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1、(10)申请公布号 CN 104312929 A (43)申请公布日 2015.01.28 CN 104312929 A (21)申请号 201410584234.5 (22)申请日 2014.10.27 CGMCC No ： 9461 2014.07.15 C12N 1/14(2006.01) C12P 7/64(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 山东广博生物技术服务有限公司 地址 251200 山东省德州市禹城市高新区富 华街 (72)发明人 黎丽 窦光朋 干昭波 霍文严 魏巍 (74)专利代理机构 济南金迪知识产权代理有限 公司 37219 代理人。
2、 朱家富 (54) 发明名称 一株高产 DHA 裂殖壶菌菌株及其培养方法与 应用 (57) 摘要 本发明涉及一株高产 DHA 裂殖壶菌菌株及 其培养方法与应用。裂殖壶菌 (Schizochytrium sp.)BLCY-01， 2014 年 07 月 15 日保存于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号中国科学院微 生物研究所， 保藏编号为CGMCC No ： 9461。 本发明 还涉及该菌株的培养方法与应用。本发明经过培 养基组分和培养条件的优化， 发酵 54 72h 后裂 殖壶菌的生物量达到 30 45g/L， DHA 含量达到 8。
3、.6 12.5g/L， 较现有专利和文献报道的微生物 发酵产量高。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 (10)申请公布号 CN 104312929 A CN 104312929 A 1/1 页 2 1. 一株裂殖壶菌 (Schizochytrium sp.)BLCY-01， 2014 年 07 月 15 日保存于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址 ： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学 院微生物研究所， 保藏编号为 CGMCC No ： 。
4、9461。 2.权利要求1所述裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)BLCY-01的培养方法， 其特征在于， 步骤如下 ： (1) 将裂殖壶菌 (Schizochytrium sp.)BLCY-01 接种于活化培养基中， 20 30活化 培养 24 48h， 制得活化菌株 ； (2)取步骤(1)制得的活化菌株， 接种于种子液体培养基中， 在2030、 200240r/ min 条件下， 培养 24 48h， 制得裂殖壶菌 (Schizochytrium sp.)BLCY-01 菌液。 3. 如权利要求 2 所述的培养方法， 其特征在于， 所述活化培养基每升组分如下 ： 葡萄糖 30g。
5、， 蛋白胨 10g， 酵母浸粉 5g， 海水晶 15g， 水定容至 1L， pH 自然。 4. 如权利要求 2 所述的培养方法， 其特征在于， 所述种子液体培养基每升组分如下 ： 葡萄糖 30， 蛋白胨 10， 酵母浸粉 5， 海水晶 15， 磷酸氢二钾 1.5， 无水硫酸镁 0.5， 大豆油 0.3， 水定容至 1L， pH 自然。 5. 权利要求 1 所述裂殖壶菌 (Schizochytrium sp.)BLCY-01 在制备 DHA 中的应用。 6. 如权利要求 5 所述的应用， 其特征在于， 步骤如下 ： I、 取上述制备的裂殖壶菌 (Schizochytrium sp.)BLCY-0。
