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1、(10)申请公布号 CN 104293703 A (43)申请公布日 2015.01.21 CN 104293703 A (21)申请号 201410487660.7 (22)申请日 2014.09.22 CGMCC No.9465 2014.07.16 C12N 1/20(2006.01) C12P 1/04(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 中国农业科学院农产品加工研究所 地址 100193 北京市海淀区圆明园西路 2 号 中国农业科学院农产品加工所科研楼 1 号楼 (72)发明人 吕加平 张书文 刘鹭 薛海晓 逄晓阳 芦晶 (74)专利代理机构 北京。
2、纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 陈晓庆 (54) 发明名称 一种高产紫色杆菌素的兰黑紫色杆菌及其应 用 (57) 摘要 本发明公开了一种高产紫色杆菌素的兰黑紫 色杆菌及其应用。该兰黑紫色杆菌被命名为 ZSJ， 已于 2014 年 7 月 16 日保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为 CGMCC No.9465， 经发酵培养即可产生紫色杆菌素。发酵 培养基的溶质及浓度为 ： 蛋白胨 8.0 12.0g/L、 牛肉粉2.04.0g/L、 氯化钠4.06.0g/L、 葡萄 糖为0.51.5g/L ； 发酵培养基的PH为48 ； 发 酵培养的温度是 7 。
3、30、 时间为 48h 240h。 该菌株分泌生产的紫色杆菌素属纯天然色素， 没 有人工色素潜在的危害， 有很好的广谱抗菌性、 抗 病毒性、 抗肿瘤等生物活性， 可广泛应用于医学、 工业等各领域中。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图4页 (10)申请公布号 CN 104293703 A CN 104293703 A 1/1 页 2 1. 一种高产紫色杆菌素的兰黑紫色杆菌 (Janthinobacterium li。
4、vidum)， 该菌株被命 名为 ZSJ， 已于 2014 年 7 月 16 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为 CGMCC No.9465。 2.权利要求1所述兰黑紫色杆菌(Janthinobacterium lividum)在制备紫色杆菌素中 的应用。 3. 一种生产紫色杆菌素的方法， 包括如下步骤 ： 首先对权利要求 1 中所述兰黑紫色杆 菌进行发酵培养 ； 再用有机溶剂提取紫色杆菌素。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于 ： 所述发酵培养基中溶质及其浓度为 ： 蛋白 胨 8.0 12.0g/L、 牛肉粉 2.0 4.0g/L、 氯化钠 4.0 6.0。
5、g/L、 葡萄糖为 0.5 1.5g/L， 溶剂为水 ； 具体为蛋白胨10.0g、 牛肉粉3.0g、 氯化钠5.0g、 葡萄糖1.0g， 使用蒸馏水定容至 1000mL。 5.根据权利要求3 或4所述的方法， 其特征在于 ： 所述发酵培养基的PH为48 ； 具体 为 7。 6.根据权利要求3-5任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述发酵培养时间为48h240h ； 具体为 168h。 7. 根据权利要求 3-6 任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述发酵培养温度为 7 30； 具体为 21。 8. 根据权利要求 3-7 任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述提取紫色杆菌素的有机溶剂 为无水甲醇。
6、或无水乙醇或无水异丙醇或无水四氢呋喃 ； 具体为无水甲醇。 9. 权利要求 3-8 任一所述的方法在生产紫色杆菌素中的应用。 权 利 要 求 书 CN 104293703 A 2 1/5 页 3 一种高产紫色杆菌素的兰黑紫色杆菌及其应用 技术领域 0001 本发明涉及微生物发酵领域， 具体涉及一种高产紫色杆菌素的兰黑紫色杆菌及其 应用。 背景技术 0002 色素一般分为人工合成色素和天然色素。 人工合成色素是指用化学合成方法所制 得的有机色素， 主要是从煤焦油中提取或以苯、 甲苯、 萘、 苯胺等芳烃类化合物为原料合成。 因性能优异、 价格低廉、 使用方便而占据色素市场的绝对优势。但由于其存在安。
