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1、(10)申请公布号 CN 104293696 A (43)申请公布日 2015.01.21 CN 104293696 A (21)申请号 201410476303.0 (22)申请日 2014.09.16 CGMCC NO.9353 2014.06.17 C12N 1/20(2006.01) A23K 1/16(2006.01) C12R 1/46(2006.01) (71)申请人 李雪平 地址 100044 北京市海淀区高梁桥斜街 59 号中坤大厦 903 (72)发明人 李雪平 (54) 发明名称 一株粪肠球菌 HEW-A131 及其应用 (57) 摘要 本 发 明 公 开 了 一 株 耐。
2、 热 性 强、 耐 酸 碱 范围宽泛、 抗逆性、 益生性更强的粪肠球菌 (Enterococcus faecalis)HEW-A131， 该 菌 株 已 于 2014 年 6 月 17 日保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为 CGMCC NO.9353， 分类 命 名 为 粪 肠 球 菌 Enterococcus faecalis。粪肠球菌 HEW-A131 具有优良的微生 物学特性、 显著的益生性及抗逆性和超强的发酵 性能， 不但可以提高动物的饲料利用效率， 节约成 本， 而且大大改善了动物体内消化道内环境的稳 态， 促进营养的吸收利用， 促进动物生长， 显著提 。
3、高了动物的生产性能、 免疫性能和繁殖性能， 降低 了生产成本， 提高了经济效益。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 14 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书14页 附图2页 (10)申请公布号 CN 104293696 A CN 104293696 A 1/1 页 2 1. 一株粪肠球菌 (Enterococcus faecalis)HEW-A131， 其保藏编号为 CGMCC NO.9353。 2. 一种如权利要求 1 所述的粪肠球菌 HEW-A131 的培养方法， 其特征在于， 取粪肠。
4、球菌 HEW-A131 种子液 1-5mL， 接种到 300mL 培养基中进行摇瓶发酵培养。 3. 如权利要求 2 所述的培养方法， 其特征在于， 所述培养基由如下组分组成 ： 蔗 糖 1-5 ， 大 豆 蛋 白 胨 0.5-2.5 ， 酵 母 提 取 物 0.1-1.0 ， MgSO47H2O0.05-0.2 ， MnSO44H2O0.01-1.0， NaCl0.1-2.0， 柠檬酸二铵 0.1-0.5， CaCO30.1-1.0， 余量为 水， pH7.00.2。 4. 如权利要求 2 所述的培养方法， 其特征在于， 所述摇瓶发酵的条件为 ： 发酵温度 30-45， 发酵时间 5-20h，。
5、 pH 值 6.5-7.5， 转速为 100-300r/m。 5. 如权利要求 1 所述的粪肠球菌 HEW-A131 在微生态制剂的制备及畜禽养殖过程的应 用。 权 利 要 求 书 CN 104293696 A 2 1/14 页 3 一株粪肠球菌 HEW-A131 及其应用 技术领域 0001 本发明涉及粪肠球菌， 特别涉及一株粪肠球菌 (Enterococcus faecalis) HEW-A131 及其应用。 背景技术 0002 乳酸菌是一类重要的益生菌， 是动物肠道中一类重要的优势菌群。乳酸菌制剂作 为一种新型的绿色动物微生态制剂， 因其无毒、 无抗药性、 无残留、 无副作用而备受饲料界。
6、 的广泛关注。采用乳酸菌作为益生菌饲喂动物， 除了由于乳酸菌具有一定的营养作用和对 肠道的粘附作用外， 主要在于乳酸菌对于一些腐败菌和有害菌具有抑制作用。 第一， 乳酸菌 可以产生乳酸， 创造酸性环境抑制有害菌及不耐酸的腐败菌生长 ； 第二， 乳酸菌产生 H2O2， 激活过氧化氢酶 - 硫氰酸系统， 抑制和杀灭革兰氏阴性菌、 过氧化氢酶阳性细菌等 ； 第三， 部分乳酸菌可以产生抑菌性的细小蛋白质或肽类， 称为细菌素， 对大肠杆菌等致病菌有拮 抗作用。 而且， 有了产生抑菌蛋白的乳酸菌， 就可以生产细菌素， 可以替代抗生素， 使动物生 产更安全。分离筛选可以产生细菌素的乳酸菌成为现在益生菌开发的。
