两天称重，共4周。注射1X103 PFU的野生型rVSVInd的小鼠在注射后4天死亡(图11B)。注射1X106 PFU的rVSVInd-M51R(图11C)的两只小鼠在注射6天后减轻了约20%的体重，且在注射后约14天体重反弹回正常重量。注射rVSVInd-M51R的1只小鼠在试验中没有减轻体重。注射rVSVInd-G21E/L111F/M51R的所有三只小鼠在直至小鼠被处死前的4周内均未表现出生病迹象，也没有减轻体重(图11D)，表明突变G21E/L111F和M51R的组合显著减毒了rVSVInd并使其失去了在小鼠中的神经毒性。注射rVSVNJ-WT的1只小鼠表现出两条后腿麻痹，其在注射后第6天被处死(图12A)。注射rVSVNJ-WT的其它2只小鼠和注射rVSVNJ-M48R+M51R、rVSVNJ-G22E/M48R+M51R或rVSVNJ-G22E/L110F/M48R+M51R的小鼠在注射后4周内均未表现出生病迹象，也没有减轻体重(图12B、12C和12D)。图11和12中的误差条表示均值的标准差。
实施例8 –表达HIV-1 Gag蛋白作为目标基因的rVSVs的产生；HIV-1 Gag蛋白在31oC和37oC同等良好表达。
新产生的M突变体，rVSVInd的G21E/L111F/M51R突变体和rVSVNJ的G22E/M48R+M51R和G22E/L110F/M48R+M51R突变体表现出与野生型rVSV相比在37 °C下的降低的细胞致病性和相当的蛋白表达。为了作为疫苗载体使用，rVSV的新型M突变体应当在体内诱导良好的免疫应答，无论是体液还是细胞免疫应答。当HIV-1 gag蛋白在细胞中单独表达时，其产生病毒样颗粒，且该病毒样颗粒从细胞中分泌。从而，gag蛋白是适于从rVSV的新型M突变体表达以考察细胞和体液免疫应答的蛋白。此外，CD8+细胞毒性T细胞表位HIV-1 Gag中的H-2Kd-限制肽(NH2-AMQMLKETI-COOH) (SEQ ID NO：33)已在Balb/c小鼠中充分研究。发明人插入了连接至来自HIV-1的gp41、gp120和nef蛋白的保守性人CD8+ T细胞表位的全长HIV-1 gag基因(Gag-En)。Gag-En基因被插入至rVSVInd的野生型(WT)和G21E/L111F/M51R (GLM)以及rVSVNJ的野生型、G22E/M48R+M51R (GM)和G22E/L110F/M48R+M51R(GLM)的全长cDNA克隆中的G基因和L基因的连接处。按照图3的描述利用反向遗传学从cDNA克隆回收rVSVs，通过蛋白质印迹分析使用抗HIV-1 p24单克隆抗体考察Gag-En从rVSVs的表达。为了进行蛋白质印迹分析，用MOI为6的rVSVs感染BHK21细胞并在31°C和37oC下培养，感染后6小时制备细胞裂解物。对SDS-PAGE上载5 μg的总蛋白用于蛋白质印迹分析。rVSVInd(GLM)-Gag-En、rVSVNJ(GM)-Gag-En和rVSVNJ(GLM)-Gag-En在半允许的温度下(37oC，图13C)良好地表达了Gag-En蛋白(64 kDa)，且表达水平与在允许的温度下(31oC，图13B)相似。
实施例9 –在小鼠中的rVSV接种方案
对每组6只Balb/c小鼠接种图14中描述的初免-加强方案。根据疫苗载体种类 (野生型vs.突变体)和方案对小鼠进行分组，例如，用相同血清型的rVSV进行初免和加强或两种血清型交替用于初免和加强。小鼠在6周大时用5X106 PFU的rVSVs进行肌肉内初免接种。初免后3周，用与初免接种相同的剂量对小鼠进行加强接种。加强注射后1周，收集脾细胞和血清检测HIV-1 Gag 特异性CD8+ T细胞免疫应答和体液免疫应答。
实施例10 –用rVSVInd(GLM)-HIV-1 Gag-En初免和rVSVNJ(GLM)-HIV-1 Gag-En加强诱导了针对HIV-1 Gag的最强CD8+ T细胞免疫应答。
由与负载MHC I分子的抗原呈递细胞上的所述肽相互作用所刺激的T细胞增强了干扰素-γ(IFN-γ)的分泌，其表明了抗原特异性T细胞免疫应答。对脾细胞用FITC-抗-CD8和APC-抗-IFN-γ双重染色用于具有增加的胞内INF-γ的CD8+ T细胞。为了考察HIV-1 Gag蛋白特异性CD8+ T细胞免疫应答，将脾细胞分离，用H-2Kd-限制性HIV-1 Gag肽NH2-AMQMLKETI-COOH (SEQ ID NO：33)刺激1X106细胞，用FITC大鼠抗-小鼠CD8染色细胞用于CD8分子，用APC大鼠抗-小鼠IFN-γ染色用于胞内IFN-γ。在染色IFN-γ前用Brefeldin A封闭其分泌。使用核壳体特异性肽IN275：NH2-MPYLIDFGL-COOH (SEQ ID NO：32)考察VSV特异性CD8+ T细胞免疫应答。用流式细胞仪FACSCalibur对肽特异性CD8+-IFN-γ+ T细胞计数。用DMSO (肽的溶剂，图15)处理的脾细胞没有刺激CD8+ T细胞，表明用VSV N肽和HIV-1 Gag肽处理脾细胞特异性刺激了图16和图17中的CD8+ T细胞。通过交替rVSV(WT)或rVSV(GLM)突变体两种血清型进行初免和加强免疫诱导了比组1、2、5、6、9和10所示的使用单一rVSV血清型的初免和加强免疫更强的针对VSV以及HIV-1 Gag蛋白的CD8+ T细胞免疫应答(图16和图17)。对于接种新型M突变体或rVSV，当小鼠用rVSVInd(GLM)-Gag初免接种和rVSVNJ(GLM)-Gag加强时，较之相反顺序而言CD8+ T细胞针对HIV-1 Gag蛋白的应答被更好地诱导(图17，组别6 vs组别10)。通过使用双方(two-sided)独立样本t检验计算图17中组别6的P值，将结果与组别10的进行对比。图16和17中的误差条表示均值的标准差。