7、全性问题， 各国使用合成色素的产品品种在逐渐减少。 0003 天然色素是利用自然界存在的物质或培养方法生产得到的次生代谢物质进行一 定加工而制成， 具有无毒副作用、 安全可靠、 色调自然和大多具备一定的营养价值等优点， 其开发利用越来越受到各领域人们的广泛认可。 目前天然色素主要以红、 黄色调为主， 兰紫 色素非常稀少， 因此加快对兰紫色素的开发研究具有重要意义。 天然色素的主要来源为 ： 植 物、 动物、 微生物。利用微生物资源生产天然色素， 克服以动植物为原料生产天然色素受季 节、 气候、 产地等诸多因素限制的缺点， 并且易于工业化。因此采用微生物生产天然色素将 逐渐成为天然色素来源的主流。
8、。 0004 紫色杆菌素(violacein,略写为Vio)是细菌合成的一种次级代谢产物， 由两个色 氨酸分子氧化缩合而成， 属于吲哚衍生物。自 19 世纪首次从紫色色杆菌中发现这一色素以 来， 又有不同的产紫色杆菌素的微生物陆续被发现。人们对紫色杆菌素的生物活性进行了 大量的探索， 目前很多实验已证明紫色杆菌素具有很强的生物活性 ： (1) 抗原生动物活性 ； (2) 光谱抗菌性 ； (3) 抗病毒性 ； (4) 抗肿瘤细胞 ； (5) 其他功能， 如能抗可见光辐射。另外 还可代替合成色素作染料， 对天然原料和合成原料具有很好的着色效果。 发明内容 0005 本 发 明 的 一 个 目 的 。
9、是 提 供 一 种 高 产 紫 色 杆 菌 素 的 兰 黑 紫 色 杆 菌 (Janthinobacterium lividum)。 0006 上述所述的兰黑紫色杆菌被命名为ZSJ， 已于2014年7月16日保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为 CGMCC No.9465。 0007 本发明的另一个目的是提供一种兰黑紫色杆菌在制备紫色杆菌素中的应用。 0008 本发明还有一个目的是提供一种生产紫色杆菌素的方法。 0009 上述所述的方法， 包括如下步骤 ： 首先将兰黑紫色杆菌进行发酵培养 ； 再用有机 溶剂提取紫色杆菌素。 0010 上述方法中， 所述的发酵培养基的溶。
10、质及其浓度为 ： 蛋白胨 8.0 12.0g/L、 牛肉 粉 2.0 4.0g/L、 氯化钠 4.0 6.0g/L、 葡萄糖为 0.5 1.5g/L， 溶剂为水。 0011 上述方法中， 所述的发酵培养基具体为蛋白胨 10.0g、 牛肉粉 3.0g、 氯化钠 5.0g、 葡萄糖 1.0g， 使用蒸馏水定容至 1000mL。 说 明 书 CN 104293703 A 3 2/5 页 4 0012 上述方法中， 所述发酵培养基的 PH 为 4 8 ； 具体为 7。 0013 上述方法中， 所述发酵培养时间为 48h 240h ； 具体为 168h。 0014 上述方法中， 所述发酵培养温度为 7 。
11、30 ； 具体为 21。 0015 上述方法中， 所述提取紫色杆菌素的有机溶剂为无水甲醇或无水乙醇或无水异丙 醇或无水四氢呋喃 ； 具体为无水甲醇。 0016 本发明最后一个目的是提供上述任一所述的方法在生产紫色杆菌素中的应用。 0017 本发明的兰黑紫色杆菌 (Janthinobacterium lividum)， 保藏编号为 CGMCC No.9465。 该兰黑紫色杆菌经发酵培养即可产生紫色杆菌素。 该菌株分泌的紫色杆菌素属纯 天然色素， 没有人工色素潜在的危害， 有很好的广谱抗菌性、 抗病毒性、 抗肿瘤等生物活性， 可广泛应用于医学、 工业等各领域中。 附图说明 0018 图 1 为兰黑。
12、紫色杆菌 (Janthinobacterium lividum) 保藏号 9465 的分离培养基 上菌落图。 0019 图 2 为兰黑紫色杆菌 (Janthinobacterium lividum) 保藏号 9465 的液体培养基 静置培养图。 0020 图 3 为兰黑紫色杆菌 (Janthinobacterium lividum) 保藏号 9465 的液体培养基 摇床培养图。 0021 图 4 为兰黑紫色杆菌 (Janthinobacterium lividum) 保藏号 9465 在光学显微镜 下照片。 0022 图 5 为兰黑紫色杆菌 (Janthinobacterium lividum。
13、) 保藏号 9465 产生的色素酸 碱稳定性结果。图 5A 为紫色杆菌素在不同 PH 的甲醇溶液中的颜色变化 ； 图 5B 为紫色杆菌 素在不同 PH 的甲醇溶液中置于自然光下照射 36h 后的颜色变化。 0023 图 6 为紫色杆菌素在不同溶剂中的溶解程度及颜色。 0024 图 7 为兰黑紫色杆菌 (Janthinobacterium lividum) 保藏号 9465 产生的色素的 主要成分 HPLC 分离图谱。为紫色杆菌素 ； 为脱氧紫色杆菌素。 0025 图 8 为兰黑紫色杆菌 (Janthinobacterium lividum) 保藏号 9465 色素主要成分 ( ) 的核磁氢谱谱。
