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1、(10)申请公布号 CN 104313151 A (43)申请公布日 2015.01.28 CN 104313151 A (21)申请号 201410572451.2 (22)申请日 2014.10.23 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 安徽新星生物工程有限公司 地址 230088 安徽省合肥市高新区科学大道 110 号创业中心 F9B 三层 (72)发明人 石应辉 胡青松 桂向东 李晓祥 (74)专利代理机构 杭州天勤知识产权代理有限 公司 33224 。
2、代理人 胡红娟 (54) 发明名称 用于鉴定地顶孢霉诱变株 MKL18 的引物对和 试剂盒 (57) 摘要 本 发 明 公 开 了 一 种 用 于 鉴 定 地 顶 孢 霉 诱 变 株 MKL18 的 引 物 对 和 试 剂 盒。 所 述 引 物 对 的 碱 基 序 列 为 ：正 向 引 物 ： 5-CCAATGCCCTTCGGGGCTCTCTGG-3 ； 反 向 引 物 ： 5-GGGATTGGGTAATTTGCGCGCCT-3。本发明发现 地顶孢霉诱变株 MKL18 的 18S rDNA 发生了变异， 并且该变异能在传代菌株中稳定遗传。在此基础 上， 本发明针对顶孢霉属 18S rDNA 中。
3、一段长度为 230bp、 比较保守的序列， 设计了本发明的引物对， 用于鉴定地顶孢霉诱变株 MKL18 及其传代菌株， 从而特异地将地顶孢霉诱变株 MKL18 与其野生出 发菌株区分开来。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 2 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图3页 (10)申请公布号 CN 104313151 A CN 104313151 A 1/1 页 2 1. 用于鉴定地顶孢霉诱变株 MKL18(Acremonium terricola MKL18) 的引物对， 其特。
4、征 在于， 碱基序列为 ： 正向引物 ： 5-CCAATGCCCTTCGGGGCTCTCTGG-3 ； 反向引物 ： 5-GGGATTGGGTAATTTGCGCGCCT-3。 2. 一种用于鉴定地顶孢霉诱变株 MKL18 的试剂盒， 包含有引物对， 其特征在于， 所述引 物对为如权利要求 1 所述用于鉴定地顶孢霉诱变株 MKL18 的引物对。 3. 一种鉴定地顶孢霉诱变株 MKL18 的方法， 其特征在于， 包括 ： (1) 提取待测菌株的基因组 DNA ； (2) 以所述基因组 DNA 为模板， 利用如权利要求 1 所述的引物对进行 PCR 扩增 ； (3) 对扩增产物进行序列测定， 根据测。
5、序结果鉴定待测菌株是否为地顶孢霉诱变株 MKL18。 4. 如权利要求 3 所述的方法， 其特征在于， 步骤 (2) 中， PCR 扩增的反应体系为 ： 按 50L 体系计， 其中包括 ： 5U/L 的高保真耐高温聚合酶 1.0L， 10 缓冲液 5.0L， 25mM 的MgCl23.0L， 各2.5mM的dNTPs混合物4.0L， 正向和反向引物各1.0L， 100ng/L的 基因组 DNA 1.0L， 灭菌双蒸水 34L。 5. 如权利要求 3 所述的方法， 其特征在于， 步骤 (2) 中， PCR 扩增程序为 ： 95预变性 4min ； 95变性 45s， 68退火 / 延伸反应 45。
6、s， 共计 25 个循环 ； 72延伸 3min。 6. 如权利要求 3 所述的方法， 其特征在于， 所述引物对的扩增产物是地顶孢霉 18S rDNA 的 230bp 目标片段。 7.如权利要求3所述的方法， 其特征在于， 地顶孢霉诱变株MKL18扩增产物的碱基序列 如 SEQ ID No.1 所示。 权 利 要 求 书 CN 104313151 A 2 1/4 页 3 用于鉴定地顶孢霉诱变株 MKL18 的引物对和试剂盒 技术领域 0001 本发明属于菌种鉴定技术领域， 具体涉及一种用于鉴定地顶孢霉诱变株 MKL18 的 引物对和试剂盒。 背景技术 0002 冬虫夏草是一类珍惜宝贵的传统中药。