6、1 菌液， 按体积百分比 5 10接种于液体发酵培养基中， 在温度2528、 通气量0.30.5vvm、 pH5.07.0的条 件下， 搅拌发酵 40 50h， 流加碳源溶液和氮源溶液， 使发酵罐中的碳源浓度为 10 20g/ L， 氮源浓度为 0.8 1.2g/L， 然后在温度 20 25、 通气量 0.3 0.5vvm 的条件下， 继续 发酵培养 6 24h， 制得发酵液 ； 所述的液体发酵培养基每升组分如下 ： 碳源 30 90g、 氮源 1 10g、 海水晶 15 50g， 水定容至 1L， pH 为 4.5 7.5 ； II、 取步骤 I 制得的发酵液， 经固液分离， 取沉淀， 经菌。
7、体破碎、 DHA 提取、 纯化， 制得 DHA。 7. 如权利要求 6 所述的应用， 其特征在于， 所述步骤 I 中的搅拌速度为 180 220rpm ； 优选的， 所述步骤 I 中继续发酵培养的搅拌速度为 100 150rpm。 8. 如权利要求 6 所述的应用， 其特征在于， 所述步骤 I 中流加碳源溶液的质量浓度为 50g/L。 9. 如权利要求 6 所述的应用， 其特征在于， 所述步骤 I 中流加氮源溶液的质量浓度为 3g/L。 10. 如权利要求 6 所述的应用， 其特征在于， 所述步骤 I 中碳源选自 ： 葡萄糖、 甘油或果 糖 ； 氮源选自 ： 蛋白胨、 酵母浸粉、 玉米浆粉、 。
8、豆粕粉、 硝酸钠或硫酸铵。 权 利 要 求 书 CN 104312929 A 2 1/8 页 3 一株高产 DHA 裂殖壶菌菌株及其培养方法与应用 技术领域 0001 本发明涉及一株高产 DHA 裂殖壶菌菌株及其培养方法与应用， 属于微生物技术领 域。 背景技术 0002 随着现代生活习惯和饮食文化的发展演变， 人们对食品保健的认识和要求也在不 断提高， 其中多不饱和脂肪酸 (Polyunsaturated fatty acids， PUFAs) 对人类健康重要性 的认识已经达到白热化的程度。而二十二碳六烯酸 (DHA)， 分子式为 C22H32O2， 作为 -3 系 列多不饱和脂肪酸 (PU。
9、FA) 中的重要一员而倍受青睐。研究表明 ： DHA 含有五个不饱和键的 特殊结构， 因此， 对人体健康有重要的生理功能。 例如 ： 调节血脂、 调节免疫系统和预防及治 疗心血管疾病、 癌症等功能 ； 另外， DHA 还是人体大脑皮层和视网膜中的主要物质， 具有促 进婴儿大脑合成、 提高记忆力、 增进智力等重要作用。DHA 还能提高鱼苗的繁殖率和抗病性 能。市面上的 DHA 来源主要是鱼油， 但鱼油资源非常短缺， 因此， 开发新的 DHA 微生物资源 成为近年来的研究热点。 0003 裂殖壶菌 (Schizochytrium sp.)， 又称裂弧藻， 是一种海洋真菌， 属于真菌中的卵 囊菌纲、。
10、 水霉目、 脆霉壶菌科、 裂殖壶菌属。该菌种由于 DHA 含量高、 几乎不含 EPA、 质量稳 定、 脂肪酸组成易被人体利用、 不含鱼腥味、 不受重金属污染等优点， 拥有替代鱼油 DHA 的 绝对优势。其中裂殖壶菌是由于其生长迅速、 DHA 含量高、 易于扩大培养等优势成为目前发 酵法生产 DHA 研究最多的一种海洋真菌。食品与药品管理局 (FDA) 规定婴幼儿食品中 DHA 只能选择藻类 DHA 油脂。 0004 Kw Fan等人以葡萄糖和酵母浸提物为碳、 氮源培养裂殖壶菌DHA产量达到2.79g/ L ； T.Yokocki 等在摇瓶中采用多种碳源和氮源对裂殖壶菌进行优化培养， 得到的最高。
11、 DHA 的产量为 4g/L ； 0005 中国专利文献CN1648233A(申请号200410075426.X)公开了一种海洋真菌裂殖壶 菌 OUC88 的工业应用， 经过 DES 诱变筛选一株突变株， 通过补加碳源进行发酵， 工艺优化后 细胞干重为 25g/L， DHA 含量 8.27g/L， 以上菌株和培养条件下 DHA 含量都不是很高。因此， 选育生产性能稳定和 DHA 产量较高的发酵菌株， 并对其培养工艺进一步优化来提高 DHA 产 量是急需攻克的问题。 发明内容 0006 本发明针对现有 DHA 发酵产量低的不足， 提供一株高产 DHA 裂殖壶菌菌株及其培 养方法与应用。该菌株发酵。