7、研究热点。 0003 粪链球菌又叫粪肠球菌 (Enterococcus faecalis)， 其菌体形态为链球或球状， 菌 体直径大小 0.3m 0.7m， 无芽孢 ； 稀释后在肉汤琼脂平板上形成的菌落圆形、 乳白色， 表面凸起湿润， 有光泽， 边缘整齐， 大多数成双或短链状排列， 通常不运动。粪链球菌是目 前微生物青贮接种剂主要菌种之一， 它经过系列工艺制成的微生物制剂直接投喂养殖动物 后， 有利于改善肠道内微生态平衡， 防治动物肠道菌丛区系紊乱， 还能分解蛋白质为小肽、 合成 B 族维生素等功效。它也能增强巨嗜细胞的活性， 促进动物的免疫反应， 提高抗体水 平。粪链球菌的生理特性有如下几点。
8、 ： (1) 粪链球菌分泌的乳酸为 L 型乳酸， 又称为自然乳 酸或生理乳酸， 可全被动物吸收利用。乳酸杆菌分泌的乳酸 L 型和 D 型都有， 但 D 型则不能 被动物吸收利用。 在动物的肠道里。 粪链球菌可在肠内形成生物薄膜附着在肠道粘膜上， 可 以在肠道内发育、 生长、 繁殖， 繁殖时问很短， 19min 分裂一次。粪链球菌还可把部分蛋白质 分解成酰胺和氨基酸， 把大部分的碳水化合物的无氮浸出物转化为乳酸， 而且能使饲料里 的纤维变软， 所以饲料的转化吸收率就比较高。粪链球菌分解的这些特殊营养成分弥补了 常规饵料的营养缺陷， 对各种养殖动物幼体起到了十分重要的营养强化和促生长作用。 (2)。
9、 粪链球菌产生的抗菌物质大多是肽或蛋白质， 被称为细菌素。 粪链球菌可分泌两类细菌素， 一类仅只是对相关的菌有抑制作用， 抗菌谱较窄， 可阻碍病原微生物接触肠粘膜细胞 ； 另一 类具有广谱抗菌活性， 它们对致病菌如 ： 沙门氏菌、 致贺氏病和假单孢菌都有很好的抑制 作用。所以， 长期在饲料中添加粪链球菌可以减少养殖动物肠炎等疾病的发生。粪链球菌 在生长和代谢过程中产生对养殖动物有益的营养物质， 如乳酸、 氨基酸、 维生素、 酶及抑菌 物质。 在畜禽养殖过程中， 添加了粪链球菌不仅有利于提高饲料的消化率， 同时也相应降低 了排泄物中的氨态氮的浓度， 减少了排泄物的不消化物， 改善了饲养环境， 减。
10、少了污染， 既 有防腐作用又增加饲料的风味， 促进养殖动物的食欲。(3) 由于饲料中饼粕、 麦麸等农副产 品中的植酸磷含量较高， 对钙等矿物质元素利用造成影响， 而在粪链球菌的生理作用下通 说 明 书 CN 104293696 A 3 2/14 页 4 过催化、 水解等反应分泌出的 L- 乳酸， 它可以对钙质合成 L- 乳酸钙， 促进养殖动物对钙质 的吸收。 所以饲料中添加粪链球菌可减少养殖中有机物和矿物质排泄量有效地减少水质污 染。 0004 屎肠球菌 (Enterococcus faecium) 属于肠球菌中的一种， 是兼性厌氧的乳酸菌， 它不仅是人和动物肠道中常见的正常菌种， 还用于改善。
11、食品、 饲料的质量。 屎肠球菌相对于 严格厌氧、 培养保存条件苛刻的双歧杆菌、 乳杆菌来说， 它是便于生产和使用的首选菌种。 1989 年美国 FDA 就公布它为可直接用于动物的菌种之一。大量实验证明， 由屎肠球菌组成 的益生素可提高幼年畜禽的体增重， 改善饲料报酬， 减少腹泻率， 降低死亡率。 另外， 屎肠球 菌代谢产生有机酸、 双乙酰、 过氧化氢、 细菌素等物质， 这些物质具有抑制病原菌和腐败菌、 提高免疫力、 改善畜产品品质等生理功效。 因此， 屎肠球菌在畜牧生产中有着广泛的应用发 展前景。其特性主要有以下几点 ： (1) 耐胃酸 ： 新生仔猪胃内的 pH 值在 5 6 之间， 出生后 。
12、由于高产酸细菌定植而逐渐下降， 数小时后pH值可降到4， 然后缓慢下降， 在2月龄前pH值 仍保持在3左右。 屎肠球菌由于其耐胃酸因此它能通过胃而存活下来。 (2)耐胆盐 ： 哺乳仔 猪胆囊内胆汁分泌量很少， 胆汁量在出生后 3 周内缓慢增加， 小肠内胆盐浓度在 0.03 0.30范围内波动。大量试验表明， 筛选得到的屎肠球菌可耐受 1.0的胆盐浓度， 甚至高 达 3.0和 5 6.5 NaCl 高盐。可见， 屎肠球菌具有良好的耐胆盐性能及对胃肠道逆 性环境的耐受性， 具备了在小肠定植的基本条件。(3) 具有良好的粘附力 ： 屎肠球菌在消化 道中的粘附力仅次干酪乳杆菌。屎肠球菌能顺利通过胃肠不。