7、材， 在传统中医和现在医学临床中均有较广 泛的应用。 野生虫草对其生长条件要求苛刻， 导致产量较低， 所以利用其真菌无性形进行工 业化深层发酵， 生产各种药物、 营养保健品和饲料添加剂等， 已经广为多见。通过挖掘丰富 的野生资源、 以及实验室人工诱变， 各种具有优质生产性能的菌株也广为报道。 0003 由于虫草真菌无性形的分离鉴别方法尚不十分系统规范， 对一些野生分离株的鉴 定， 大多还是采用外观及显微形态的描述作为分类依据。这不仅给虫草真菌的分类带来一 定程度的混乱， 也使得一些具备优异生产性能的菌种及其相关的知识产权， 难以得到实质 意义的保护。 0004 如何建立一种方法， 方便且特异性。
8、地表征并进而保护这些生产性能好的优质菌 株、 特别是其中的一些专利菌株， 是一个现实的问题。 0005 核糖体 RNA 基因序列 (rRNA 基因， 或称 rDNA) 在进化过程中是十分保守的， 因此随 着分子生物学技术的发展， rDNA 序列已经被广泛应用于系统生物学中。18S rDNA 序列用于 真菌的系统分类和进化树的建立， 也已经比较普遍。 0006 申请号为 201410016617.2 的中国专利文献公开了一种地顶孢霉诱变株 MKL18(Acremonium terricola MKL18)， 其保藏编号 CCTCC No.M2013654。该地顶孢霉诱变 株属于虫草真菌， 用于生。
9、产一种绿色饲料添加剂。与出发野生菌株相比， 地顶孢霉诱变株 MKL18生长优势明显， 在察氏培养基中摇瓶发酵时， 同期生物量可提高32； 菌丝体中腺苷、 麦角甾醇、 粗蛋白和多糖的含量分别提高 12 ( 腺苷 )、 42 ( 麦角甾醇 )、 8 ( 粗蛋白 ) 和 35 ( 多糖 )， 而这些活性成分赋予了地顶孢霉菌发酵产物促生长、 抗肿瘤、 提高免疫等 功效 ； 并且这些优异的生产性能都能随菌株繁殖而稳定遗传。 0007 然而， 地顶孢霉诱变株 MKL18 和野生出发菌株相比， 两者在菌落和显微形态上没 有任何差异， 无法通过肉眼或显微观察进行区分。申请人虽然就该菌株提出了发明专利申 请并在。
10、保藏机构保藏了菌种， 但是对于这一优质生产菌种， 如因生产企业内部的原因导致 可能的流失外泄， 将不能很好监控鉴别。 发明内容 0008 本发明提供了一种用于鉴定地顶孢霉诱变株 MKL18 的引物对， 利用该引物对对菌 株 18S rDNA 部分序列进行分析， 能将地顶孢霉诱变株 MKL18 与其野生出发菌株区别开来。 0009 用于鉴定地顶孢霉诱变株 MKL18(Acremonium terricola MKL18) 的引物对， 碱基 序列为 ： 0010 正向引物 ： 5-CCAATGCCCTTCGGGGCTCTCTGG-3 ； 说 明 书 CN 104313151 A 3 2/4 页 4。
11、 0011 反向引物 ： 5-GGGATTGGGTAATTTGCGCGCCT-3。 0012 申请人发现， 在对野生型地顶孢霉进行诱变时， 获得的地顶孢霉诱变株 MKL18 除 了获得更加优异的菌种性能外， 还使得 18S rDNA 序列发生了变异。虽然 18S rDNA 序列的 变异与新菌种性能之间并无直接关联 ( 即新菌种性能的产生并非是 18S rDNA 序列变异引 起的 )， 但该变异后的 18S rDNA 序列、 新菌种性能均能随菌株繁殖而稳定遗传 ； 这就使得通 过对18S rDNA序列进行分析， 能够将菌落和显微形态极为相似的地顶孢霉诱变株MKL18与 其野生出发菌株区分开来。 。
12、0013 在此基础上， 在 Genebank 上输入 “Acremonium 18S rRNA” ， 检索到顶孢霉属 各 种 相 关 序 列 370 余 条 ( 详 见 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore ？ term acremonium+18S+rRNA) ； 而输入 “Acremonium terricola 18S rRNA”后搜索， 则仅有一 条序列， 且该序列只包含 18S rDNA 中的 33 个碱基 ( 详见 http:/www.ncbi.nlm.nih. gov/nuccore/20385397)。参考 Glenn AE.et al 发表的文。
13、献 (Molecular phylogeny of Acremonium and its taxonomic implications.Mycologia,1996,88:369)， 我们选择顶孢 霉属 18S rDNA 中一段长度为 230bp、 比较保守的序列， 设计了本发明的引物对， 用于鉴定地 顶孢霉诱变株 MKL18。 0014 本发明还提供了一种用于鉴定地顶孢霉诱变株 MKL18 的试剂盒， 包含有引物对， 所述引物对即为本发明所述用于鉴定地顶孢霉诱变株 MKL18 的引物对。 0015 本发明还提供了一种鉴定地顶孢霉诱变株 MKL18 的方法， 包括 ： 0016 (1) 提取待。
