异羟肟酸类化合物及其制备方法和应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104292134 A (43)申请公布日 2015.01.21 CN 104292134 A (21)申请号 201410530422.X (22)申请日 2014.10.10 C07C 259/06(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 广东药学院 地址 510006 广东省广州市大学城外环东路 280 号 (72)发明人 冯冰虹 张菘 黄伟斌 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 陈卫 (54) 发明名称 异羟肟酸类化合物及其制备方法和应用 (57) 摘要 本发明涉及药物化学的技术领域， 具。

2、体 公开了异羟肟酸类化合物及其制备方法和 应用， 本发明还公开了所异羟肟酸类化合物 在药学上可接受的盐和药学上可接受的溶剂 合物。所述异羟肟酸类化合物的结构式为 ： 。所述异羟 肟酸类化合物在抗神经胶质瘤 （细胞株为 U251、 MGR2、 U373） 或肺癌 （细胞株为 SPC、 LTEP、 H1650） 等方面的效果比现有的SAHA 和 N25 的更好。 所述 制备方法具有产率高、 纯度高， 对环境的影响小等 优点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 9 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书9页 附图2页 (。

3、10)申请公布号 CN 104292134 A CN 104292134 A 1/2 页 2 1. 异羟肟酸类化合物及其药学上可接受的盐、 药学上可接受的溶剂合物， 其特征在于， 所述异羟肟酸类化合物具有以下结构式 ： 。 2. 根据权利要求 1 所述异羟肟酸类化合物及其药学上可接受的盐、 药学上可接受的溶 剂合物， 其特征在于， 所述药学上可接受的盐由异羟肟酸类化合物与无机酸、 有机酸、 无机 碱或有机碱进行化学反应得到。 3. 根据权利要求 1 所述异羟肟酸类化合物及其药学上可接受的盐、 药学上可接受的溶 剂合物， 其特征在于， 所述药学上可接受的溶剂合物的为水、 乙醇、 丙醇、 丁醇、 。

4、乙二醇、 丙二 醇、 聚乙二醇或丙酮。 4. 一种权利要求 1 所述异羟肟酸类化合物的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： S1. 将辛二酸酐溶解于 CH2Cl2后， 在冰浴条件下， 加入苯胺类原料反应后， 经过滤、 提 纯得到第一中间产物 ； S2. 将第一中间产物溶解于四氢呋喃， 加入三乙胺， 在冰浴条件下， 加入氯甲酸异丁酯 反应得到第二中间产物 ； S3. 在冰浴条件下， 将羟胺溶液加入到第二中间产物中， 反应后经旋蒸、 提纯得到所述 异羟肟酸类化合物 ； S1 中所述第一中间产物的结构式为 ： ； S2 中所述第二中间产物的结构式为 ： 。 5. 根据权利要求 4 所述异羟肟酸。

5、类化合物的制备方法， 其特征在于， S1 中所述的辛二 酸酐由辛二酸在醋酸酐的条件下加热反应得到。 权 利 要 求 书 CN 104292134 A 2 2/2 页 3 6. 根据权利要求 4 所述异羟肟酸类化合物的制备方法， 其特征在于， S1 中第一中间产 物的提纯步骤包括 ： 将过滤得到的滤饼溶于碱性溶液后再过滤得到碱性滤液， 再调节碱性 滤液的 pH 为 5 6 后再次过滤得到第一中间产物。 7. 根据权利要求 4 所述异羟肟酸类化合物的制备方法， 其特征在于， S3 中所述异羟肟 酸类化合物的提纯步骤包括 ： S31. 将旋蒸获得的残余物溶于 pH 为 5 6 的盐酸溶液中， 过滤得。

6、到析出物， 再将析出 物置于饱和碳酸氢钠溶液中搅拌， 过滤、 洗涤、 干燥得到粗产物 ； S32. 将 S31 中的粗产物置于水中， 加热并加入乙醇， 待粗产物溶解后过滤、 滤液静置 析出所述异羟肟酸类化合物。 8. 权利要求 1 所述异羟肟酸类化合物及其药学上可接受的盐、 药学上可接受的溶剂合 物在制备抗癌药物中的应用。 9. 根据权利要求 8 所述应用， 其特征在于， 癌症为神经胶质瘤或肺癌。 10. 根据权利要求 9 所述应用， 其特征在于， 神经胶质瘤的细胞株为 U251、 MGR2、 U373， 肺癌的细胞株为 SPC、 LTEP、 H1650。 权 利 要 求 书 CN 10429。