实施例11 – HIV-1 Gag特异性体液免疫应答
在加强免疫后一周收集血清考察HIV-1 Gag 特异性抗体的产生。通过间接的酶联免疫吸附分析(ELISA)测定Gag特异性抗体滴度。对于ELISA，用重组p55包被96孔ELISA板，浓度125 ng/孔。小鼠血清稀释1:100。抗体结合至抗原，用第二抗体绵羊抗小鼠IgG-HRP检测p55。通过加入底物过氧化氢和四甲基联苯胺的混合物检测HRP的酶活性。用酶标仪在波长450处读出每个样品的OD。在用新型M突变体接种的小鼠中很好地诱导了针对HIV-1 Gag的体液免疫应答(产生针对HIV-1 Gag的抗体)，当两种血清型的rVSV(WT)或rVSV(GLM)交替用于初免和加强注射时，诱导了针对HIV-1 Gag最优的体液免疫应答(图18，组别5、6、9和10)。对于利用新型M突变体用于诱导针对外源蛋白的体液免疫应答而言，用rVSVInd(GLM)-Gag进行初免和用rVSVNJ(GLM)-Gag进行加强较之相反顺序表现更佳 (图18，组别6 vs 组别10)。图18中的误差条表示均值的标准差。
实施例12 –接种增加剂量的rVSVInd(GLM)、rVSVNJ(GM)和rVSVNJ(GLM)在小鼠中诱导了更强的免疫应答。
如图17和图18所示，当小鼠用rVSVInd(GLM)-Gag初免接种并用rVSVNJ(GLM)-Gag进行加强接种时，诱导了更强的HIV-1 Gag特异性CD8+ T细胞免疫应答和体液免疫应答。然而该免疫应答弱于用rVSVInd(WT)-Gag和rVSVNJ(WT)-Gag诱导的应答。因此，发明人期望考察如果他们增加rVSVInd(GLM)-Gag和rVSVNJ(GLM)-Gag的剂量，其能否增强免疫应答。用rVSVInd(GLM)-Gag接种6周大的Balb/c小鼠，6只小鼠/组用于初免，用rVSVNJ(GLM)-Gag或rVSVNJ(GM)-Gag用于加强。因为在体外和体内rVSVNJ(GM)与rVSVNJ(GLM)同样减毒，发明人包括了rVSVNJ(GM)-Gag作为加强病毒，并将其免疫应答与通过rVSVNJ(GLM)-Gag诱导的免疫应答进行了对比。用各种剂量的rVSVInd(GLM)-Gag、rVSVNJ(GLM)-Gag和rVSVNJ(GLM)-Gag接种小鼠组；5X106 PFU/小鼠、5X107 PFU/小鼠、5X108 PFU/小鼠和5X109 PFU/小鼠(表1)。
根据图14所示日程接种小鼠，在加强接种一周后处死获得脾细胞和血清。对脾细胞用FITC-抗-CD8和APC-抗-IFN-γ双重染色用于具有增加的胞内INF-γ的CD8+ T细胞。为了考察HIV-1 Gag蛋白特异性CD8+ T细胞免疫应答，将脾细胞分离，用H-2Kd-限制性HIV-1 Gag肽NH2-AMQMLKETI-COOH (SEQ ID NO：33)刺激1X106细胞，用FITC大鼠抗-小鼠CD8染色细胞用于CD8分子，用APC大鼠抗-小鼠IFN-γ染色用于胞内IFN-γ。在染色IFN-γ前用Brefeldin A封闭其分泌。使用核壳体特异性肽IN275：NH2-MPYLIDFGL-COOH (SEQ ID NO：32)考察VSV特异性CD8+ T细胞免疫应答。用流式细胞仪FACSCalibur对肽特异性CD8+-IFN-γ+ T细胞计数。
在接种不同剂量的rVSVInd(GLM)-Gag、rVSVNJ(GLM)-Gag或rVSVNJ(GM)-Gag的所有接种组中，针对VSV N蛋白的CD8+ T细胞免疫应答都非常相似(图19)。用rVSVInd(GLM)-Gag初免接种和rVSVNJ(GLM)-Gag加强后的HIV-1 Gag特异性CD8+ T细胞免疫应答在增加疫苗剂量时看起来有所增加，但区别不是统计学显著的(图20，组别2、3、4、5)。然而，当小鼠用rVSVInd(GLM)-Gag初免和用rVSVNJ(GM)-Gag加强接种时，HIV-1 Gag特异性CD8+ T细胞的频率随着增加的剂量（5X108 PFU）而显著增加。在用5X109 PFU/小鼠接种的组别中HIV-1 Gag 特异性CD8+ T细胞应答最强(图20，组别6、7、8、9)。使用双方独立样本t检验计算图20中组别8和9的P值，将组别8的结果与组别7对比，组别9的结果与组别8对比。图19和20中的误差条表示均值的标准差。
针对HIV-1 Gag蛋白的抗体的产生随着用于初免的rVSVInd(GLM)-Gag和用于加强的rVSVNJ(GLM)-Gag或rVSVNJ(GM)-Gag剂量的增加而增加 (图21)。用rVSVNJ(GLM)-Gag或用rVSVNJ(GM)-Gag加强接种在病毒的各种剂量中产生了相似水平的Gag特异性抗体。图21中的误差条代表均值的标准差。
实施例13 –表达HIV-1蛋白Gag、Pol、Env和RT的rVSVInd(GLM)和rVSVNJ(GM)的产生
