一种生产人源胶原蛋白Ⅱ型的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104313053 A (43)申请公布日 2015.01.28 CN 104313053 A (21)申请号 201410579575.3 (22)申请日 2014.10.24 C12N 15/866(2006.01) C07K 14/78(2006.01) C07K 1/22(2006.01) (71)申请人 华南农业大学 地址 510642 广东省广州市天河区五山路 483 号 申请人 广州暨南大学医药生物技术研究开 发中心 广东凯利生物科技有限公司 (72)发明人 孙京臣 黄亚东 梁智升 齐琦 黄秋生 项琪 贝煜 (74)专利代理机构 中科专利商标代理有限责任。

2、 公司 11021 代理人 陈晓娜 (54) 发明名称 一种生产人源胶原蛋白型的方法 (57) 摘要 本文发明公开了一种生产重组人源胶原蛋白 型的方法， 属于基因工程的技术领域。 其特征在 于 ： 利用杆状病毒多基因表达系统， 用转化了该 杆状病毒多基因表达系统的细菌感染昆虫细胞， 产生一种表达多基因的杆状病毒， 将病毒液侵染 昆虫细胞或注射入家蚕幼虫体内， 由此生产重组 人源胶原蛋白型全长蛋白， 其蛋白结构为 3 条 具有 (G-X-Y)n重复序列的肽链形成三股螺旋结 构， 保持天然胶原蛋白型的构象， 具有天然胶原 蛋白型的活性。 采用本发明的方法， 能表达多个 基因， 利于生产胶原蛋白型全。

3、长蛋白 ； 本发明 工艺方法简单， 操作简便， 工艺路线短。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 9 页 序列表 7 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书9页 序列表7页 附图3页 (10)申请公布号 CN 104313053 A CN 104313053 A 1/2 页 2 1. 一种生产重组人源胶原蛋白 II 型的方法， 所述方法包括下述步骤 ： (1) 获得 SEQ ID No.1 所示的人源胶原蛋白 II 型 1 链全长基因， 并连接至转移载体 pFBDM 中构建重组质粒 pFBDM-col II ； (2。

4、)向步骤(1)构建的重组质粒pFBDM-col II中插入IRES序列和荧光蛋白编码序列 ； (3) 获得 SEQ ID No.2 所示的人源脯氨酸羟化酶 亚基和 SEQ ID No.3 所示的人 源脯氨酸羟化酶 亚基序列， 共同符合阅读框地连接至转移载体 pUCDM， 获得重组质粒 pUCDM-P4H-P4H ； (4) 将步骤 (2) 构建的重组质粒和步骤 (3) 构建的重组质粒 pUCDM-P4H-P4H 通过 转座的方式导入 asd 营养缺陷型宿主大肠杆菌 SW106 感受态细胞， 构建生产人源胶原蛋白 的重组基因病毒 DNA 的重组大肠杆菌 SW106 细胞 ； (5)将步骤(4)制。

5、备的重组大肠杆菌SW106细胞感染昆虫细胞产生杆状病毒， 再利用所 述杆状病毒上清液感染昆虫细胞， 进行重组蛋白的表达 ； 并且 (6) 收集感染的昆虫细胞的培养液上清， 亲和纯化得到所述重组人源胶原蛋白 II 型， 并进行测活 ； 其中步骤 (5) 的昆虫细胞为家蚕细胞 BmN 或 SF9 细胞。 2. 一种生产重组人源胶原蛋白 II 型的方法， 所述方法包括下述步骤 ： (1) 获得 SEQ ID No.1 所示的人源胶原蛋白 II 型 1 链全长基因， 并连接至转移载体 pFBDM-IM 中构建重组质粒 pFBDM-col II ； (2)向步骤(1)构建的重组质粒pFBDM-col I。

6、I中插入IRES序列和荧光蛋白编码序列 ； (3)获得SEQ ID No.2所示的人源脯氨酸羟化酶亚基和SEQ ID No.3所示的人源脯 氨酸羟化酶 亚基序列， 共同连接至转移载体 pUCDM， 获得重组质粒 pUCDM-P4H-P4H ； (4) 将步骤 (2) 构建的重组质粒和步骤 (3) 构建的重组质粒 pUCDM-P4H-P4H 通过 转座的方式导入 asd 营养缺陷型宿主大肠杆菌 SW106 感受态细胞， 构建生产人源胶原蛋白 的重组基因病毒 DNA 的重组大肠杆菌 SW106 细胞 ； (5) 将步骤 (4) 制备的重组大肠杆菌 SW106 细胞感染家蚕细胞 BmN， 产生杆状病。

7、毒， 并 利用所述杆状病毒上清液注射感染家蚕 5 龄期幼虫， 感染 4 天后收获在体视荧光显微镜下 显现所述荧光蛋白颜色的蚕体的表皮 ； 并且 (6) 将步骤 (5) 的表皮破碎离心收集上清， 将表达的重组人源胶原蛋白 II 型通过亲和 纯化， 得到所述重组人源胶原蛋白 II 型， 并进行测活。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法， 其中所述人源胶原蛋白 II 型 1 链全长基因插 入载体pFBDM的MCS1中的位点中， 并且所述IRES序列和荧光蛋白编码序列插入载体pFBDM 的 MCS2 中的位点中， 并且所述 IRES 序列和荧光蛋白编码序列与人源胶原蛋白 II 型 1 链 全长。