7、2134 A 3 1/9 页 4 异羟肟酸类化合物及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及药物化学的技术领域， 更具体的， 涉及异羟肟酸类化合物及其制备方 法和应用。 背景技术 0002 近年来， 组蛋白去乙酰化酶抑制剂 (histone deacetylase inhibitors, HDACi)， 已成为抗肿瘤药物的研究热点之一。目前， HDACi 主要包括异羟肟酸类、 环状四肽类、 短链 脂肪酸类、 苯甲酰胺类、 亲电酮类、 三硫代碳酸等。其中， 异羟肟酸类 HDACi 是最早发现且迄 今研究最广泛的一类， 其抑酶作用强， 结构简单， 合成容易。 0003 异肟羟酸类 HDAC。

8、i 的结构多由环、 脂肪链和异羟肟酸三部分组成， 分别对应 HDACi 的表面识别区、 连接区和金属结合区 ( 锌结合区 )。其中 ： 金属离子结合区能很好的与活性 部位的锌离子直接作用是产生抑制活性所必须的， 并与管道底部及周边的组氨酸和酪氨酸 等残基形成氢键， 通常能与锌离子配位的基团有羟肟酸、 巯基、 环氧酮或亲电酮等。连接区 则恰好和狭窄的通道充分接触， 通常为线性的饱和或不饱和碳链， 或苯环、 芳杂环。研究表 明连接区的碳原子个数对酶的活性也有着重要影响， 一般为 5-6 个较为合适， 有利于金属 结合区与管道底部的锌离子有效接触， 增强抑酶的活性。表面识别区也与抑制剂的活性相 关，。

9、 并且在对 HDACs 亚型选择性抑制剂中发挥不可估量的作用， 其应适宜地与通道的边缘 残基紧密接触， 一般是疏水性基团， 大多数是取代的芳环、 芳杂环、 环肽等。 0004 许多研究已表明 HDAC 异常导致的组蛋白乙酰化的状态失衡与肿瘤的发生和发展 有着密切关系。 HDACi主要是通过改变组蛋白的乙酰化程度来改变染色质结构， 从而达到调 控基因表达的目的。 HDACi比传统的细胞毒性抗肿瘤药有明显的特点和优势 ： HDACi可引起 肿瘤细胞的生长停滞， 分化或凋亡 ； HDACi 抑制肿瘤作用对多种肿瘤细胞都有明显的效果， 对血液系统肿瘤和实体瘤的治疗作用在体内体外实验中均得到证实 ； 对。

10、其他药物产生耐药 性的肿瘤细胞， 对其仍然有较好的反应性， 并且它作用有一定的肿瘤特异性， 对一些正常细 胞并不引起生长停滞或凋亡。 0005 异肟羟酸类 HDACi 较为成功的代表 SAHA， 作为首个 HDACi 于 2006 年 10 月被美国 FDA 批准上市， 并用于治疗转移性皮肤 T 细胞淋巴瘤， 但在近年的研究中， 发现其存在生物 利用度较差、 对 HDACs 的亚型选择性不强的缺陷， 以及出现一些严重的毒性反应， 所以 SAHA 仍值得人们在已有的基础上探索寻求更优秀的化合物。 0006 目前， 对于进入临床研究阶段的 HDACi， 除了考察单独用药的疗效外， 更多的研究 是将。