13、利环境， 在肠壁上的粘附是其 定植并大量繁殖变成优势种群的前提， 另外， 其对肠上皮细胞有较强的粘附力是其作为益 生菌菌株的重要前提之一。(4) 耐药性与抑菌作用 ： 屎肠球菌具有对广谱抗生素的耐药性。 有试验表明， 屎肠球菌对饲料添加剂中大多数常用抗生素都具有耐药性。除了对抗生素具 有耐药性外， 还对常见病原菌、 强毒菌株有较强的抑制作用， 这与是屎肠球菌代谢过程中产 生乳酸、 乙酸、 异丁酸、 乙醇、 2， 3- 丁二醇、 细菌素等物质有关， 这些物质具有抑制病原菌和 腐败菌的作用。(5) 耐热性 ： 屎肠球菌不仅能抵抗动物胃肠道不利的环境， 而且能耐受饲料 制粒过程中的高温， 但后者往往。
14、是许多益生菌无法达到的， 这就阻碍了益生菌在颗粒饲料 中的广泛利用。 0005 产生细菌素的乳酸菌来源很多， 购买的工业菌株和标准菌株， 有很多也可以产生 细菌素， 环境、 土壤、 泡菜、 酸奶中都可以分离乳酸菌。然而益生菌最后要饲喂动物， 那么相 对于其他来源的菌株， 动物无疑是乳酸菌的最好来源。来自动物肠道的乳酸菌可以适应动 物肠道环境， 耐受动物的胃酸和胆盐的消化， 无疑是最好的益生菌来源。可见， 通过从动物 肠道分离和筛选能够产生细菌素的乳酸菌将是动物用益生菌筛选的重要研究方向。 0006 中 国 专 利 CN 102031235 B 公 开 了 一 种 粪 肠 球 菌 (Entero。
15、coccus faecium) ANSE228， 其保藏编号为 CGMCC No.4082。还提供上述粪肠球菌 ANSE228 在抑制鸡白痢沙门 氏菌和 / 或大肠杆菌和 / 或金黄色葡萄球菌中的应用。所述粪肠球菌 ANSE228 是通过反复 分离、 纯化、 复壮等工艺得到， 具有生物活性强、 益生性显著并且抗逆性能好等优点。 中国专 利 CN 103074281 A 公开了一株粪肠球菌 (Enterococcus faecalis)FJL19， 其保藏编号为 CGMCC No.6995。同时还提供了上述粪肠球菌 FJL19 具有抑制鸡肠道中大肠杆菌生长、 促进 雏鸡生长的作用。从笼养成年蛋鸡。
16、空肠中分离出粪肠球菌 FJL19， 此菌株生长旺盛， 18 小时 培养菌数就可达 5.1109cfu/ml， 且具有抑菌作用， 可以利用培养基生产抑菌蛋白， 降低雏 说 明 书 CN 104293696 A 4 3/14 页 5 鸡肠道大肠杆菌数量 ； 通过此乳酸菌制备菌制剂饲喂雏鸡， 可以提高雏鸡的生长 ； 因此粪 肠球菌 FJL19 在动物饲养尤其是家禽新型饲料添加剂开发和抗生素替代品研究上具有重 大的社会意义和经济价值。 0007 上述公开专利中的粪肠球菌耐热性、 耐酸碱性、 发酵性能、 抑菌性能等还不太理 想， 不能适应日益发展的工业化需求， 尤其离目前饲料工业及畜牧养殖业目标还有一定。
17、差 距， 因此， 分离、 纯化更加适合畜牧业发展需求的益生粪肠球菌菌株仍是本领域技术人员的 责任和追求。 发明内容 0008 本发明所解决的技术问题是克服现有粪肠球菌的缺陷， 提供一株耐热性强、 耐酸 碱范围宽泛、 抗逆性、 益生性更强的粪肠球菌 (Enterococcus faecalis)HEW-A131。 0009 本发明提供的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)HEW-A131是从笼养成年蛋鸡盲 肠内容物中分离的乳酸菌菌株， 经过菌落形态观察、 发酵性能测试、 抑菌性能测试等筛选得 到的目标菌株， 该菌株耐热性强、 耐酸碱范围宽泛、 抗逆性、 益生性更加显著。 001。
18、0 本发明提供的粪肠球菌 (Enterococcus faecalis)HEW-A131 已于 2014 年 6 月 17 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 简称 CGMCC， 地址为 ： 北京市朝 阳区北辰西路 l 号院 3 号中国科学院微生物研究所， 邮政编码 ： 100101)， 保藏编号为 CGMCC NO.9353， 分类命名为粪肠球菌 Enterococcus faecalis。 0011 本发明提供的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)HEW-A131具有以下微生物学特 征 ： 粪肠球 菌 HEW-A131 是革兰氏阳性菌， 在肠球菌琼脂培。