12、 DHA 的产量可较原始菌株提高 60， 发酵液中的裂殖壶菌的生 物量可达到 30-45g/L， DHA 含量可达到 8.6-12.5g/L。 0007 为了实现以上发明目的， 本发明采用如下技术方案 ： 0008 一株裂殖壶菌 (Schizochytrium sp.)BLCY-01， 2014 年 07 月 15 日保存于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址 ： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科 说 明 书 CN 104312929 A 3 2/8 页 4 学院微生物研究所， 保藏编号为 CGMCC No ： 9461。 0009 裂殖壶菌菌落及细胞形态 ： 裂殖壶菌 B。
13、LCY-01 在筛选平板培养基上， 25培养 2-3d， 菌落直径为 10-25um， 乳白色， 圆形， 色泽光滑， 无凸起 ； 发酵液中培养细胞聚集成颗 粒存在 ； 细胞显微形态 ： BLCY-01 细胞为圆形或椭圆形， 胞内有明显的颗粒状物质， 细胞主 要采用二分裂方式进行繁殖， 多形成二分体、 四分体和八分体等细胞， 菌体细胞多聚集成 团， 在分裂末期形成游动孢子的孢子囊， 继而释放游动孢子， 孢子卵圆形。 0010 筛选平板培养基(g/L) ： 葡萄糖20， 酵母膏5， 蛋白胨5， 海水晶15， 琼脂20， 另加青 霉素和链霉素 200mg/L。 0011 上述裂殖壶菌 (Schizo。
14、chytrium sp.)BLCY-01 的培养方法， 步骤如下 ： 0012 (1) 将裂殖壶菌 (Schizochytrium sp.)BLCY-01 接种于活化培养基中， 20 30 活化培养 24 48h， 制得活化菌株 ； 0013 (2) 取步骤 (1) 制得的活化菌株， 接种于种子液体培养基中， 在 20 30、 200 240r/min 条件下， 培养 24 48h， 制得裂殖壶菌 (Schizochytrium sp.)BLCY-01 菌液。 0014 根据本发明优选的， 所述活化培养基每升组分如下 ： 0015 葡萄糖 30g， 蛋白胨 10g， 酵母浸粉 5g， 海水晶 。
15、15g， 水定容至 1L， pH 自然。 0016 根据本发明优选的， 所述种子液体培养基每升组分如下 ： 0017 葡萄糖 30g， 蛋白胨 10g， 酵母浸粉 5g， 海水晶 15g， 磷酸氢二钾 1.5g， 无水硫酸镁 0.5g， 大豆油 0.3g， 水定容至 1L， pH 自然。 0018 上述裂殖壶菌 (Schizochytrium sp.)BLCY-01 在制备 DHA 中的应用， 步骤如下 ： 0019 I、 取上述制备的裂殖壶菌 (Schizochytrium sp.)BLCY-01 菌液， 按体积百分比 510接种于液体发酵培养基中， 在温度2528、 通气量0.30.5vv。
16、m、 pH 5.07.0 的条件下， 搅拌发酵 40 50h， 流加碳源溶液和氮源溶液， 使发酵罐中的碳源浓度为 10 20g/L， 氮源浓度为 0.8 1.2g/L， 然后在温度 20 25、 通气量 0.3 0.5vvm 的条件下， 继续发酵培养 6 24h， 制得发酵液 ； 0020 所述的液体发酵培养基每升组分如下 ： 0021 碳源 30 90g、 氮源 1 10g、 海水晶 15 50g， 水定容至 1L， pH 为 4.5 7.5 ； 0022 II、 取步骤 I 制得的发酵液， 经固液分离， 取沉淀， 经菌体破碎、 DHA 提取、 纯化， 制 得 DHA。 0023 根据本发明。