对于利用rVSVInd(GLM)和rVSVNJ(GM)作为疫苗载体的HIV-1疫苗，发明人包括了编码大部分大聚蛋白(large polyprotein)的HIV基因，其被裂解为功能蛋白Gag和Env以及具有酶活性的蛋白(pol基因产物)。此外，HIV-1 gag基因被连接至人体内编码T细胞和B细胞的肽表位的核苷酸。发明人已经产生了具有编码HIV-1 Gag的盒(cassettes)的rVSVInd(GLM)和rVSVNJ(GM)，所述HIV-1 Gag连接至源于多病毒外壳的HIV Env蛋白的B细胞表位(图22)。发明人已经产生了rVSVInd(GLM)-Gag-En和rVSVNJ(GM)-Gag-En，其表达gag基因和来自Nef、Gp120和Gp41的T细胞肽表位(图23)。发明人产生了具有HIV-1 Gag-RT的rVSVInd(GLM)和rVSVNJ(GM)，其编码具有来自RT、Tat和Rev蛋白的肽表位的gag蛋白(图23)。此外，发明人产生了分别具有pol基因和env基因的rVSVInd(GLM)和rVSVNJ(GM)(图23)。之前，发明人已证实用蜜蜂蜂毒信号肽替换HIV-1包膜蛋白的信号肽显著增加Gp120表达、糖基化和分泌的比率(Yan Li等人，PNAS，93：9606-9611，1996)。Gp120增加的表达和分泌被期望能增强针对HIV-1 gp120的T细胞和B细胞免疫应答诱导。因此，发明人产生了具有具有蜂毒信号序列(gp160mss)的HIV-1 env基因的rVSVs。对具有HIV-1蛋白的重组VSVs进行噬菌斑纯化并扩增以储存病毒。HIV-1蛋白在31 oC和37 oC下从突变体VSV的表达通过蛋白质印迹分析进行检测。用来自多种HIV-1蛋白的T细胞和B细胞表位标记的Gag蛋白在31oC和37oC下均从rVSVInd(GLM)和rVSVNJ(GM)中良好表达(图24和图25)。rVSV基因组中克隆的HIV-1 pol基因编码聚蛋白，其被裂解为蛋白酶(PR，p11)、逆转录酶(RT，p66/p51)和整合酶(IN，p31)。发明人检测了RT产物的两个亚单位，p66和p51。p51通过蛋白水解裂解一个位于羧基端的p15的片段产生自p66。RT产物p66和p51在31 oC和37 oC下从rVSVInd(GLM)和rVSVNJ(GM)中同等良好表达(图26)。env基因编码糖蛋白Gp160，其被裂解为受体结合蛋白Gp120和融合诱导细胞质和跨膜蛋白gp41。Gp160由细胞转运高尔基体停留蛋白酶furin裂解。在BHK21细胞中从rVSVInd(GLM)和rVSVNJ(GM)表达的Gp160不被裂解为Gp120和Gp41，或裂解不是非常有效，虽然在31 oC和37 oC下表达水平均良好(图27)。我们之前关于Gp160在BHK21细胞中表达和裂解为Gp120和Gp41的数据表明该过程不是非常有效 (Kunyu Wu等，Journal of General Virol.，90:1135-1140，2009)。
实施例14 –具有HIV-1蛋白Gag、Gp160和RT的rVSVInd(GLM)和rVSVNJ(GM)在小鼠中的免疫研究
对rVSVs新型M突变体rVSVInd(GLM)和rVSVNJ(GM)进行的初步初免-加强免疫研究表明，用rVSVInd(GLM)初免小鼠并用rVSVNJ(GM)加强免疫较之相反方式诱导了更好的针对外源基因的CD8+ T细胞免疫应答(图17)和体液免疫应答(图18)。用rVSVInd(GLM)-Gag初免和rVSVNJ(GM)-Gag加强，每种病毒5X108 pfu的剂量比更低剂量诱导了更好的Gag特异性CD8+ T细胞应答，虽然针对Gag的B细胞应答与低剂量诱导的相当(图20和图21)。发明人选择了5X108 pfu作为用于表达HIV-1 Gag、Gp160和RT的rVSVInd(GLM)和rVSVNJ(GM)的免疫研究的剂量。
发明人用表达HIV-1蛋白的rVSVInd(GLM)初免Balb/c小鼠，并在初免3周后用表达HIV-1蛋白的rVSVNJ(GM)进行加强免疫，如表6所述。发明人考察了针对个别HIV-1蛋白的免疫应答是如何由表达分离蛋白的三种不同病毒的个别注射或混合注射诱导的。加强免疫后一周，发明人将受免疫小鼠处死取脾细胞和血清。用H-2Kd-限制性HIV-1蛋白特异性肽Gag、Env P18、RT354、RT464和RT472刺激1X106的脾细胞。肽序列示于图29。受刺激的脾细胞用FITC大鼠抗-小鼠CD8和APC大鼠抗-小鼠IFN-γ双重染色用于细胞表面CD8分子和T细胞的胞内IFN-γ。该方案，用rVSVInd(GLM)和rVSVNJ(GM)进行初免-加强免疫诱导肽特异性CD8+ T细胞免疫应答，其程度根据发明人用作刺激的肽而不同。针对Env肽的CD8+ T细胞刺激了最大的CD8+ T细胞，高达19%-23%的平均CD8+ T细胞(图28，G3和G5)。用只表达Gag的rVSV免疫(图28，G2)或用混合的三种表达与多种HIV-1 Gp120和Gp41的B和T细胞表位相连的Gag A、Gag B和Gag C的rVSVs免疫(图29，G6)的小鼠中，约4.5%或3%的CD8+ T细胞应答了Gag蛋白。在注射具有pol基因的rVSV的小鼠中约2%的CD8+ T细胞中产生了RT特异性CD8+ T细胞(图28，G4)。当小鼠用表达个体蛋白(图28，G2和G4)的单一rVSV注射时，CD8+ T细胞针对个体HIV-1蛋白、Gag和RT的应答比用混合的表达单一蛋白(图28，G5)的rVSVs更强。Env特异性CD8+ T细胞应答是最强的，且在单一注射和混合注射中相似。CD8+ T细胞针对Env肽表位的应答是Balb/c小鼠中的主要免疫。目前，发明人不确定为何混合注射表达Gag、Env和RT的三种不同rVSVs诱导了相对单一病毒注射较低的针对VSV N、gag和RT的CD8+ T细胞应答。有可能在混合病毒注射中每种病毒对抗原呈递细胞的竞争降低了针对Gag和RT的CD8+ T细胞。由于rVSV是小鼠中与单一rVSV或混合rVSVs注射的HIV-1蛋白的常见载体，预计VSV N在混合注射中能诱导相似或更好的CD8+ T细胞应答。然而，当表达Env时，小鼠中CD8+ T细胞针对VSV N的应答即使以单一注射(图28，G3)也比混合注射更低(图28，G5)。因此，其可能是由于Env蛋白在Balb/c小鼠中的免疫优势的结果，当Env共同表达时其负面影响了其它蛋白在CD8+ T细胞中的呈递。对于小鼠中的组合免疫，所有三种rVSVs在单一位点注射，其可能导致不同蛋白在相同抗原呈递细胞中竞争抗原呈递。发明人将在多于一个注射位置混合注射诱导CD8+ T细胞应答来测试免疫。