11、 HDACi 与其他不同作用机制的抗肿瘤药物以及临床上常用的细胞毒药物联合使用。研 究已发现， HDACi 能够增加肿瘤细胞对化疗药物、 干扰素和放射治疗的敏感度， 所以联合用 药成为了肿瘤治疗的新趋势。因此， 通过筛选得到的候选 HDACi， 也将有希望运用于临床的 研究与治疗中， 这将有着一个广泛的应用前景。 发明内容 说 明 书 CN 104292134 A 4 2/9 页 5 0007 本发明要解决的技术问题在于克服现有异羟肟酸类化合物的不足， 提供一种异羟 肟酸类化合物及其药学上可接受的盐、 药学上可接受的溶剂合物。 0008 本发明要解决的另一技术问题在于提供一种所述异羟肟酸类化合。

12、物的制备方法。 0009 本发明要解决的另一技术问题在于提供所述异羟肟酸类化合物及其药学上可接 受的盐、 药学上可接受的溶剂合物的应用。 0010 本发明要解决的技术问题通过以下技术方案实现 ： 所述异羟肟酸类化合物， 具有以下结构式 ： 。 0011 所述异羟肟酸类化合物及其药学上可接受的盐由所述异羟肟酸类化合物与无机 酸、 有机酸、 无机碱或有机碱进行化学反应得到。 0012 进一步地， 所述无机酸或有机酸选自 ： 盐酸、 氢溴酸、 氢碘酸、 硫酸、 硝酸、 碳酸、 磷 酸、 高氯酸、 醋酸、 柠檬酸、 草酸、 乳酸、 苹果酸、 水杨酸、 酒石酸、 甲磺酸、 乙磺酸、 苯磺酸、 取 代的苯。

13、磺酸、 异烟酸、 油酸、 鞣酸、 泛酸、 抗坏血酸、 丁二酸、 马来酸、 龙胆酸、 富马酸、 葡萄糖 酸、 糖醛酸、 葡萄糖二酸或蔗糖酸、 甲酸、 苯甲酸、 谷氨酸、 双羟萘酸、 山梨酸。所述无机碱或 有机碱选自 ： 氢氧化钠、 氢氧化钾、 氢氧化锂、 氢氧化铁、 氢氧化钙、 氢氧化钡、 氢氧化铝、 氢 氧化镁、 氢氧化锌、 氨水、 氢氧化有机季铵盐、 碳酸钠、 碳酸钾、 碳酸锂、 碳酸钙、 碳酸钡、 碳酸 镁、 碳酸化有机季铵盐、 碳酸氢钠、 碳酸氢钾、 碳酸氢锂、 碳酸氢钙、 碳酸氢钡、 碳酸氢镁、 碳 酸氢化有机季铵盐。 0013 所述异羟肟酸类化合物及其药学上可接受的溶剂合物， 具体地。

14、， 所述溶剂合物为 所述异羟肟酸类化合物与常用的溶剂以共价键、 氢键、 离子键、 范德华力、 络合、 包合等形成 的稳定物质。所述溶剂为水、 乙醇、 丙醇、 丁醇、 乙二醇、 丙二醇、 聚乙二醇或丙酮。 0014 一种所述异羟肟酸类化合物的制备方法， 所述制备方法先将辛二酸酐在二氯甲烷中与苯胺类原料发生酰化反应得到辛二酸单 酰苯胺化合物 ； 然后在四氢呋喃、 三乙胺催化下与氯甲酸异丁酯反应制成混合酸配 ； 最后 在甲醇中， 室温下与羟胺发生氨解， 得到所述异羟肟酸类化合物。具体地， 所述制备方法包 括以下步骤 ： S1. 将辛二酸酐溶解于 CH2Cl2后， 在冰浴条件下， 加入苯胺类原料反应后。

15、， 经过滤、 提 纯得到第一中间产物 ； S2. 将第一中间产物溶解于四氢呋喃， 加入三乙胺， 在冰浴条件下， 加入氯甲酸异丁酯 反应得到第二中间产物 ； S3. 在冰浴条件下， 将羟胺溶液加入到第二中间产物中， 反应后经旋蒸、 提纯得到所述 异羟肟酸类化合物 ； S1 中所述第一中间产物的结构式为 ： 说 明 书 CN 104292134 A 5 3/9 页 6 ； S2 中所述第二中间产物的结构式为 ： 。 0015 具体地， 所述制备方法的反应过程如下 ： 进一步地， S1 中所述的辛二酸酐由辛二酸在醋酸酐的条件下加热反应得到。 0016 进一步地， S1 中第一中间产物的提纯步骤包括 。