19、养基上生长迅速， 35培养 24h 形成白色、 圆形、 边缘光滑整齐、 凸起、 直径为 1 1.5mm 的菌落， 并且周围有蓝黑色环带， 菌落形态如图 1， 显微镜下菌体呈卵圆形、 成对成链存在、 无芽孢， 兼性厌氧生长， 经革兰氏 染色后菌株形态如图 2 ； 粪肠球菌 HEW-A131 生长适宜温度范围 ： 4 -65， 最适生长温度 ： 20 -45 ； 生长适宜 pH 1.5-11， 最适 pH 值为 6-8。部分生理生化特性如表 1。 0012 本发明中所述粪肠球菌 HEW-A131 的培养方法如下 ： 0013 取粪肠球菌HEW-A131种子液1-5mL(种子液是挑取的单个菌落在种子。
20、液培养基中 培养的， 其活菌浓度以109CFU/mL计 ； 种子液的培养基和培养条件与发酵的培养基和培养条 件相同 )， 接种到 300mL 培养基中， 进行摇瓶发酵培养。 0014 所述培养基由如下组分组成 ： 蔗糖 1-5， 大豆蛋白胨 0.5-2.5， 酵母提取物 0.1-1.0， MgSO47H2O0.05-0.2， MnSO44H2O0.01-1.0， NaCl0.1-2.0， 柠檬酸二铵 0.1-0.5， CaCO30.1-1.0， 余量为水， pH7.00.2 ； 其中， 优选为 ： 蔗糖2.5， 大豆蛋白胨 1.8， 酵母提取物 0.4， MgSO47H2O0.2， MnSO4。
21、4H2O 0.045， NaCl0.2， 柠檬酸二 铵 0.2， CaCO30.6， 余量为水， pH7.002。 0015 所述摇瓶发酵的条件为 ： 发酵温度 30-45， 发酵时间 5-20h， pH 值 6.5-7.5， 转速 为 100-300r/m ； 优选为 ： 发酵温度为 35、 pH 值 7.0、 搅拌转速 180r/m， 发酵时间 7h。 0016 50L 发酵罐中试培养基与摇瓶发酵培养基相同。50L 发酵罐中试发酵条件为 ： 装 液量为 20-40L 培养基， 接种量为 200-600mL 摇瓶种子液， 发酵温度为 30-45， 发酵时间 5-20h， pH 值 6.5-7。
22、.5， 搅拌转速 100-300r/min。其中， 优选为 ： 装液量为 30L 培养基， 接种 量为 300mL， 发酵温度为 35， 发酵时间 8h， pH 值 7.0， 搅拌转速 110r/min。 说 明 书 CN 104293696 A 5 4/14 页 6 0017 本 发 明 粪 肠 球 菌 HEW-A131 具 有 显 著 的 益 生 性， 可 有 效 抑 制 大 肠 杆 菌 (Escherichia coli)、 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、 沙门氏菌 (Salmonella sp.)、 肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella peneumo。
23、niae)、 志贺氏菌属(Shigella sp.)、 韦荣氏球 菌 (Veillonella sp.)、 绿脓杆菌 (Pseudomonas aeruginosa)、 嗜水气单胞菌 (Aeromonas hydrophila)、 多杀性巴氏杆菌 (Pasteurella multocida) 的生长繁殖。 0018 本发明粪肠球菌 HEW-A131 具有较强的抗逆性， 可以耐受模拟胃酸、 模拟胆盐以及 高温环境， 并且能保持 90以上的活菌存活率。 0019 本发明粪肠球菌 HEW-A131 可有效维持动物肠道菌群平衡， 改善肠道性能， 提高动 物生产性能。 0020 本发明粪肠球菌 HEW。
24、-A131 的益生性的检验方法如下 ： 0021 在无菌操作台上， 将病原菌 ( 大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、 沙门氏菌、 肺炎克雷 伯氏菌、 志贺氏菌属、 韦荣氏球菌、 绿脓杆菌、 嗜水气单胞菌、 多杀性巴氏杆菌 ) 浓度为 109CFU/mL 的菌悬液 10mL 与 90mL 与冷却至 45的 NA 固体培养基 ( 灭菌后 ) 混匀， 制备成 厚度 4mm 左右的病原菌 NA 平板， 将灭菌的牛津杯 ( 内径 6mm、 外径 8mm、 高 10mm 的圆形小 管， 管的两端要光滑 ) 放置在培养基上， 轻轻加压， 使其与培养基接触无空隙， 待数分钟后， 分别向各小管中滴加200L的本发明制。