细胞中表达的HIV-1 Gag蛋白可形成病毒样颗粒(VLP)，VLP可从细胞中被释放。释放的VLPs可诱导针对Gag蛋白的体液免疫应答。HIV-1 env基因编码糖基化表面蛋白，其通过ER-高尔基体网加工进行适当折叠，并裂解为跨膜亚单位Gp41和表面单位Gp120。Gp41和Gp120由非共价键连接并成熟形成Gp41和Gp120异二聚体的三聚体。成熟的Gp41和Gp120三聚体被传输至细胞表面。由于Gp41和Gp120之间的弱键，Gp120易于从细胞表面脱落。因此，针对Gp120的抗体可以被诱导至细胞表面的Gp120或脱落的Gp120。针对HIV-1 Gag蛋白和Gp120的抗体滴度通过ELISA检测。对于Gag抗体，用125 ng/孔的重组p55 (Pierce Biotechnology，RP-4921)包被微板，50 μl小鼠血清以1:100、1:200和1:400的稀释度检测。在注射单独的rVSV Gag-En(图30A，G2)和混合的病毒rVSV-Gag A+rVSV Gag B+rVSV Gag C (图30A，G6)的小鼠中产生了Gag抗体。对于Gp120 ELISA，用250 ng/孔的来自B亚型的HIV-1 SF162 Gp140三聚体(NIH AIDS试剂程序，编号12026)包被96孔微板。小鼠血清以1:100、1:200和1:400稀释，50 μl稀释的血清被添加至微板进行ELISA。在单独注射rVSV-HIV-1 Gp160的小鼠中和注射表达Gag、Gp160和RT每种蛋白(图30B，G3和G5)的混合病毒的小鼠中产生了Gp120特异性抗体。在注射混合病毒的小鼠中的Gp120抗体滴度略低于注射表达Gp160的单一病毒的，虽然其并非统计学显著的。
在用表达单一病毒的个体病毒或表达多种HIV-1蛋白的混合病毒注射小鼠后，新产生的rVSVs M突变体rVSVInd(GLM)和rVSVNJ(GM)诱导了针对多种从载体中表达的HIV-1蛋白的CD8+ T细胞和体液免疫应答。
实施例15 –具有丙肝病毒结构蛋白的rVSVInd(GLM)、rVSVNJ(GM)和rVSVNJ(GLM)的产生
通常，体液免疫应答是通过针对任何病原体的适应性免疫应答介导的第一条防线。虽然针对HCV的体液免疫应答及其在预防HCV感染中的作用较之HCV特异性细胞免疫应答而言没有充分研究，但还是值得包括能够诱导HCV特异性抗体的疫苗。已证实核壳蛋白核心和表面糖蛋白E1和E2形成了可从细胞中释放的病毒样颗粒(VLP)(Blanchard，E.等人，J. Virol. 76:4073-4079，2002)。此外，已证实HCV蛋白p7，一种在ER膜上形成离子通道的病毒孔蛋白(viroporin)，参与从受感染细胞中释放HCV颗粒(Steinmann，E.等人，PLoS Pathogens 3:962-972，2007)。另一HCV跨膜蛋白蛋白NS4B形成了一种膜状网结构，其主要由ER膜组成。由NS4B形成的膜状网是一种用于后代HCV生产的微结构。不是非常清楚NS4B在HCV复制中具有何种功能，但仅仅由于其形成集中其它HCV蛋白，特别是Core、E1、E2、p7的ER膜状结构的性质，在候选疫苗中包括NS4B是有吸引力的。因此，在疫苗中一起包括Core、E1、E2、P7和NS4B可能诱导体液和细胞免疫应答。
对于使用新型rVSVsM突变体的HCV结构蛋白疫苗，发明人将HCV core基因、E1E2P7和NS4B基因一起(由VSV基因间接头序列连接)，和CoreE1E2P7和NS4B基因一起(由VSV基因间接头序列连接)插入至VSV G基因和L的接头处 (图31)。通过反向遗传学产生了下述rVSVs：rVSVInd(GLM)-FC、rVSVInd(GLM)-CE1E2P7/NS4B、rVSVNJ(GM)-FC和rVSVNJ(GLM)-E1E2P7/NS4B。发明人在从质粒DNA产生具有CE1E2P7/NS4B的rVSVNJ(GM)时遇到困难，因此，发明人去除了核，并将E1E2P7/NS4B克隆入rVSVNJ(GLM)质粒中，产生了rVSVNJ(GLM)-E1E2P7/NS4B。使用针对每种蛋白的抗体进行蛋白质印迹分析考察了在31oC和37oC下Core、E1、E2和NS4B从重组VSV中的表达(图32)。在两种温度下蛋白表达量相似。Core (图32A)、E1 (图32B)和E2 (图32C)从rVSVInd(GLM)-CE1E2P7/NS4B中良好表达，但NB4B的表达低于其它蛋白(图32D)。
实施例16 –具有HCV非结构蛋白的rVSVInd(GLM)、rVSVNJ(GM)和rVSVNJ(GLM)的产生
发明人期望靶向大多数HCV蛋白，包括core、E1、E2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白，以针对多种蛋白诱导HCV特异性CD8+ T细胞和CD4+ T细胞免疫应答。HCV非结构(NS)蛋白-NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B涵盖了超过一半的HCV聚蛋白。NS蛋白被NS3在NS4A的帮助下裂解为个体蛋白。几项研究证实从急性HCV感染恢复的患者针对NS3蛋白中的多表位发展了强CD4+ T细胞和CD8+ T细胞应答(Diepolder，H. M. J. Virol. 71:6011-6019，1997；Lamonaca，V.等人，Hepatology 30:1088-1098，1999；Shoukry，N. H.等人，J. Immunol. 172:483-492，2004)，表明在候选疫苗中包括NS3对于找出针对HCV的成功细胞免疫应答是重要的。