17、优选的， 所述步骤 I 中的搅拌速度为 180 220rpm。 0024 根据本发明优选的， 所述步骤 I 中继续发酵培养的搅拌速度为 100 150rpm。 0025 根据本发明优选的， 所述步骤 I 中流加碳源溶液的质量浓度为 50g/L。 0026 根据本发明优选的， 所述步骤 I 中流加氮源溶液的质量浓度为 3g/L。 0027 根据本发明优选的， 所述步骤I中碳源选自 ： 葡萄糖、 甘油或果糖 ； 氮源选自 ： 蛋白 胨、 酵母浸粉、 玉米浆粉、 豆粕粉、 硝酸钠或硫酸铵。 0028 上述菌体破碎、 DHA 提取、 纯化步骤均可采用本领域常用技术。 0029 有益效果 0030 1、。
18、 本发明以从裂殖壶菌原始菌株出发， 经过传统的紫外诱变和光复活交替处理的 方法， 通过高浓度的丙二酸和碘乙酸选择性筛选获得一株生长快速、 DHA 含量高的新裂殖壶 菌 BLCY-01。 说 明 书 CN 104312929 A 4 3/8 页 5 0031 2、 本发明经过培养基组分和培养条件的优化， 发酵5472h后裂殖壶菌的生物量 达到 30 45g/L， DHA 含量达到 8.6 12.5g/L， 较现有专利和文献报道的微生物发酵产量 高。 0032 3、 本发明采取玉米浆粉等粗放碳源、 氮源替代精细原料蛋白胨和酵母浸粉， 原料 的粗细搭配使用， 不仅提高了裂殖壶菌 DHA 的产量， 而。
19、且很大程度上降低了生产成本。 0033 4、 本发明采用的裂殖壶菌生产的脂肪酸组成比较简单， 饱和脂肪酸以棕榈酸为 主， 不饱和脂肪酸中 DHA 含量占 90左右， 除了有少数的 DPA 之外， 基本不含 EPA。 具体实施方式 0034 下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述， 但本发明所保护范围不限于 此。 0035 实施例 1 ： 裂殖壶菌 BLCY-01 的诱变选育 0036 本发明所述的裂殖壶菌 (Schizochytrium sp.)BLCY-01 的野生菌株分离自山东 青岛市黄海水域， 将预先经过滤膜除菌的海水置于灭好的培养基中， 用松花粉做诱饵， 20 30培养 2 3d。
20、， 用花粉在平板上划线并培养至菌落产生， 挑取单菌落反复划线直至获得 细胞形态一致的纯培养物， 并接种于试管和甘油管保存， 获得裂殖壶菌 (Schizochytrium sp.)BLCY-01 的野生菌株。 0037 筛选培养基每升组分如下 ： 0038 葡萄糖 20g， 酵母膏 5g， 蛋白胨 5g， 海水晶 15g， 青霉素 200mg， 链霉素 200mg。 0039 通过紫外诱变和光复活交替处理的手段对裂殖壶菌 (Schizochytrium sp.) BLCY-01 的野生菌株进行诱变选育， 最终获得一株性能稳定的 DHA 高产菌株裂殖壶菌 (Schizochytrium sp.)B。
21、LCY-01， 诱变选育步骤如下 ： 0040 (I) 取裂殖壶菌 (Schizochytrium sp.)BLCY-01 的野生菌株的试管斜面种子 1 环 接种于盛有 50mL 种子培养基的 500mL 三角瓶中， 20-30， 220r/min 振荡培养 36h， 然后按 照 5 (v/v) 的接种量接种于新鲜的种子培养基中， 20-30， 220r/min 振荡培养 24h， 使细 胞进入对数生长期。无菌水洗涤离心制成适宜浓度 (OD600在 0.3-1.0 之间 ) 的菌悬液。 0041 种子培养基每升组分如下 ： 0042 葡萄糖 30g， 蛋白胨 10g， 酵母浸粉 5g， 海水晶。
22、 15g， 磷酸氢二钾 1.5g， 无水硫酸镁 0.5g， 大豆油 0.3g， 水定容至 1L， pH 自然。 0043 (II) 将菌悬液于无菌培养皿中 ( 带磁棒 )， 用距离 25-30cm 的 10-30W 紫外灯照射 150s， 将照射后的菌悬液在 20-30、 220r/min 条件下振荡培养 12-18h， 梯度稀释后进行平 板涂布， 每个稀释度做 3 个平行， 在 20-30恒温培养箱中暗室培养 2-3d， 待长出单菌落后 计算致死率， 具体步骤如下 ： 0044 取试管斜面种子或甘油管种子接种于盛有 50mL 种子培养基的 500mL 三角瓶中， 20-30， 220r/mi。