8、基因是符合阅读框地插入到载体 pFBDM 中。 4. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法， 其中在步骤 (3) 中， 所述人源脯氨酸羟化酶 亚 基序列插入载体 pUCDM 的 MCS1 中的位点中， 并且所述人源脯氨酸羟化酶 亚基序列插入 载体 pUCDM 的 MCS2 中的位点中。 5. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法， 其中步骤 (2) 所用的荧光蛋白编码序列编码选自 GFP、 YFP 或 mCherry 的荧光蛋白。 6. 根据权利要求 5 所述的方法， 其中步骤 (2) 所用的荧光蛋白编码序列编码 mCherry 权 利 要 求 书 CN 104313053 A 2 2/2 页。

9、 3 荧光蛋白。 7. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法， 其中 asd 营养缺陷型宿主大肠杆菌 SW106 通过在 大肠杆菌基因组上引入嗜血杆菌入侵 inv 基因， 缺失 asd 基因改造获得。 8.根据权利要求1所述的方法， 其中步骤(5)中得到的感染成功的家蚕细胞BmN或SF9 细胞的培养条件为 ： 商业化 Grace 培养基成分， PH6.4， 添加浓度为 80ug/ml 的抗坏血酸盐， 温度 28， 静止培养 3 天。 9. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法， 其中步骤 (6) 的亲和纯化利用镍柱进行。 权 利 要 求 书 CN 104313053 A 3 1/9 页 4 一。

10、种生产人源胶原蛋白 II 型的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种生产重组人源胶原蛋白 II 型的方法， 属于基因工程的技术领域。 背景技术 0002 胶原蛋白又称胶原， 是哺乳动物体内含量最丰富的蛋白质， 约占体内蛋白质总量 的 25 -30。其广泛存在于动物的皮、 骨、 软骨、 牙齿、 肌腱、 韧带和血管中， 是结缔组织的 重要结构蛋白， 具有支撑器官和保护机体的功能。 0003 目前研究报道显示， 自 Miller 和 Matukas 于 1969 年发现 II 型胶原蛋白以来， 在 脊椎动物中已发现超过 28 种不同类型的胶原蛋白， 它们由至少 46 种截然不同的多肽链组 成。这些。

11、不同类型的胶原蛋白都至少包含一个三重螺旋的结构域， 有的多达 96 (I 型 )， 少则 10 (XII 型 )。胶原蛋白的基本组成大同小异， 在氨基酸序列上都含有 (Gly-X-Y) n 重复序列， 这些重复序列是构成三聚体结构基础， 其中 X 通常为 Pro， Y 通常为 Hy-Pro 或 Hy-Lys。在胶原蛋白中， 脯氨酸 (Pro) 与赖氨酸 (Lys) 含量尤为丰富， 而这正是 肽链能 形成三螺旋的关键组分。羟基脯氨酸 (Hyp) 是在胶原蛋白一级结构形成后由特定的酶 - 脯 氨酸 -4- 羟化酶 (P4H) 作用于序列中的脯氨酸 (Pro) 形成的， Hyp 羟基通过通过分子间氢。

12、 键对稳定胶原蛋白的三重螺旋结构起着重要的作用。 0004 人源 II 型胶原蛋白是人体透明软骨、 玻璃体、 胚胎角膜和神经视网膜的主要成 分， 此外， II 型胶原对于软骨的修复是很有用的， 而且有望用于人造软骨及人造角膜等生物 医学材料中。但目前这些材料都来自于动物， 而动物源的胶原会产生免疫反应而且有病毒 隐患， 此外， 缺乏大量的组织及大规模纯化胶原蛋白所面临的挑战使利用这些材料很难， 重 组表达技术可解决上述问题。目前虽已在哺乳细胞、 昆虫、 酵母、 大肠杆菌、 烟草、 老鼠和蚕 中成功表达了重组胶原， 但只有在哺乳细胞中在不表达脯氨酰 4- 羟化酶基因时， 胶原蛋白 基因可表达出羟。

13、基化的胶原蛋白， 但由于其表达水平太低， 无法进行大规模的生产。 发明内容 0005 为克服现有技术中的上述缺点， 本发明通过对载体基因上游改造， 构建能同时表 达胶原蛋白 II 型、 红色荧光蛋白、 脯氨酸羟化酶的病毒， 并且提供了一种表达效率高、 工艺 简单的胶原蛋白 II 型的表达方法。 0006 本发明主要目的在于 ： 利用多基因杆状病毒表达系统表达人源 II 型胶原蛋白。 0007 具体地， 本发明提供一种生产重组人源胶原蛋白 II 型的方法， 所述方法包括下述 步骤 ： 0008 (1) 人工合成 SEQ ID No.1 所示的人源胶原蛋白 II 型 1 链全长基因， 并连接至 转。