NS3蛋白，一种丝氨酸蛋白酶和RNA螺旋酶，其与NS4A关联并位于ER膜上(Sato，S.等人，J. Virol. 69:4255-4260，1995；Failla，C.等人，J. Virol. 69:1769-1777，1995)。NS5A蛋白，一种磷蛋白，被认为与NS5B蛋白，一种RNA依赖的RNA聚合酶一起涉及HCV RNA合成(Shirota，Y.等人，J. Biol. Chem.，277:11149-11155，2002；Shimakami，等人，J. Virol. 78:2738-2748，2004)。NS5B蛋白是RNA依赖的RNA聚合酶，其合成正义HCV基因组RNA并介导反义基因组RNA (Beherens，S. E. EMBO J. 15:12-22，1996)。NS5B蛋白是尾锚定蛋白并通过其羧端20个氨基酸与ER膜关联 (Yamashita，T. J. Biol. Chem. 273:15479-15486，1998；Hagedorn，C. H. Curr. Top. MicroBiol. Immunol. 242:225-260，2000)。
发明人克隆了HCV NS基因作为用于单一蛋白的基因或用于2或3个NS蛋白的聚蛋白的基因。NS基因NS3、NS34AB、NS5A、NS5B、NS5AB被克隆入pVSVInd(GLM)和pVSVNJ(GM)的G基因和L基因的接头处(图33)。发明人产生了rVSVInd(GLM)-NS3、rVSVInd(GLM)-NS34AB、rVSVInd(GLM)-NS5A、rVSVInd(GLM)-NS5B和rVSVInd(GLM)-NS5AB，使用针对每种NS蛋白的抗体进行蛋白质印迹分析考察了在31oC和37oC下NS蛋白的表达(图34)。发明人产生了rVSVNJ(GM)-NS3、rVSVNJ(GM)-NS4B、rVSVNJ(GM)-NS34AB、rVSVNJ(GM)-NS5A、rVSVNJ(GM)-NS5B和rVSVNJ(GM)-NS5AB。使用针对每种NS蛋白的抗体进行蛋白质印迹分析考察了在37oC下每种蛋白从rVSVNJ载体的表达(图35)。虽然NS蛋白从rVSVInd和rVSVNJ中的表达水平不同，但是足以使用它们作为HCV疫苗。
 
表1. 小鼠接种组和接种方案

表2. VSV印第安纳血清型，野生型(SEQ ID NO：1)和突变体G21E/L111F/M51R (SEQ ID NO 2)的M基因核苷酸序列对比
1                                                50
SEQ ID NO：1：ATGAGTTCCT TAAAGAAGAT TCTCGGTCTG AAGGGGAAAG GTAAGAAATC
SEQ ID NO：2：ATGAGTTCCT TAAAGAAGAT TCTCGGTCTG AAGGGGAAAG GTAAGAAATC
51                                                   100
SEQ ID NO：1：TAAGAAATTA GGGATCGCAC CACCCCCTTA TGAAGAGGAC ACTAACATGG
SEQ ID NO：2：TAAGAAATTA GAAATCGCAC CACCCCCTTA TGAAGAGGAC ACTAACATGG
101                                                  150
SEQ ID NO：1：AGTATGCTCC GAGCGCTCCA ATTGACAAAT CCTATTTTGG AGTTGACGAG
SEQ ID NO：2：AGTATGCTCC GAGCGCTCCA ATTGACAAAT CCTATTTTGG AGTTGACGAG
151                                                  200
SEQ ID NO：1：ATGGACACTC ATGATCCGCA TCAATTAAGA TATGAGAAAT TCTTCTTTAC
SEQ ID NO：2：AGGGACACTC ATGATCCGCA TCAATTAAGA TATGAGAAAT TCTTCTTTAC
201                                                  250
SEQ ID NO：1：AGTGAAAATG ACGGTTAGAT CTAATCGTCC GTTCAGAACA TACTCAGATG
SEQ ID NO：2：AGTGAAAATG ACGGTTAGAT CTAATCGTCC GTTCAGAACA TACTCAGATG
251                                                  300
SEQ ID NO：1：TGGCAGCCGC TGTATCCCAT TGGGATCACA TGTACATCGG AATGGCAGGG
SEQ ID NO：2：TGGCAGCCGC TGTATCCCAT TGGGATCACA TGTACATCGG AATGGCAGGG
301                                                  350
SEQ ID NO：1：AAACGTCCCT TCTACAAGAT CTTGGCTTTT TTGGGTTCTT CTAATCTAAA
SEQ ID NO：2：AAACGTCCCT TCTACAAGAT CTTGGCTTTT TTTGGTTCTT CTAATCTAAA
351                                                  400