23、n 振荡培养 36h， 然后按照 5 (v/v) 的接种量接种于新鲜的种子培养基 中， 20-30， 220r/min 振荡培养 24h， 使细胞进入对数生长期。无菌水洗涤离心 2 次制成适 宜浓度 (OD600 在 0.3-1.0 之间 ) 的菌悬液。加 5ml 上述的菌悬液于无菌培养皿中 ( 带磁 棒 )， 用距离 25-30cm 的 30W 紫外灯照射 0-150S， 将照射后的菌悬液在 20-30、 220r/min 条件下振荡培养 12-18h， 梯度稀释后进行平板涂布， 每个稀释度做 3 个平行， 在 20-30恒 说 明 书 CN 104312929 A 5 4/8 页 6 温培。
24、养箱中暗室培养 2-3d， 待长出单菌落后计算致死率 ( 见表 1-1)。 0045 表 1-1 ： 不同诱变时间下裂殖壶菌的致死率 ： 0046 诱变时间 ( 秒 )长出的菌落数 ( 个 ) 致死率 ( ) 033450 20247526.01 40180646.01 60123463.11 8053584.01 10010296.95 1201299.64 150399.91 0047 (III) 以 70 -85致死率的诱变时间为准， 挑取菌落直径大而光滑的单菌落， 进 行第二轮诱变处理和平板培养筛选， 具体步骤如下 ： 0048 根据表 1 确定致死率在 70 -85致死率的诱变时间为。
25、 80 秒， 随机挑取菌落直 径大且边缘光滑的单菌落， 进行第二轮的紫外诱变， 暗室静置 5-20min 后进行光复活处理 30min。 0049 (IV) 将步骤 (III) 中挑选出的单菌落在选择性平板上进行初筛， 挑选菌落直径较 大且形态圆滑的单菌落， 具体步骤如下 ： 0050 进行中间培养和稀释涂布于筛选平板后 20-30暗室培养 2-3d ； 0051 筛选平板培养基 (g/L) 为 ： 葡萄糖 30， 酵母浸粉 10， 蛋白胨 5， 海水晶 15， 丙二酸 5， 碘乙酸0.8 ； 挑取菌落直径大且边缘光滑的单菌落进行摇瓶培养,27,220rpm振荡培养 54h。摇瓶培养基 (g/。
26、L) 为 ： 葡萄糖 30， 酵母浸粉 5， 蛋白胨 10， 海水晶 25,pH 6.0。 0052 (V) 以 DHA 油脂含量和菌体生物量为指标， 在选择性平板上进行二次复筛 ； 菌体生 物量以干重计算， 将湿菌体置于 105烘箱烘至恒重 ； 总油脂采用溶剂法旋转蒸发仪提取， DHA 产量以甲酯化处理后进气相色谱分析， 通过面积内标法计算含量。最后筛选出三株 DHA 的高产菌株， 如表 1-2 所示。 0053 表 1-2 ： 裂殖壶菌诱变株与原始菌株 DHA 产量的比较 ： 0054 菌株菌体生物量 (g/100mL)细胞中 DHA 含量 ( ) 原始菌株1.5816.74 说 明 书 。
27、CN 104312929 A 6 5/8 页 7 诱变株 -012.2924.32 诱变株 -022.3426.57 诱变株 -031.9221.48 0055 最后综合选择 2 号菌株为最佳诱变菌株， 即为裂殖壶菌 (Schizochytrium sp.) BLCY-01。将裂殖壶菌 (Schizochytrium sp.)BLCY-01 于 2014 年 07 月 15 日保存于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址 ： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科 学院微生物研究所， 保藏编号为 CGMCC No ： 9461。 0056 实施例 2 ： 0057 上述裂殖壶菌 (。
28、Schizochytrium sp.)BLCY-01 的培养方法， 步骤如下 ： 0058 (1) 将裂殖壶菌 (Schizochytrium sp.)BLCY-01 接种于活化培养基中， 20 30 活化培养 24 48h， 制得活化菌株 ； 0059 (2) 取步骤 (1) 制得的活化菌株， 接种于种子液体培养基中， 在 20 30、 200 240r/min 条件下， 培养 24 48h， 制得裂殖壶菌 (Schizochytrium sp.)BLCY-01 菌液。 0060 所述活化培养基每升组分如下 ： 0061 葡萄糖 30g， 蛋白胨 10g， 酵母浸粉 5g， 海水晶 15g，。