16、： 将过滤得到的滤饼溶于碱性溶液 后再过滤得到碱性滤液， 再调节碱性滤液的 pH 为 5 6 后再次过滤得到第一中间产物。 0017 进一步地， S3 中所述异羟肟酸类化合物的提纯步骤包括 ： S31. 将旋蒸获得的残余物溶于 pH 为 5 6 的盐酸溶液中， 过滤得到析出物， 再将析出 物置于饱和碳酸氢钠溶液中搅拌， 过滤、 洗涤、 干燥得到粗产物 ； S32. 将 S31 中的粗产物置于水中， 加热并加入乙醇， 待粗产物溶解后过滤、 滤液静置 析出所述异羟肟酸类化合物。 0018 一种所述异羟肟酸类化合物及其药学上可接受的盐、 药学上可接受的溶剂合物在 制备抗癌药物中的应用。 0019 所。

17、述癌症为神经胶质瘤或肺癌。 0020 所述神经胶质瘤的细胞株为 U251、 MGR2、 U373， 肺癌的细胞株为 SPC、 LTEP、 H1650。 0021 进一步地， 所述抗癌药物为癌细胞增殖抑制剂、 HDAC 活性抑制剂、 癌细胞凋亡促进 剂、 癌细胞自噬促进剂中的一种或几种。 0022 与现有技术相比， 本发明具有以下有益效果 ： 1. 本发明所述异羟肟酸类化合物在抗神经胶质瘤 （细胞株为 U251、 MGR2、 U373） 或肺癌 （细胞株为 SPC、 LTEP、 H1650） 方面的效果比现有的 SAHA 和 N25 的更好。 0023 2. 本发明所述制备方法的优点在于 ： 在。

18、 S1 中合成辛二酸单酰苯胺类化合物时， 采用二氯甲烷为溶剂， 先将辛二酸酐溶于二 氯甲烷， 然后低温下滴加苯胺类化合物， 生成辛二酸单酰苯胺类化合物， 由于辛二酸单酰苯 胺类化合物难溶于二氯甲烷， 因此反应完成后可以将产品过滤出来， 而母液可以继续使用， 说 明 书 CN 104292134 A 6 4/9 页 7 不会影响收率， 大大减少了溶剂和原料的投入， 减少了成本开支并且降低了对环境的影响。 0024 由于N-单酰化物溶解于NaOH， S1中利用化合物之间溶解度不同进行碱提酸沉， 此 法可以除去反应中产生的副产物 N- 二酰化物。 0025 在 S2 中使用氯甲酸异丁酯参与反应生成混。

19、合酸酐， 较现有的合成路线中采用氯 甲酸乙酯来说， 反应活性并没有降低， 但其毒性远远小于氯甲酸乙酯。 0026 在 S3 中通过重结晶提纯可以使产物纯度达到 96% 以上。与现有方法相比， 所述 重结晶提纯操作简单、 使用溶剂多为水溶剂， 对实验人员和环境毒性较小， 得到产物的纯度 高。 附图说明 0027 图 1 为 N3F 对 U251 细胞 Caspase-3、 Caspase-9、 Belcin-1 和 Bcl-2 表达的影响 ； 图 2 为 N4I 对 SPC 细胞 Caspase-3、 Caspase-9、 Belcin-1 和 Bcl-2 表达的影响。 具体实施方式 0028 。

20、下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。除非特别说明， 本发明实施例 中采用的原料和方法为本领域常规市购的原料和常规使用的方法。 0029 异羟肟酸类化合物的制备与表征 以下各个实施例中使用的相同的仪器和药品如下 ： 质谱由Waters UPLC/Q-TOF micro MS获得 （美国Waters公司） 。 红外光谱使用Spectrum 100 傅立叶变换红外光谱仪 PerkinElmer（KBr 压片） 。熔点测定使用北京泰克仪器有限公 司的熔点仪。 0030 原料、 试剂及溶剂等一般从下列供应商购买 ： Aladdin Chemistry Co.Ltd ； 广州市 齐云生物技术有限公。