25、备的发酵液， 勿使其外溢， 30-40培养20-36h， 然后测量抑菌圈直径。每个实验三个重复， 取平均值。 0022 其中， 所述病原菌NA平板是将121高温灭菌后的NA培养基与病原菌菌悬液混匀 后， 倒入灭菌后的平板， 冷却后形成表面光滑的 4mm 厚的病原菌 NA 平板。所述 NA 固体培养 基的配方为 ： 蛋白胨 1， 牛肉膏 0.3， 琼脂 2， NaCl 0.5， 余量为水， pH 7.20.2。 0023 本发明粪肠球菌 HEW-A131 抗逆性的检验方法如下 ： 0024 1、 高温耐受试验 ： 取 10mL 本发明制备得到的发酵液注入到试管 1 中， 采用十倍逐 级稀释， 取。
26、 1mL 稀释液在平板上， 将灭菌后冷却至 45的 MRS 琼脂培养基倾注在平板 ( 灭 菌 ) 上， 迅速摇匀。再将装有 10mL 本发明制备得到的发酵液的试管 2 置于 80水浴锅中加 热 15min， 取加热后的粪肠球菌 HEW-A131 发酵液进行十倍逐级稀释， 取 1mL 稀释液在平板 上， 将灭菌后冷却至 45的 MRS 琼脂培养基倾注在平板 ( 灭菌 ) 上并迅速摇匀。最后将加 热前和加热后的平板均在 35条件下培养 24h， 计算粪肠球菌 HEW-A131 加热前后的数量。 0025 2、 模拟胃液及肠液的耐受试验 ： 取 100g/L 的盐酸 16.4mL 加蒸馏水稀释， 使。
27、 pH 值 分别为1.5、 2.5和3.5， 取100mL稀盐酸溶液， 分别加入1g胃蛋白酶， 使其充分溶解， 得模拟 胃液， 微孔滤膜除菌 (0.22m) 备用。取磷酸二氢钾 6.8g， 加水 500mL 使溶解， 用 0.1moL/ L 氢氧化钠溶液调节 pH 值至 6.8 ； 另取胰蛋白酶 10g， 加水适量使溶解， 将两液混合后， 加水 稀释至 1000ml， 得模拟肠液， 微孔滤膜除菌 (0.22m) 备用。取 1mL 粪肠球菌 HEW-A131 发 酵液加入到 9mL 的模拟胃液中 ( 即十倍逐级稀释 )， 并迅速在振荡器上充分混匀， 然后置于 30-45静置培养2-4h。 分别在。
28、1h、 2h、 3h、 4h的时候取出培养液并立即计数残存活菌数， 与 原活菌数进行比较。 0026 3、 模拟胆盐的耐受试验 ： 用胰液素制成 1g/L 的溶液， 并在溶液中加入 0.3的猪 胆盐， 用 10的 Na0H 调整 pH 为 8.0， 然后用 0.45m 微滤膜过滤并除菌。将 0.5mL 粪肠球 菌 HEW-A131 发酵液接种到 4.5mL 模拟胆盐中， 培养 24h 后得到培养液， 计数残存粪肠球菌 HEW-A131 的活菌数， 与原活菌数进行比较。 说 明 书 CN 104293696 A 6 5/14 页 7 0027 模拟胃液及肠液和模拟胆盐耐受试验中的计数方法 ： 0。
29、028 样品用无菌生理盐水十倍梯度稀释， 选择合适的稀释度用于计数。取 1mL 稀释液 于灭菌平板上， 将灭菌后冷却至 45的 MRS 琼脂培养基倾注在平板上， 迅速摇匀， 待平板凝 固后在 35培养 24h。 0029 本发明粪肠球菌 HEW-A131 维持和改善肠道性能的检验方法 ： 0030 选取普通昆明小白鼠 60 只， 雌雄各半， 18-20g， 常规词养。从中随机挑选 40 只， 每 天早晨9:00灌胃盐酸林可霉素0.2mL(20mg)/只， 其它作为对照组， 每天同一时间灌胃等量 灭菌生理盐水， 连续一周， 制备肠道菌群失调的小鼠模型。模型组小鼠饮食下降， 未出现死 亡和明显的腹。
30、泻现象， 排软粪， 外形正常含水分较多， 垫料潮湿。将 40 只肠道菌群失调小 鼠， 随机分为 2 组， 一组 20 只作为粪肠球菌 HEW-A131 治疗组， 每天灌胃本发明制备的发酵 液 0.5ml(21010cfu/mL)/ 只， 另 20 只作为自然恢复组， 与对照组相同处理， 每天同一时间 灌胃等量灭菌生理盐水， 连续两周。整个试验期 21 天， 每天观察小白鼠的生长和排便情况， 于第 8、 21 天对菌株治疗组和自然恢复组的小鼠进行称重， 计算各组体重平均增长率 ； 每 5 天测各组小鼠粪便大肠杆菌数量， 取小鼠粪便约0.1g， 于无菌操作台内加入3粒玻璃珠(以 0.1g 粪样加 。
31、0.5mL 稀释液 )， 稀释并接种麦康凯琼脂培养基， 计算每克湿便中的大肠杆菌 数。 0031 本发明另一目的是所述粪肠球菌 HEW-A131 在微生态制剂的制备及畜禽养殖 过程的应用， 所述微生态制剂是将发酵力强、 益生性显著并且抗逆性能良好的粪肠球菌 HEW-A131， 经过液体深层发酵等生产工艺得到发酵液， 然后经离心、 干燥后制得。 0032 有益效果 ： 0033 1.本发明的粪肠球菌HEW-A131耐热性强(生长适宜温度 ： 4-65， 最适生长温 度 ： 20 -45 ) ； 耐酸碱范围宽泛 ( 生长适宜 pH 1.5-11， 最适 pH 值为 6-8) ； 发酵力强、 生 长。