29、 水定容至 1L， pH 自然。 0062 所述种子液体培养基每升组分如下 ： 0063 葡萄糖 30g， 蛋白胨 10g， 酵母浸粉 5g， 海水晶 15g， 磷酸氢二钾 1.5g， 无水硫酸镁 0.5g， 大豆油 0.3g， 水定容至 1L， pH 自然。 0064 实施例 3 ： 不同碳源浓度对裂殖壶菌 BLCY-01 生物量和 DHA 油脂含量的影响 ： 0065 按照表 2 所示的不同碳源浓度下配置培养基， 每 500ml 的三角瓶中盛有 100ml 培 养基， 分别向其中接种 5ml(v/v) 的种子液， 27、 220rpm 振荡培养 54h， 测定裂殖壶菌菌体 生物量和 DHA。
30、 油脂含量。结果见表 2。 0066 表 2 ： 不同碳源浓度对裂殖壶菌 BLCY-01 生物量和 DHA 油脂含量的影响 0067 葡萄糖 (g/L)菌体生物量 (g/100mL)细胞中 DHA 含量 ( ) 302.3126.09 402.1928.99 502.1527.64 602.1230.58 902.0835.51 0068 0069 由表 2 可以看出， 在 30g/L 初始葡萄糖浓度时， 菌体生物量最高 ； 随着葡萄糖浓度 的增大， 生物量逐渐减小， 可能是葡萄糖效应造成生物量下降 ； 而DHA含量90g/L时最高， 此 说 明 书 CN 104312929 A 7 6/8 。
31、页 8 时菌体生长较慢， 碳源消耗主要用于积累细胞内的 DHA 油脂含量 ； 另外， 也说明一定范围内 提高培养基中的 C:N 比会刺激细胞中 DHA 油脂的积累。 0070 不同氮源对裂殖壶菌 BLCY-01 生物量和 DHA 油脂含量的影响 ： 0071 按照表 3 所示的不同氮源 (10g/L) 配置培养基， 每 500ml 的三角瓶中盛有 100ml 培养基， 分别向其中接种 5ml(v/v) 的种子液， 27、 220rpm 振荡培养 54h， 测定裂殖壶菌菌 体生物量和 DHA 油脂含量。结果见表 3。 0072 表 3 ： 不同氮源对裂殖壶菌 BLCY-01 生物量和 DHA 油。
32、脂含量的影响 0073 不同氮源 (10g/L)菌体生物量 (g/100mL)细胞中 DHA 含量 ( ) 空白2.6524.87 酵母浸粉2.4619.23 蛋白胨2.6030.08 玉米浆粉1.9026.15 豆粕粉1.8810.76 硝酸钠1.3319.76 硫酸铵0.672.03 0074 由表 3 可以看出， 对菌体生物量影响较大的氮源是 ： 蛋白胨、 酵母粉， 其次是玉米 浆粉 ； 而对 DHA 油脂含量影响较大的氮源为蛋白胨、 玉米浆粉、 硝酸钠和酵母浸粉。裂殖壶 菌对不同氮源的利用率不同， 蛋白胨和酵母浸粉更利于菌体生长， 蛋白胨和硝酸钠更利于 积累 DHA， 而玉米浆粉既利于。
33、菌体生长， 也刺激 DHA 油脂的积累， 因此， 可以考虑组合氮源的 搭配使用。 0075 不同氮源组合对裂殖壶菌 BLCY-01 生物量和 DHA 油脂含量的影响 ： 0076 从实例 3 中优化出的蛋白胨和玉米浆粉为最佳氮源组合， 进一步优化两者的最佳 添加比例。以总氮含量为 10g/L， 按不同比例添加蛋白胨和玉米浆粉， 摇瓶培养 54h 后测定 菌体生物量和 DHA 油脂含量。结果见表 4。 0077 表 4 ： 不同比例组合氮源对裂殖壶菌 BLCY-01 生物量和 DHA 油脂的影响 0078 蛋白胨 ： 玉米浆粉 ( )菌体生物量 (g/100mL)细胞中 DHA 含量 ( ) 1。