14、测菌株的基因组 DNA ； 0017 (2) 以所述基因组 DNA 为模板， 利用所述的引物对进行 PCR 扩增 ； 0018 PCR 扩增的反应体系为 ： 按 50L 体系计， 其中包括 ： 5U/L 的高保真耐高温聚合 酶 1.0L， 10 缓冲液 5.0L， 25mM 的 MgCl23.0L， 各 2.5mM 的 dNTPs 混合物 4.0L， 正 向和反向引物各 1.0L， 100ng/L 的基因组 DNA1.0L， 灭菌双蒸水 34L。 0019 PCR 扩增程度为 ： 95预变性 4min ； 95变性 45s， 68退火 / 延伸反应 45s， 共计 25 个循环 ； 72延伸 。
15、3min。 0020 (3) 对扩增产物进行序列测定， 根据测序结果鉴定待测菌株是否为地顶孢霉诱变 株 MKL18。 0021 本发明中， 所述引物对的扩增产物是地顶孢霉 18S rDNA 的 230bp 目标片段。相对 于野生出发菌株， 地顶孢霉诱变株 MKL18 的 18S rDNA 上发生的碱基突变均发生在该区段 上， 且 230bp 长度的目标片段便于采用一般的 PCR 鉴定试剂盒进行扩增。 0022 测序结果显示， 地顶孢霉诱变株 MKL18 的的扩增产物的碱基序列如 SEQ ID No.1 所示。经过比对发现， 与野生型菌株相比， 地顶孢霉诱变株 MKL1818S rDNA 的 2。
16、30bp 目标片 段中， 有 5 个位点发生了变异， 分别为 A42T( 表示第 42 位的碱基 A 突变为碱基 T， 下同 )、 G45A、 C52T、 C113A、 T114G。 0023 对地顶孢霉诱变株MKL18的传代菌株进行18S rDNA序列分析， 同样发现了上述变 异， 表明这些变异在诱变株中是稳定遗传的。 0024 由此可见， 本发明的引物对可用于特异性地鉴定地顶孢霉诱变株 MKL18 及其传代 菌株。 0025 与现有技术相比， 本发明的有益效果为 ： 说 明 书 CN 104313151 A 4 3/4 页 5 0026 本发明发现地顶孢霉诱变株MKL18的18S rDNA。
17、发生了变异， 并且该变异能在传代 菌株中稳定遗传， 在此基础上， 本发明针对顶孢霉属 18S rDNA 中一段长度为 230bp、 比较保 守的序列， 设计了本发明的引物对， 用于鉴定地顶孢霉诱变株 MKL18 及其传代菌株， 从而特 异地将地顶孢霉诱变株 MKL18 与其野生出发菌株区分开来。 附图说明 0027 图 1 为地顶孢霉诱变株 MKL18 与其野生出发株相关序列的 PCR 结果图 ； 0028 其中， 泳道 1 为核酸低分子量标记， 泳道 2 为 PCR 阴性对照， 泳道 3 为地顶孢霉野 生出发菌株的 PCR 产物， 泳道 4 为地顶孢霉诱变株 MKL18 原代菌种的 PCR 。
18、产物， 泳道 5 为地 顶孢霉诱变株 MKL18 的第 20 代次菌种的 PCR 产物， 泳道 6 为核酸分子量标记， 泳道 7 为地 顶孢霉染色体 DNA ； 0029 图 2 为地顶孢霉诱变株 MKL18 及其传代菌株与其野生出发株 18S rDNA 部分序列 比对结果图 ； 0030 其中， AT-y 表示地顶孢霉野生出发菌株， AT-m1 表示地顶孢霉诱变株 MKL18 原代 菌种， AT-m20 表示诱变株 MKL18 的第 20 代次菌种 ； Consensus 表示三种菌株相同部分的序 列 ； 0031 图 3 为地顶孢霉野生出发菌株 18S rDNA 部分序列的 Blast 分。
19、析结果 ； 0032 图 4 为地顶孢霉诱变株 MKL1818S rDNA 部分序列的 Blast 分析结果。 具体实施方式 0033 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。 0034 本实施例一种鉴定地顶孢霉诱变株 MKL18 的方法， 包括以下步骤 ： 1、 地顶孢霉的 培养和染色体 DNA 提取 0035 地顶孢霉培养 ： 取保存于 -80超低温冰箱的地顶孢霉野生出发菌株、 地顶孢 霉诱变株MKL18原代菌种和第20代次菌种(中国发明专利CN 201410016617.2)， 接种于含 10ml 液体察氏培养基 (NaNO30.2、 K2HPO40.2、 KCl 0.5、 。