32、旺盛 ； 经发酵工艺改进和培养基优化， 35发酵 8h， 发酵液活菌数可达到 1.11010CFU/ mL， 更加适合饲料工业和畜禽养殖业发展的迫切需要， 为今后应用过程中降低生产成本、 提 高经济效益奠定了坚实的菌种基础。 0034 2. 本发明的粪肠球菌 HEW-A131 具有显著的益生性， 能显著抑制大肠杆菌 (Escherichia coli)、 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、 沙门氏菌 (Salmonella sp.)、 肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella peneumoniae)、 志贺氏菌属(Shigella sp.)、 韦荣氏球 菌 (Vei。
33、llonella sp.)、 绿脓杆菌 (Pseudomonas aeruginosa)、 嗜水气单胞菌 (Aeromonas hydrophila)、 多杀性巴氏杆菌 (Pasteurella multocida) 等病原菌的生长繁殖， 具有广谱 抑菌性。 0035 3. 本发明的粪肠球菌 HEW-A131 具有较强的抗逆性， 能够耐受模拟胃酸、 模拟胆盐 以及高温环境， 并且能保持较高的活菌存活率， 其活菌存活率可达到 93-99， 更加适合饲 料工业和畜牧养殖业的要求。 0036 4. 本发明中粪肠球菌 HEW-A131 可有效维持动物肠道菌群平衡， 改善肠道性能， 提 高动物生产性能。。
34、经小鼠肠道性能试验， HEW-A131 治疗组小鼠体重平均增长率 (44.78 ) 显著 高于自然恢复组(32.14) ； 饲喂HEW-A131益生菌后肠道大肠杆菌数量显著下降， 降 低 73.32， 显著低于自然恢复组 (24.78 )， 表明 HEW-A131 在小白鼠肠道内迅速定植， 形 成优势菌群， 并有效抑制大肠杆菌等病原菌的生长繁殖。 说 明 书 CN 104293696 A 7 6/14 页 8 0037 5. 本发明的粪肠球菌 HEW-A131 具有优良的微生物学特性、 显著的益生性及抗逆 性和超强的发酵性能， 不但可以提高动物的饲料利用效率， 节约成本， 而且大大改善了动物 。
35、体内消化道内环境的稳态， 促进营养的吸收利用， 促进动物生长， 显著提高了动物的生产性 能、 免疫性能和繁殖性能， 降低了生产成本， 提高了经济效益。在其用量较少， 例如在饲料 中仅为 106CFU/kg 时即可发挥显著作用， 具体表现在 ： 1) 可显著提高种鸡的生产性能及繁 殖性能 ： 与对照组相比， 试验组料蛋比降低 24.81， 死淘率降低 57.14， 种蛋合格率提高 2.02， 种蛋受精率提高2.5， 健雏率提高2.49。 2)可显著提高了肉鸡的生产性能及免 疫性能， 与对照组相比， 料肉比降低 35.77， 死淘率降低 56。3) 可显著提高蛋鸡的生产 性能、 免疫性和鸡蛋品质，。
36、 有效替代抗生素添加剂， 适合大规模推广使用。 其中， 料蛋比抗生 素组降低 14.98， 比普通组降低 25.11； 死淘率比抗生素组降低 13.54， 比普通组降低 34.65 ； 鸡蛋质量指标光泽、 蛋壳厚度、 哈氏单位、 蛋黄颜色明显优于抗生素组和普通组。 4) 可显著提高仔猪的生产性能、 免疫性能和猪舍环境质量， 能有效替代抗生素添加剂， 适合 大规模推广使用。与抗生素组和普通组相比， 其中料重比分别降低 13.73和 25.84 ； 腹 泻率分别降低 43和 66.14 ； 死淘率分别降低 99.19和 99.59 ； 发病率分别降低 4.5 和 21.75 ； 试验组比普通组猪舍。
37、环境指标显著提高。 附图说明 0038 图 1 是粪肠球菌 HEW-A131 在肠球菌琼脂培养基上的菌落形态 ； 0039 图 2 是粪肠球菌 HEW-A131 经革兰氏染色显微镜下的菌株形态 ； 0040 图 3 是粪肠球菌 HEW-A131 发酵液不同处理后的抑菌效果 ； 0041 图中 CK 为培养液， 1 为溶解液， 2 为上清液， 3 为酶解液 ； 0042 图 4 是粪肠球菌 HEW-A131 的生长曲线。 具体实施方式 0043 下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明， 本发明中所用的技术手段 均为本领域技术人员所公知的方法。 另外， 实施方案应理解为说明性的， 而非限制。