14、图。 0026 图 9 为紫色杆菌素粗产品图。 0027 图 10 为紫色杆菌素的分子结构图。 具体实施方式 0028 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0029 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0030 实施例 1、 菌株的分离与鉴定 0031 一、 分离 0032 1、 样品采集 0033 从北京市昌平区小汤山火鸡老店采集关中羊奶， 迅速冷藏， 送回实验室进行实验。 0034 2、 菌株的分离和筛选 说 明 书 CN 104293703 A 4 3/5 页 5 0035 配制分离培养基 ： 胰蛋白胨 5.0g、 酵母浸膏 。
15、2.5g、 葡萄糖 1.0g、 脱脂奶粉 1.0g， 使 用蒸馏水定容至 1000ml， 加入 18.0g 琼脂， 80水浴溶解。准备干净平皿若干， 用废旧报纸 包好。将培养基及平皿 121灭菌 15min。灭菌后， 将培养基及平皿保温至 50 60。 0036 将样品用生理盐水进行10倍梯度的稀释， 取10-2、 10-3、 10-4梯度的样品液1.0ml 分别加入灭菌后的平皿中， 再倒入2025ml保温着的培养基， 混匀、 待凝。 倒置平板于7 培养箱， 培养 10 天。 0037 培养后观察发现有兰紫色单菌落， 挑取该菌落， 进行划线分离。重复划线分离， 直 至为单一纯菌株 ( 如图 1。
16、 所示 )。将上述获得的菌株命名为 ZSJ。 0038 二、 鉴定 0039 1、 形态鉴定 0040 液体培养基 ： 胰蛋白胨 5.0g、 酵母浸膏 2.5g、 葡萄糖 1.0g、 脱脂奶粉 1.0g， 使用蒸 馏水定容至 1000ml， 121灭菌 15min。 0041 将菌株ZSJ接种于液体培养基， 菌株于液体培养基静置培养(图2)， 摇床培养如图 3 所示。培养 48h 后， 挑取单菌落， 做革兰氏染色实验， 在光学显微镜下观察见图 4。 0042 结果表明 ： 在分离培养基的平皿上， 菌落呈深蓝紫色， 圆形， 表面光滑， 边缘整齐 ； 显微镜观察该菌株呈短杆状， 无芽孢、 荚膜， 。
17、无鞭毛， 不运动， 无孢子， 革兰氏阳性。 0043 2、 分子鉴定 0044 采用北京天根生化科技有限公司的 TIANnamp Bacteria 细菌基因组 DNA 提 取试剂盒提取本发明筛选的 ZSJ 菌株的基因组 DNA。以获得的 ZSJ 菌株基因组 DNA 为 模 板， 采 用 下 述 引 物 PCR 扩 增 菌 株 ZSJ 的 16s rDNA 序 列。 引 物 序 列 如 下 ： 27f ： 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ； 1492r ： 5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。 0045 PCR 反应条件 ： 0046 0047 0048 扩增反应完。
18、毕后， 取10L的PCR产物加样于琼脂糖凝胶点样孔中进行电泳， 电压 140V/cm。电泳后， 紫外灯下观察， 可见到约为 1500bp 的条带。 0049 将 PCR 扩增产物送至华大基因进行 DNA 测序。测得的序列如 SEQ ID NO.1 所示。 用 BLAST 程序与美国国立生物技术信息中心数据库中已报道的细菌 16s rDNA 序列进行 相似性比较分析。结果表明 ： SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列与 Genbank 中兰黑紫色杆菌 Janthinobacterium lividum BR01 同源性为 99。 0050 综合以上鉴定结果， 菌株ZSJ为兰黑紫色杆菌(Jan。
19、thinobacterium lividum)。 该 菌株已于2014年7月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。 地址 ： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所 ； 邮编 ： 100101 ； 保藏号 ： CGMCC 说 明 书 CN 104293703 A 5 4/5 页 6 No.9465。 0051 实施例 2、 菌株 ZSJ 产色素 0052 1、 菌株 ZSJ 的发酵培养 0053 发酵培养基 ( 营养肉汤培养基 ) 成分 ： 蛋白胨 10.0g、 牛肉粉 3.0g、 氯化钠 5.0g、 葡萄糖 1.0g， 使用蒸馏水定容至 1000mL， 121。