SEQ ID NO：1：GGCCACTCCA GCGGTATTGG CAGATCAAGG TCAACCAGAG TATCACGCTC
SEQ ID NO：2：GGCCACTCCA GCGGTATTGG CAGATCAAGG TCAACCAGAG TATCACGCTC
401                                                  450
SEQ ID NO：1：ACTGTGAAGG CAGGGCTTAT TTGCCACACA GAATGGGGAA GACCCCTCCC
SEQ ID NO：2：ACTGTGAAGG CAGGGCTTAT TTGCCACACA GAATGGGGAA GACCCCTCCC
451                                                  500
SEQ ID NO：1：ATGCTCAATG TACCAGAGCA CTTCAGAAGA CCATTCAATA TAGGTCTTTA
SEQ ID NO：2：ATGCTCAATG TACCAGAGCA CTTCAGAAGA CCATTCAATA TAGGTCTTTA
501                                                  550
SEQ ID NO：1：CAAGGGAACG GTTGAGCTCA CAATGACCAT CTACGATGAT GAGTCACTGG
SEQ ID NO：2：CAAGGGAACG GTTGAGCTCA CAATGACCAT CTACGATGAT GAGTCACTGG
551                                                  600
SEQ ID NO：1：AAGCAGCTCC TATGATCTGG GATCATTTCA ATTCTTCCAA ATTTTCTGAT
SEQ ID NO：2：AAGCAGCTCC TATGATCTGG GATCATTTCA ATTCTTCCAA ATTTTCTGAT
601                                                  650
SEQ ID NO：1：TTCAGAGATA AGGCCTTAAT GTTTGGCCTG ATTGTCGAGA AAAAGGCATC
SEQ ID NO：2：TTCAGAGATA AGGCCTTAAT GTTTGGCCTG ATTGTCGAGA AAAAGGCATC
651                                                  700
SEQ ID NO：1：TGGAGCTTGG GTCCTGGATT CTGTCAGCCA CTTCAAATGA 
SEQ ID NO：2：TGGAGCTTGG GTCCTGGATT CTGTCAGCCA CTTCAAATGA 
         表3. VSV印第安纳血清型野生型(SEQ ID NO：3)和突变体G21E/L111F/M51R (SEQ ID NO：4)的M蛋白氨基酸序列对比
1                    21                             50
SEQ ID NO: 3: MSSLKKILGL KGKGKKSKKL GIAPPPYEED TNMEYAPSAP IDKSYFGVDE
SEQ ID NO: 4: MSSLKKILGL KGKGKKSKKL EIAPPPYEED TNMEYAPSAP IDKSYFGVDE
51                                                  100
SEQ ID NO: 3: MDTHDPHQLR YEKFFFTVKM TVRSNRPFRT YSDVAAAVSH WDHMYIGMAG
SEQ ID NO: 4: RDTHDPHQLR YEKFFFTVKM TVRSNRPFRT YSDVAAAVSH WDHMYIGMAG
101       111                                       150
SEQ ID NO: 3: KRPFYKILAF LGSSNLKATP AVLADQGQPE YHAHCEGRAY LPHRMGKTPP
SEQ ID NO: 4: KRPFYKILAF FGSSNLKATP AVLADQGQPE YHAHCEGRAY LPHRMGKTPP
151                                                  200
SEQ ID NO: 3: MLNVPEHFRR PFNIGLYKGT VELTMTIYDD ESLEAAPMIW DHFNSSKFSD
SEQ ID NO: 4: MLNVPEHFRR PFNIGLYKGT VELTMTIYDD ESLEAAPMIW DHFNSSKFSD
201                           229                    250
SEQ ID NO: 3: FRDKALMFGL IVEKKASGAW VLDSVSHFK
SEQ ID NO: 4: FRDKALMFGL IVEKKASGAW VLDSVSHFK 
         表4. VSV新泽西血清型野生型(SEQ ID NO：5)和突变体G22E/M48R+M51R (SEQ ID NO：6)和G22E/L110F/M48R+M51R (SEQ ID NO：7)的M基因的核苷酸序列对比
1                                                   50