38、本发明的 范围， 本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。 对于本领域技术人员而言， 在不背离本 发明实质和范围的前提下， 对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也 属于本发 明的保护范围。 0044 实施例 1 粪肠球菌 HEW-A131 的分离筛选、 鉴定及保藏 0045 1、 乳酸菌的分离纯化 ： 0046 在无菌条件下采集健康笼养成年蛋鸡盲肠肠道内容物 1g， 置于盛有 4.5mL 灭菌生 理盐水的离心管中， 充分震荡混匀， 然后吸取0.5mL混合液于盛有4.5mL灭菌生理盐水的离 心管中， 此稀释度为10-2， 重复以上过程做10倍梯度稀释， 至10-6稀释浓度， 选择。
39、10-410-6 三个稀释度， 吸取 0.1mL 涂布于肠球菌培养基 ( 肠球菌固体培养基 ) 平板上， 平板涂布后采 用厌氧培养法 (5 CO2)， 将涂好的平板于 35培养 24h 后， 用接种环挑取有蓝黑色环带且 形态不同的菌落在MRS固体培养基平板上进行划线分离培养， 经48h培养后， 挑取分离效果 较好的菌落， 用接种环转接于 MRS 斜面培养基上作纯培养， 重复传代纯培养 3 次， 而后置于 4冰箱保存备用。 说 明 书 CN 104293696 A 8 7/14 页 9 0047 2、 菌落形态的观察 0048 将步骤 1 保存的斜面菌种， 经 2-3 次活化， 取干净的载玻片，。
40、 滴一滴无菌水于载玻 片上， 然后挑取1-2接种环的上述活化菌种， 涂匀， 干燥后固定。 革兰氏染色 ： 先用草酸铵结 晶紫染液染色 1-2min， 用水冲洗， 接着滴加卢氏碘液覆盖 1-2min， 用水冲洗， 然后滴加 95 乙醇至乙醇液不再呈现紫色时停止约 30s， 最后用番红染液复染 2-3min， 水洗。镜检选取革 兰氏染色为阳性的球状菌株作为备用。 0049 3、 抑菌性乳酸菌的筛选 ： 0050 (1) 产酸能力测定 ： 将步骤 2 筛选出的革兰氏阳性球状菌株活化 2-3 代后， 按 1 (v/v)的接种量各自接至新鲜的MRS液体培养基中， 35厌氧培养， 分别0h、 24h两个时。
41、间点 用酸度计测各实验菌株 5mL 发酵液的 pH 值。每个实验菌株发酵液作 3 个重复， 取平均值。 用 0h、 24h 两个时间点各实验菌株发酵液的 pH 值变化， 即 pH 来衡量乳酸菌的产酸能力。 选取产酸能力高的乳酸菌发酵液进行下一步测定。 0051 (2) 抑菌试验 ： 取致病菌 ( 大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、 沙门氏菌、 肺炎克雷伯氏 菌、 志贺氏菌属、 韦荣氏球菌、 绿脓杆菌、 嗜水气单胞菌、 多杀性巴氏杆菌)浓度为109CFU/mL 的菌悬液 50mL 与等体积冷却至 45的 NA 固体培养基 ( 灭菌后 ) 混匀， 制备成 4mm 左右的 病原菌 NA 平板若干个， 每个。
42、病原菌 NA 平板在无菌条件下用无菌镊子夹取 4 个灭菌牛津杯 (内径6mm、 外径8mm、 高10mm的圆形小管， 管的两端要光滑)对称放在平皿上， 轻轻加压， 使 其与培养基接触无空隙， 待数分钟后， 然后分别吸取 200L 步骤 (1) 产酸能力高的乳酸菌 发酵液于3个牛津杯中， 另一个牛津杯中加入等量的MRS培养基作为对照， 于35下恒温培 养 28h。每个乳酸菌发酵液做 2 个重复， 用游标卡尺测其抑菌圈直径的大小， 取平均值， 选 择抑菌圈大的乳 酸菌 9 株， 并分别标号为 HEW-A13-1、 HEW-A13-2、 HEW-A13-3、 HEW-A13-4、 HEW-A13-5。
43、、 HEW-A13-6、 HEW-A13-7、 HEW-A13-8、 HEW-A13-9。用接种环转接于 MRS 斜面上作 纯培养， 重复传代纯培养 3 次， 而后置于 4冰箱保存备用， 进行下一步的研究。 0052 4、 产细菌素乳酸菌的筛选 0053 1) 目标菌株的确定 ： 将步骤 3 中筛选获得的 9 个乳酸菌于 MRS 斜面培养基上进行 菌种活化3-4次， 取1-2环转接于装有300mLMRS液体培养基的摇瓶中35培养18h， 转速为 180r/m， 对培养液用 1mol/L NaOH 溶液调节 pH 值至 6.8， 然后分别吸取 200L 培养液替代 上述步骤(2)中的产酸能力高的。