21、司 ； 广州化学试剂厂 ； 天津市富宇精细化工有限公司 ； 天津市永大化 学试剂有限公司 ； 国药集团化学试剂有限公司。 0031 以下各实施例的异羟肟酸类化合物的简称、 对应的中英文名称和原料的中英文名 称如下表所示。 说 明 书 CN 104292134 A 7 5/9 页 8 0032 实施例 1 N-(4- 正丁基苯基 )-N- 羟基辛酰胺 （N4B） 的制备方法 一种 N-(4- 正丁基苯基 )-N- 羟基辛酰胺的制备方法， 包括以下步骤 ： S1. 辛二酸酐的合成 往烧瓶中加入 30g 辛二酸和 36ml 乙酸酐， 加热回流 4h 后减压旋蒸去除乙酸和过量的 乙酸酐， 得白色蜡状固。

22、体 ； 然后用 20 30ml 乙睛重结晶后， 得到 26.1 28.8 克白色辛二 酸酐， 放入干燥皿中保存待用。辛二酸酐的收率为 87% 96%， 熔点为 51.2 53.6。 0033 S2. 酰胺开环反应 往装有 100ml 二氯甲烷的 500ml 烧瓶中加入 7.8 克辛二酸酐， 搅拌使辛二酸酐溶解 ； 冰浴使溶液降至 0左右， 缓慢滴加 9 克 4- 正丁基苯胺 （为保证辛二酸酐反应充分， 4- 正丁 基苯胺稍微过量， 剩余的4-正丁基苯胺会留在母液中供下次反应使用） ， 滴加完毕后继续搅 拌12h， 待有大量白色固体析出后， 进行真空抽滤， 然后用0左右的二氯甲烷洗涤滤饼 ； 将。

23、滤饼干燥后加入 2mol/L 的 NaOH 溶液中溶解， 然后再次抽滤， 收集滤液， 并往滤液中加入 2mol/L HCl 调节滤液的 pH 至 5 6， 得到第一中间产物 （即辛二酸单酰苯胺类化合物） ， 烘 干保存待用。 说 明 书 CN 104292134 A 8 6/9 页 9 0034 S3. 混合酸酐的制备 500ml 烧瓶加入 10g 的辛二酸单酰 4- 正丁基苯胺， 3ml 三乙胺 (10mmol) 和 100ml 无水 四氢呋喃， 冰浴搅拌下滴加 8ml 氯甲酸异丁酯， 搅拌 1 2h， 得到第二中间产物 （即混合酸 酐） 。 0035 S4. 异羟肟酸类化合物的粗产物制备 。

24、取 6g 盐酸羟胺溶于无水甲醇， 加入 8ml 三乙胺， 得到羟胺 ； 将羟胺置于冰浴后缓慢滴 到混合酸酐中， 搅拌 2 3h 后旋干溶剂， 然后用 1mol/L 的 HCl 溶液溶解残余物， 调节 pH 至 5 6， 待析出固体后过滤 ； 将析出固体置于饱和碳酸氢钠溶液中搅拌 15min 后， 抽滤， 滤饼 用水洗涤， 干燥后得粗产物。 0036 S5. 粗产物的提纯 利用重结晶提纯方法， 将 S4 中的粗产物加入热水中水浴加热， 在加热过程中加入无 水乙醇， 让粗产物充分溶解后趁热过滤除去杂质， 静止缓慢析出晶体， 得到纯度为 96% 的 N-(4- 正丁基苯基 )-N- 羟基辛酰胺。 0。

25、037 实施例 2 6 所述化合物的制备方法与实施例 1 的制备方法的区别仅使用的苯胺 类原料不同， 其余反应工艺与操作步骤均相同。 0038 在上述各个实施例中粗产物的制备和提纯实验中发现， 实施例 1 6 制备的异羟 肟酸类化合物在水、 乙醇等溶剂中的稳定性良好， 非强酸或者强碱的条件下 ( 即 3PH10) 可以保持化学结构的稳定性。 0039 实施例 1 实施例 6 制备的异羟肟酸类化合物的表征 实施例 1 N4B 1H NMR (500 MHz, DMSO) 10.32 (s, 1H), 9.75 (s, 1H), 8.64 (s, 1H), 7.47 (d, 1H), 7.08 (。