20、灭菌 15min， 发酵培养基的 pH 值为 7。按 2 接种量， 将活化后的菌株ZSJ接种于发酵培养基， 21培养168h， 离心(4000rpm， 20min)， 弃 上清液， 收集沉淀物。 0054 2、 色素的提取 0055 在沉淀物中加入无水甲醇， 用旋涡混合器将其混匀， 然后在超声波清洗器中最大 功率常温震荡 1h， 将振荡液离心 (10000rpm， 10min)， 得到色素的甲醇溶液。若仍有色素残 留在细胞残渣中， 可重复上述操作步骤， 直至不再提取出色素为止。 0056 3、 色素得率的计算 0057 将提取出的色素的甲醇溶液收集于已恒重的收集瓶中， 40旋转蒸干， 恒重 (。
21、 如 图9所示)。 将色素提取完后， 称量剩余细胞残渣的干重， 换算出相应的细胞浓度， 并计算色 素得率 ( 色素得率色素干重 / 初始发酵液体积 )。实验设 3 次重复， 结果取平均数。结果 表明 ： 色素得率为 2.8g/L( 混合物中约 90为紫色杆菌素 )。 0058 实施例 3、 菌株 ZSJ 所产色素的物理化学特性检测 0059 1、 光稳定性 0060 将3ml未经干燥的色素甲醇溶液加入至透光性较好的10ml玻璃试管中， 用封口膜 密封以防甲醇挥发， 分别置于自然光下照射0h、 3h、 7h、 10h、 14h， 每种处理重复3次。 结果表 明色素经 10h 光照射后， 兰紫色消。
22、失， 变为淡黄色。 0061 2、 酸碱稳定性 0062 向2ml未经干燥的色素甲醇溶液(PH为7.5)中分别加入0.1mol/L HCl或0.1mol/ LNaOH， 调节 PH 为 ： 3、 5、 7、 9、 11、 12、 12.5、 13、 13.5， 观察颜色变化如图 5A 所示。然后将不 同PH的色素甲醇溶液置于自然光下照射36h， 各不同PH的色素甲醇溶液颜色均不同程度变 浅， 如图 5B 所示。图 5A 和 5B 中从左到右 PH 依次为 3、 5、 7、 9、 11、 12、 12.5、 13、 13.5。 0063 3、 热稳定性 0064 将 10ml 未经干燥的色素甲醇。
23、溶液置于玻璃试管中进行煮沸蒸干， 再用甲醇复溶， 以未经热处理的色素甲醇溶液为对比， 进行高效液相色谱分析， 结果出峰时间无差异， 说明 色素热稳定性良好。 0065 4、 色素在不同溶剂中的溶解性及溶解颜色 0066 真空冷冻干燥制得的色素干粉， 分别用甲醇、 乙醇、 异丙醇、 丙酮、 四氢呋喃、 乙酸 乙酯、 水、 石油醚、 正辛烷复溶， 观察色素在不同溶剂中的溶解度及颜色。 结果表明所得兰紫 色色素在不同的溶剂中溶解度不同， 且颜色各异。色素易溶于甲醇、 乙醇、 异丙醇、 丙酮、 四 氢呋喃， 微溶于水、 乙酸乙酯， 不溶于石油醚和正辛烷。色素在不同溶剂中颜色如图6 所示。 0067 实。
24、施例 4、 紫色杆菌素的分离及结构分析 0068 1、 紫色杆菌素的分离 0069 采用高效液相色谱(HPLC)的方法对实施例2中获得的色素粗溶液进行分离纯化。 使用 Agilent-1200 高效液相色谱仪， 色谱柱为 Agilent Eclipse XDB-C18， 150mm4mm， 说 明 书 CN 104293703 A 6 5/5 页 7 5m。柱温为 30； 流动相为 70的甲醇 - 水体系 ( 甲醇与水的体积比为 70:30) ； 流速为 1.0mL min-1 ； 检测波长为 570nm。谱图如图 7( 为紫色杆菌素， 保留时间为 2.640min ； 为脱氧紫色杆菌素， 保。
25、留时间为 4.082min) 所示。 0070 2、 紫色杆菌素的核磁共振分析 0071 对色素 ( 图 7) 进行核磁共振分析。1H 共振频率为 600.17MHz， 溶剂为 DMSO， 在 室温下进行数据采集。采样点数为 32768， 全过程用时 6.5min。得到如谱图 8 所示的核磁 谱图结果。谱图 8 较清晰的给出了色素主要成分各位置的 H 的化学位移， 通过与文献中紫 色杆菌素的化学位移值比对 ( 表 1)， 得到相应的结构信息。 0072 由于方法和参考文献一样， 通过 H 化学位移图的对比， 可知兰黑紫色杆菌 (Janthinobacterium lividum)保藏号9465。
26、主要成分化合物是紫色杆菌素。 该色素结构式 如图 10 所示。 0073 表 1 组分与已报道的紫色杆菌素核磁氢谱化学位移数据比较 0074 说 明 书 CN 104293703 A 7 1/2 页 8 0001 序 列 表 CN 104293703 A 8 2/2 页 9 0002 序 列 表 CN 104293703 A 9 1/4 页 10 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 104293703 A 10 2/4 页 11 图 5 说 明 书 附 图 CN 104293703 A 11 3/4 页 12 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 104293703 A 12 4/4 页 13 图 8 图 9 图 10 说 明 书 附 图 CN 104293703 A 13 。