44、乳酸菌发酵液， 采用上述步骤(2)的抑菌试验方法， 选择抑 菌圈最大的乳酸菌 HEW-A13-1 为本发明筛选的目标乳酸菌， 暂时命名为乳酸菌 HEW-A131。 0054 2) 抑菌蛋白的确认 ： 将步骤 1)HEW-A13-1 培养液中加入硫酸铵至到培养液中不再 有沉淀析出， 收集沉淀和上清液， 将沉淀透析、 去盐后溶于与上清液等体积的超纯水， 均匀 混合， 得溶解液， 取适量溶解液加入 0.1mg/mL 的蛋白酶 37酶解 2h。取培养液、 上清液、 溶 解液、 酶解液做抑菌试验， 结果如图 3 所示。进一步确定乳酸菌 HEW-A131 发酵产生的抑菌 物质为抑菌蛋白。 0055 所述肠。
45、球菌固体培养基组成为 ： 胰蛋白胨 1.7， 牛肉膏 0.3， 酵母膏 0.5， 牛胆 粉 ( 盐 )1， 氯化钠 0.5， 柠檬酸三钠 0.1， 七叶苷 ( 灵 )0.1， 柠檬酸铁铵 0.05， 叠 氮化钠 0.025， 琼脂 1.8， 余量为水， pH7.10.2。 0056 所述 MRS 固体或斜面培养基组成为 ： 葡萄糖 2， 蛋白胨 1， 酵母提取物 0.5， 柠檬酸二铵 0.2， 醋酸钠 0.5， 牛肉膏 1， 吐温 -80 0.1， K2HPO40.2， MgSO47H2O 说 明 书 CN 104293696 A 9 8/14 页 10 0.0058， MnSO44H2O0.。
46、025， 琼脂粉 1.5， 余量为水， pH 7.00.2。 0057 所述 MRS 液体培养基组成为 ： 葡萄糖 2， 蛋白胨 1， 酵母提取物 0.5， 柠檬酸 二铵 0.2， 醋酸钠 0.5， 牛肉膏 1， 吐温 -80 0.1， K2HPO40.2， MgSO4 7H2O0.0058， MnSO44H2O0.025， 余量为水， pH 7.00.2。 0058 所述 NA 固体培养基组成为 ： 蛋白胨 1， 牛肉膏 0.3， 琼脂 2， NaCl 0.5， 余 量为水， pH7.20.2。 0059 5、 菌株属的鉴定 0060 对 HEW-A131 菌株进行生理生化鉴定， 过氧化氢酶。
47、试验、 硝酸盐还原试验、 明胶液 化试验、 吲哚试验和硫化氢试验均为阴性， 表明 HEW-A131 菌株为乳酸菌属。通过马尿酸盐 水解试验、 精氨酸水解试验、 4和 65生长试验， 及各类糖发酵试验， 结果与 常见细菌系 统鉴定手册 和 乳酸细菌的分类鉴定 对照。鉴定结果显示 HEW-A131 菌株为粪肠球菌。 0061 表 1 粪肠球菌 HEW-A131 部分生理生化特性 0062 鉴定项目HEW-A131鉴定项目HEW-A131 革兰氏染色+乳糖+ 接触酶-麦芽糖- 氧化酶-蔗糖+ 4生长+山梨糖+ 65生长+鼠李糖- 耐 6.5 NaCl+棉籽糖- 0.04亚碲酸钾+木糖- 精氨酸双水解。
48、酶+甘露醇+ 葡萄糖+山梨醇+ 阿拉伯糖-蜜二糖- 棉籽糖-松三糖+ 0063 0064 注 ：“+” 表示反应阳性 ；“-” 表示反应阴性。 0065 6、 16SrDNA 测序测定 0066 采用 CTAB 法提取 HEW-A131 菌株基因组 DNA。利用引物 F 和 R 对 HEW-A131 菌株的 16S rDNA 基因片段进行 PCR 扩增， PCR 扩增体系 (25L) 包括引物 F 和 R 各 1.0L， TaqDNA 聚合酶 1.5U， 10Taq buffer2.5L， Mg2+(25mmoL/L)1.5L， 菌株基因组 DNA50ng。反应 条件为 ： 94预变性 5min， 94变性 40s， 53退火 1min， 72延伸 1min30s， 共 30 个循环， 72温浴 10min。反应结束后取 3L PCR 产物在 1琼脂糖凝胶上进行电泳检测。所得 PCR 产物回收纯化， 送生物工程 ( 上海 ) 有限公司进行 DNA 序列的测定。将所测得的序列 与 GenBank 中的 16S rDNA 序列进行 BLAST 分析比对， 可以看出菌株 HEW-A131 与粪肠球菌 的同源性达到 99.93。通过菌株 HEW-A131 的形态特征、 生理生化特征、 16SrDNA 特征， 确 定菌株 HEW-A131 为。