26、d, 2H), 3.32 (s, 2H), 2.51 (d, 4H), 2.23 (d, 1H), 1.94 (t, 2H), 1.52 (dd, 4H), 1.28 (d, 6H), 0.94 (dt, 3H). MS m/z 319.2 (M-H)-. 熔 点 : 127.5-129.9C. 纯度 : 97.41%. Calcd for 摩尔质量 .: 320.43, C18H28N2O3: C, 67.47; H, 8.81; N, 8.74; O, 14.98 实施例 2 N4I 1H NMR (500 MHz, DMSO) 10.32 (s, 1H), 9.75 (s, 1H), 8。

27、.64 (d, 1H), 7.48 (d, 1H), 7.14 (d, 2H), 3.32 (s, 1H), 2.82 (hept, 1H), 2.50 (dt, 2H), 2.26 (t, 2H), 1.52 (d, 4H), 1.38 1.09 (m, 10H). MS m/z: 307.2 (M + H)+. 熔点 : 139.4-141.8C. 纯度 : 98.15%. Calcd for : 摩尔质量 .: 306.4. C17H26N2O3: C, 66.64; H, 8.55; N, 9.14; O, 15.67 实施例 3 NS 1H NMR (500 MHz, DMSO) 1。

28、1.80 (s, 1H), 10.38 (s, 1H), 8.23 6.75 (m, 8H), 5.76 (s, 1H), 3.33 (s, 1H), 2.50 (dt, 4H), 1.18 (t, 8H). MS m/z: 385.17 (M + H)+. 熔点 : 136.5-137.8C. 纯度 : 98.98%. Calcd for 摩尔质量 .: 384.43. C21H24N2O5: C, 65.61; H, 6.29; N, 7.29; O, 20.81 实施例 4 N2E 1H NMR (500 MHz, DMSO) 10.32 (s, 1H), 8.64 (s, 1H), 7。

29、.88 (d, 1H), 7.01- 6.93 (d, 3H), 4.07 (d, 2H), 3.32 (s, 1H), 2.47 (dd, 2H), 1.94 (s, 2H), 1.74 说 明 书 CN 104292134 A 9 7/9 页 10 1.12 (m, 11H) MS m/z 307.1 (M-H)-. 熔点: 120.1-121.9C. 纯度: 95.78%. Calcd for 摩尔质量 .: 308.37. C16H24N2O4: C, 62.32; H, 7.84; N, 9.08; O, 20.75 实施例 5 N3F 1H NMR (500 MHz, DMSO) 。

30、10.32 (s, 1H), 8.65 (s, 1H), 8.16 (d, 1H), 7.74 (d, 1H), 7.53 (dd, 1H), 3.32 (s, 1H), 2.48 (ddd, 2H), 1.94 (t, 2H), 1.67- 1.53 (ddd, 4H), 1.29 (dd, 4H). MS m/z 365.1 (M-H)-. 熔点 : 127.9-129.2C. 纯度 : 97.59%. Calcd for 摩尔质量 .: 366.76. C15H18ClF3N2O3: C, 49.12; H, 4.95; Cl, 9.67; F, 15.54; N, 7.64; O, 1。

31、3.09 实施例 6 N24 1H NMR (500 MHz, Acetone) 10.32 (s, 1H), 8.65 (d, 1H), 8.39 (d, 1H), 7.93 7.65 (m, 2H), 3.98 (s, 3H), 3.33 (s, 1H), 2.69 2.33 (m, 2H), 1.93 (d, 2H), 1.66 1.41 (m, 4H), 1.27 (dd, 4H). MS m/z: 304.15 (M + H)+. 熔点 : 145.8-146.9C. 纯度: 95.16%. Calcd for 摩尔质量: 339.34. C15H21N3O6: C, 53.09; 。