SEQ ID NO：5: ATGAGTTCCT TCAAAAAGAT TCTGGGATTT TCTTCAAAAA GTCACAAGAA
SEQ ID NO：6: ATGAGTTCCT TCAAAAAGAT TCTGGGATTT TCTTCAAAAA GTCACAAGAA
SEQ ID NO：7: ATGAGTTCCT TCAAAAAGAT TCTGGGATTT TCTTCAAAAA GTCACAAGAA
51                                                  100
SEQ ID NO：5 :ATCAAAGAAA CTAGGCTTGC CACCTCCTTA TGAGGAATCA AGTCCTATGG
SEQ ID NO：6 :ATCAAAGAAA CTAGAATTGC CACCTCCTTA TGAGGAATCA AGTCCTATGG
SEQ ID NO：7 :ATCAAAGAAA CTAGAATTGC CACCTCCTTA TGAGGAATCA AGTCCTATGG
101                                                  150
SEQ ID NO：5 :AGATTCAACC ATCTGCCCCA TTATCAAATG ACTTCTTCGG AATGGAGGAT
SEQ ID NO：6 :AGATTCAACC ATCTGCCCCA TTATCAAATG ACTTCTTCGG AAGGGAGGAT
SEQ ID NO：7 :AGATTCAACC ATCTGCCCCA TTATCAAATG ACTTCTTCGG AAGGGAGGAT
151                                                  200
SEQ ID NO：5 :ATGGATTTAT ATGATAAGGA CTCCTTGAGA TATGAGAAGT TCCGCTTTAT
SEQ ID NO：6 :AGGGATTTAT ATGATAAGGA CTCCTTGAGA TATGAGAAGT TCCGCTTTAT
SEQ ID NO：7 :AGGGATTTAT ATGATAAGGA CTCCTTGAGA TATGAGAAGT TCCGCTTTAT
201                                                  250
SEQ ID NO：5 :GTTGAAGATG ACTGTTAGAG CTAACAAGCC CTTCAGATCG TATGATGATG
SEQ ID NO：6 :GTTGAAGATG ACTGTTAGAG CTAACAAGCC CTTCAGATCG TATGATGATG
SEQ ID NO：7 :GTTGAAGATG ACTGTTAGAG CTAACAAGCC CTTCAGATCG TATGATGATG
251                                                  300
SEQ ID NO：5 :TCACCGCAGC GGTATCACAA TGGGATAATT CATACATTGG AATGGTTGGA
SEQ ID NO：6 :TCACCGCAGC GGTATCACAA TGGGATAATT CATACATTGG AATGGTTGGA
SEQ ID NO：7 :TCACCGCAGC GGTATCACAA TGGGATAATT CATACATTGG AATGGTTGGA
301                                                  350
SEQ ID NO：5 :AAGCGTCCTT TCTACAAGAT AATTGCTCTG ATTGGCTCCA GTCATCTGCA
SEQ ID NO：6 :AAGCGTCCTT TCTACAAGAT AATTGCTCTG ATTGGCTCCA GTCATCTGCA
SEQ ID NO：7 :AAGCGTCCTT TCTACAAGAT AATTGCTTTT ATTGGCTCCA GTCATCTGCA
351                                                  400
SEQ ID NO：5 :AGCAACTCCA GCTGTGTTGG CAGACTTAAA TCAACCAGAG TATTATGCCA
SEQ ID NO：6 :AGCAACTCCA GCTGTGTTGG CAGACTTAAA TCAACCAGAG TATTATGCCA
SEQ ID NO：7 :AGCAACTCCA GCTGTGTTGG CAGACTTAAA TCAACCAGAG TATTATGCCA
401                                                  450
SEQ ID NO：5 :CACTAACAGG TCGTTGTTTT CTTCCTCACC GACTCGGATT GATCCCACCG
SEQ ID NO：6 :CACTAACAGG TCGTTGTTTT CTTCCTCACC GACTCGGATT GATCCCACCG
SEQ ID NO：7 :CACTAACAGG TCGTTGTTTT CTTCCTCACC GACTCGGATT GATCCCACCG
451                                                  500
SEQ ID NO：5 :ATGTTTAATG TGTCCGAAAC TTTCAGAAAA CCATTCAATA TTGGGATATA
SEQ ID NO：6 :ATGTTTAATG TGTCCGAAAC TTTCAGAAAA CCATTCAATA TTGGGATATA