20、MgSO40.4、 FeSO40.001、 蔗 糖 2， 其余为水 ) 的三角摇瓶， 25、 200rpm 振荡培养 96 小时。 0036 染色体 DNA 提取 ： 取 3ml 菌液， 5000rpm 离心 5 分钟获取菌丝体， PBS 悬浮洗涤两 次， 将菌丝按 1:20(g/ml) 的比例加到 2ml 酶解液中 ( 蜗牛酶 0.5， 纤维素酶 0.3， 0.6M 甘露醇 )， 33反应 0.5 1 小时， 沸水浴 3 分钟， 酚、 酚 / 氯仿抽提， 轻柔操作， 抽提上清液 加入 2 倍体积无水乙醇， -20沉淀 2 小时， 15000rpm 低温离心 10 分钟， 沉淀用 70乙醇轻 。
21、柔悬浮洗涤两次， 自然晾干后用 200l 水溶解， -20保存。 0037 电泳检测结果 ( 见图 1) 可见所提取的染色体 DNA 是完整的， 没有碎片， 大致定量 为 100ng/ml。 0038 2、 18S rDNA 部分序列的特异性引物的合成和 PCR 扩增 ： 0039 18S rDNA 部分序列的特异性引物的合成 ： 参照 Genebank 检索结果和文 献 (Glenn AE.et al Molecular phylogeny of Acremonium and its taxonomic implications.Mycologia,1996,88:369) 内容， 选择顶孢。
22、霉属已发表的 18S rDNA 序列中相 对保守的 230bp 目标区段， 据此设计一对引物 ： 说 明 书 CN 104313151 A 5 4/4 页 6 0040 正向引物 ： 5-CCAATGCCCTTCGGGGCTCTCTGG-3 ； 0041 反向引物 ： 5-GGGATTGGGTAATTTGCGCGCCT-3 ； 0042 两条引物的 TM 值分别为 71.3和 72.4， 目标扩增产物长度应为 230bp。 0043 18S rDNA 部分序列的 PCR 扩增 ： 0044 配制以下扩增体系 ： 按 50L 体系计， 其中 5U/L 高保真耐高温聚合酶 1.0L， 10 缓冲液。
23、 5.0L， 25mM 的 MgCl23.0L， 各 2.5mM 的 dNTPs 混合物 4.0L， 正向和反向引 物各 1.0L， 100ng/L 模板 DNA 1.0L， 灭菌双蒸水 34L。 0045 由于两条引物的 GC 比较高、 TM 值也都相对较高， 所以执行的 PCR 程序也相对简化 了。具体程序为 ： 95预变性 4min ； 95变性 45s， 68退火 / 延伸反应 45s， 共计 25 个循 环 ； 72延伸 3min。 0046 3、 PCR 产物的电泳鉴定和序列分析 0047 PCR 产物的电泳鉴定 ： 取 PCR 产物 2L 进行琼脂糖电泳 (1.5 )， PCR 。
24、产物在 230bp 处出现特异条带 ( 图 1)。 0048 PCR 产物的序列分析 ： 将 18S rDNA PCR 产物克隆到 T 载体上， 用载体正向测序 引物进行序列测定， 并将地顶孢霉野生出发菌株与地顶孢霉诱变株 MKL18 原代菌种的序列 进行比对 ( 地顶孢霉诱变株 MKL18 原代菌种和第 20 代次菌种的序列一致 )， 比对结果见图 2。 0049 由图2可见， 与地顶孢霉野生出发菌株相比， 地顶孢霉诱变株MKL18原代菌种的序 列上发生了 5 个碱基的点突变， 位置和突变情况分别为 ： A42T、 G45A、 C52T、 C113A、 T114G。 0050 进一步进行 B。
25、last 分析发现， 地顶孢霉野生出发菌株的这段 18S rDNA 序列， 只与 一株Acremonium blochii strain CBS 424.93的相应序列有100同源性(图3) ； 而地顶 孢霉诱变株 MKL18 这段 18S rDNA 序列， 和任何其他序列都没有 100同源性 ( 图 4)。 0051 由此可见， 本发明的引物对和方法能用于鉴定地顶孢霉诱变株 MKL18 及其传代菌 株， 从而特异地将地顶孢霉诱变株 MKL18 与野生型菌株区分开来。 说 明 书 CN 104313151 A 6 1/2 页 7 0001 序 列 表 CN 104313151 A 7 2/2 页 8 0002 序 列 表 CN 104313151 A 8 1/3 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104313151 A 9 2/3 页 10 图 3 说 明 书 附 图 CN 104313151 A 10 3/3 页 11 图 4 说 明 书 附 图 CN 104313151 A 11 。