32、H, 6.24; N, 12.38; O, 28.29 2. 异羟肟酸类化合物的应用 以下实施例为实施例1实施例6的异羟肟酸类化合物对癌细胞的体外药效学实验及 结果。 0040 以下实施例的对照药为 ： SAHA ： N- 羟基 -N - 苯基 - 辛二酰胺 ； N25 ： N-(2,5- 二甲氧基苯基 )-N- 羟基辛二酰胺， 。 0041 实施例 7 对癌细胞的增殖抑制实验 选用 3 株胶质瘤细胞株 ： U251、 MGR2、 U373， 3 株肺癌细胞株 ： SPC、 LTEP、 H1650， 以及正 常人细胞 LO2、 MRC5， 采用 CCK-8 法对细胞进行抗增殖实验考察。 004。

33、2 分别取生长状态良好的细胞接种于 96 孔板， 细胞密度为 104个 / 孔， 预将实施 例 1 实施 6 的异羟肟酸类化合物、 对照药 SAHA 和 N25 均作用于同一细胞， 每个药物的每 组浓度分别设置 3 个复孔。所述每个药物的给药浓度均依次为 ： 0.1umol/L、 1.0umol/L、 1.5umol/L、 3umol/L、 7.5umol/L、 15umol/L、 30.0umol/L。 说 明 书 CN 104292134 A 10 8/9 页 11 0043 具体步骤为 ： 培养细胞， 待细胞贴壁后， 进行加药处理， 给药处理 48h 后， 各孔加入 10uL CCK-8。

34、溶液， 摇匀后放入细胞培养箱孵育1h， 然后在酶标仪的450nm处测定吸光度值。 结果见表 1 和表 2。 0044 结果表明 ： 不同异羟肟酸类化合物对不同肿瘤细胞株的敏感性不同。在胶质瘤细 胞株中， N3F 和 N2E 对 U251、 MGR2 胶质瘤细胞的抗增殖效果和对 HDAC 活性的抑制效果都比 N25 和 SAHA 强 ； 同时 N3F 和 N2E 与 SAHA 和 N25 对比均对人正常细胞的毒性小。在肺癌细胞 株中， N4I 对 SPC、 LTEP、 H1650 肺癌细胞的抗增殖效果和对 HDAC 活性的抑制效果都比 N25 和 SAHA 强， 表现出较强的敏感性， 而对正常人。

35、细胞毒性较小。从中选择 U251、 SPC 细胞株做 后续实验。 0045 表 1 抗胶质瘤细胞增殖、 HDAC 的抑制活性和毒性评价 表 2 抗肺癌细胞增殖、 HDAC 的抑制活性和毒性评价 实施例 8 对癌细胞凋亡蛋白或自噬蛋白表达的影响以及相互作用的应用 取处于对数生长期的细胞， 按 3106个 /mL 密度接种于直径 10cm 细胞培养皿中， 每孔 说 明 书 CN 104292134 A 11 9/9 页 12 6ml， 待细胞贴壁后， 吸走孔内培养基， U251 细胞中， N3F 给药组浓度为 ： 3umol/L、 阳性对照 SAHA组 （3umol/L） ， 阴性对照组 ； 而S。

36、PC细胞中， N4I给药组浓度为 ： 1.50umol/L、 阳性对照 组 SAHA 组 （1.50umol/L） ， 阴性对照组。最终培养基总体积为 6ml， 于 37、 5%CO2培养箱孵 育。 给药处理48h后， 收集细胞。 按蛋白提取试剂盒提取蛋白， 并进行蛋白定量。 进行ELISA 试剂盒的实验。 0046 结果如图 1 和图 2 所示， 在 U251、 SPC 细胞中， N3F 和 N4I 能明显提升 Caspase-3、 Caspase-9、 Belcin-1 的蛋白表达， 同时能降低 Bcl-2 的表达 ； 抑制 Caspase-3、 Caspase-9 后能明显提升 Beclin-1 的表达量。 说 明 书 CN 104292134 A 12 1/2 页 13 图 1 说 明 书 附 图 CN 104292134 A 13 2/2 页 14 图 2 说 明 书 附 图 CN 104292134 A 14 。