SEQ ID NO：7 :ATGTTTAATG TGTCCGAAAC TTTCAGAAAA CCATTCAATA TTGGGATATA
501                                                  550
SEQ ID NO：5 :CAAAGGGACT CTCGACTTCA CCTTTACAGT TTCAGATGAT GAGTCTAATG
SEQ ID NO：6 :CAAAGGGACT CTCGACTTCA CCTTTACAGT TTCAGATGAT GAGTCTAATG
SEQ ID NO：7 :CAAAGGGACT CTCGACTTCA CCTTTACAGT TTCAGATGAT GAGTCTAATG
551                                                  600
SEQ ID NO：5 :AAAAAGTCCC TCATGTTTGG GAATACATGA ACCCAAAATA TCAATCTCAG
SEQ ID NO：6 :AAAAAGTCCC TCATGTTTGG GAATACATGA ACCCAAAATA TCAATCTCAG
SEQ ID NO：7 :AAAAAGTCCC TCATGTTTGG GAATACATGA ACCCAAAATA TCAATCTCAG
601                                                  650
SEQ ID NO：5 :ATCCAAAAAG AAGGGCTTAA ATTCGGATTG ATTTTAAGCA AGAAAGCAAC
SEQ ID NO：6 :ATCCAAAAAG AAGGGCTTAA ATTCGGATTG ATTTTAAGCA AGAAAGCAAC
SEQ ID NO：7 :ATCCAAAAAG AAGGGCTTAA ATTCGGATTG ATTTTAAGCA AGAAAGCAAC
651                                                  700
SEQ ID NO：5 :GGGAACTTGG GTGTTAGACC AATTGAGTCC GTTTAA 
SEQ ID NO：6 :GGGAACTTGG GTGTTAGACC AATTGAGTCC GTTTAA
SEQ ID NO：7 :GGGAACTTGG GTGTTAGACC AATTGAGTCC GTTTAA 
         表5. VSV新泽西血清型野生型(SEQ ID NO：8)和突变体G22E/M48R+M51R (SEQ ID NO：9)和G22E/L110F/M48R+M51R (SEQ ID NO：10)的M蛋白的氨基酸序列对比
1                      22                         48 50
SEQ ID NO：8 :MSSFKKILGF SSKSHKKSKK LGLPPPYEES SPMEIQPSAP LSNDFFGMED
SEQ ID NO：9 :MSSFKKILGF SSKSHKKSKK LELPPPYEES SPMEIQPSAP LSNDFFGRED
SEQ ID NO：10:MSSFKKILGF SSKSHKKSKK LELPPPYEES SPMEIQPSAP LSNDFFGRED 
51                                                  100
SEQ ID NO：8 :MDLYDKDSLR YEKFRFMLKM TVRANKPFRS YDDVTAAVSQ WDNSYIGMVG 
SEQ ID NO：9 :RDLYDKDSLR YEKFRFMLKM TVRANKPFRS YDDVTAAVSQ WDNSYIGMVG 
SEQ ID NO：10:RDLYDKDSLR YEKFRFMLKM TVRANKPFRS YDDVTAAVSQ WDNSYIGMVG 
101     110                                         150
SEQ ID NO：8 :KRPFYKIIAL IGSSHLQATP AVLADLNQPE YYATLTGRCF LPHRLGLIPP 
SEQ ID NO：9 :KRPFYKIIAL IGSSHLQATP AVLADLNQPE YYATLTGRCF LPHRLGLIPP 
SEQ ID NO：10:KRPFYKIIAF IGSSHLQATP AVLADLNQPE YYATLTGRCF LPHRLGLIPP 
151                                                  200
SEQ ID NO：8 :MFNVSETFRK PFNIGIYKGT LDFTFTVSDD ESNEKVPHVW EYMNPKYQSQ
SEQ ID NO：9 :MFNVSETFRK PFNIGIYKGT LDFTFTVSDD ESNEKVPHVW EYMNPKYQSQ 
SEQ ID NO：10:MFNVSETFRK PFNIGIYKGT LDFTFTVSDD ESNEKVPHVW EYMNPKYQSQ 
201                                                  250
SEQ ID NO：8 :IQKEGLKFGL ILSKKATGTW VLDQLSPFK 
SEQ ID NO：9 :IQKEGLKFGL ILSKKATGTW VLDQLSPFK 
SEQ ID NO：10:IQKEGLKFGL ILSKKATGTW VLDQLSPFK
表6.针对HIV-1蛋白大范围CD8+ T细胞应答和体液免疫应答的小鼠接种研究