34、0:02.1118.78 8:22.3120.99 6:42.4120.24 说 明 书 CN 104312929 A 8 7/8 页 9 4:62.4925.49 2:82.5323.35 0:102.7720.20 0079 由表 4 可以看出 ： 不同比例的蛋白胨和玉米浆粉对裂殖壶菌 BLCY-01 的菌体生物 量和 DHA 油脂含量的影响不同 ； 其中菌体生物量最高的组合是玉米浆粉 10g/L， 也即玉米浆 粉可以完全替代蛋白胨 ； 但从DHA油脂含量分析， 最佳比例组合是蛋白胨 ： 玉米浆粉4:6， 由于菌体生物量的差异不大， 因此， 综合考虑， 选择 4:6 的蛋白胨和玉米浆粉的组。
35、合为最佳 氮源。 0080 实验例 4 ： 0081 所述裂殖壶菌 (Schizochytrium sp.)BLCY-01 在制备 DHA 中的应用， 步骤如下 ： 0082 I、 取实施例 2 制备的裂殖壶菌 (Schizochytrium sp.)BLCY-01 菌液， 按体积百分 比 10接种于液体发酵培养基中， 在温度 27、 通气量 0.5vvm、 pH 6.0 的条件下， 200rpm 搅拌发酵 48h， 流加质量浓度为 50g/L 的葡萄糖溶液和质量浓度为 3g/L 的硝酸钠溶液， 使 发酵罐中的葡萄糖浓度为 20g/L， 硝酸钠浓度为 1.2g/L， 然后在温度 25、 通气量。
36、 0.5vvm、 100rpm 的条件下， 继续发酵培养 18h， 制得发酵液 ； 0083 II、 取步骤 I 制得的发酵液， 经固液分离， 取沉淀， 经菌体破碎、 DHA 提取、 纯化， 制 得 DHA。 0084 经对步骤 I 的发酵液和制得的 DHA 进行检测， 裂殖壶菌 BLCY-01 发酵液的菌体生 物量为 45g/L， DHA 含量为 12.5g/L。 0085 通过气相色谱分析后， 裂殖壶菌油脂中脂肪酸组成如下表所示 ： 0086 脂肪酸成分总油脂该成分的含量 ( ) C12:00.0876 C16:048.799 C16:12.828 C18:01.763 C18:10.18。
37、9 C20:5未检出 C22:54.67 C22:636.267 其他5.48 说 明 书 CN 104312929 A 9 8/8 页 10 0087 0088 从上表可以看出 : 本发明采用的裂殖壶菌生产的脂肪酸组成比较简单， 饱和脂肪 酸以棕榈酸为主， 不饱和脂肪酸中 DHA 含量占 90左右， 除了有少数的 DPA 之外， 基本不含 EPA。 0089 实验例 5 ： 0090 所述裂殖壶菌 (Schizochytrium sp.)BLCY-01 在制备 DHA 中的应用， 步骤如下 ： 0091 I、 取实施例 2 制备的裂殖壶菌 (Schizochytrium sp.)BLCY-0。
38、1 菌液， 按体积百分 比 5接种于液体发酵培养基中， 在温度 27、 通气量 0.5vvm、 pH 5.0 的条件下， 200rpm 搅拌发酵 48h， 流加质量浓度为 50g/L 的葡萄糖溶液和质量浓度为 3g/L 的硝酸钠溶液， 使 发酵罐中的葡萄糖浓度为 10g/L， 硝酸钠浓度为 0.8g/L， 然后在温度 20、 通气量 0.5vvm、 100rpm 的条件下， 继续发酵培养 6h， 制得发酵液 ； 0092 II、 取步骤 I 制得的发酵液， 经固液分离， 取沉淀， 经菌体破碎、 DHA 提取、 纯化， 制 得 DHA。 0093 经对步骤 I 的发酵液和制得的 DHA 进行检测。
39、， 裂殖壶菌 BLCY-01 发酵液的菌体生 物量为 30g/L， DHA 含量为 8.6g/L。 0094 对比例 ： 0095 取实施例 1 分离的裂殖壶菌 (Schizochytrium sp.)BLCY-01 的野生菌株， 按照实 施例2的步骤培养后， 再按照实施例4的过程发酵制备DHA， 经检测， 野生菌株发酵液的菌体 生物量为 30g/L， DHA 含量为 7.5g/L。而突变株发酵液的菌体生物量为 45g/L， DHA 含量为 12.5g/L， 发酵水平远高于裂殖壶菌 (Schizochytrium sp.)BLCY-01 的野生菌株。 说 明 书 CN 104312929 A 10 。