14、移载体pFBDM(图7)中构建重组质粒pFBDM-col II， 具体地， 可以插入载体pFBDM的MCS1 中的位点中 ； 0009 (2) 向步骤 (1) 构建的重组质粒 pFBDM-col II 中插入 IRES 序列和荧光蛋白编码 序列， 具体地， 可以插入载体 pFBDM 的 MCS2 中的位点中 ； 应该理解， IRES 序列和荧光蛋白编 说 明 书 CN 104313053 A 4 2/9 页 5 码序列与人源胶原蛋白 II 型 1 链全长基因是符合阅读框地插入到载体 pFBDM 中 ； 0010 (3) 人工合成 SEQ ID No.2 所示的人源脯氨酸羟化酶 亚基和 SEQ 。

15、ID No.3 所 示的人源脯氨酸羟化酶 亚基序列， 共同符合阅读框地连接至转移载体 pUCDM( 图 8)， 获 得重组质粒 pUCDM-P4H-P4H， 具体地， P4H 可以插入载体 pUCDM 的 MCS1 中的位点中， P4H 可以插入载体 pUCDM 的 MCS2 中的位点中 ； 0011 (4) 将步骤 (2) 构建的重组质粒和步骤 (3) 构建的重组质粒 pUCDM-P4H-P4H 通过转座的方式导入 asd 营养缺陷型宿主大肠杆菌 SW106 感受态细胞， 构建生产人源胶原 蛋白的重组基因病毒 DNA 的重组大肠杆菌 SW106 细胞 ； 0012 (5) 将步骤 (4) 制。

16、备的重组大肠杆菌 SW106 细胞感染昆虫细胞 ( 例如， 家蚕细胞 BmN， SF9 细胞 ) 产生杆状病毒， 再利用所述杆状病毒上清液感染昆虫细胞， 进行重组蛋白的 表达 ； 并且 0013 (6) 收集感染的昆虫细胞的培养液上清， 亲和纯化得到所述重组人源胶原蛋白 II 型， 并进行测活。 0014 其中， 当使用家蚕进行重组蛋白表达时， 上述步骤(5)和(6)可以相应地修改为下 述步骤 (5 ) 和 (6 ) ： 0015 (5 ) 将步骤 (4) 制备的重组大肠杆菌 SW106 细胞感染家蚕细胞 BmN 细胞产生杆 状病毒， 并利用所述杆状病毒上清液注射感染家蚕5龄期幼虫， 感染4天。

17、后收获显现所述荧 光蛋白颜色 ( 可通过体视荧光显微镜观察 ) 的蚕体的表皮 ； 并且 0016 (6 ) 将步骤 (5 ) 的表皮破碎离心收集上清， 将表达的重组人源胶原蛋白 II 型通 过亲和纯化， 得到所述重组人源胶原蛋白 II 型， 并进行测活。 0017 其中， SEQ ID No.1 所示的人源胶原蛋白 II 型 1 链全长基因可以通过人工合成 获得， 或者可以通过以 EX-5512-B31 为模板 PCR 扩增得到。 0018 所用的荧光蛋白编码序列可以选自编码红色或绿色荧光蛋白的基因序列， 例如， 但不限于， 编码 GFP、 YFP、 mCherry 的基因序列。其中， 在荧光。

18、蛋白基因开放阅读框前端加入 IRES 序列 ( 内部核糖体进入位点 )， 这样改造的目的是通过 IRES 的特性提高所述荧光蛋白 的表达量。IRES 序列如 SEQ ID No.5 所示。 0019 人源脯氨酸羟化酶 P4H 和 P4H 亚基基因的序列可以通过人工合成获得， 或者 通过选用带有该基因的序列作为模板通过 PCR 扩增得到。 0020 在本发明的技术方案中， 实现了重组人源胶原蛋白 II 型和人源脯氨酸羟化酶以 及荧光蛋白的共表达， 其中共表达人源脯氨酸羟化酶的目的是将表达的人源胶原蛋白 II 型中的脯氨酸羟基化， 从而获得高质量的胶原蛋白II型(胶原蛋白脯氨酸被羟基化的程度 是决。

19、定胶原蛋白质量高低的标准， 脯氨酸羟化酶与胶原蛋白共表达， 能够最大化地使胶原 蛋白的脯氨酸被羟基化成羟脯氨酸 )， 共表达荧光蛋白的目的是在家蚕中表达时便于筛选 带有表达的人源胶原蛋白II形的家蚕(会显现荧光蛋白的颜色， 可通过体视荧光显微镜观 察 )。 0021 在一个优选的实施方案中， 所述生产重组人源胶原蛋白 II 型的方法包括下述步 骤 ： 0022 (1) 合成人源胶原蛋白 II 型 1 链全长基因 ( 序列如 SEQ ID No.1 所示 ) ； 0023 (2) 合成基因 IRES( 序列如 SEQ ID No.5 所示 ) 与 mCherry( 序列如 SEQ ID No.6。

20、 说 明 书 CN 104313053 A 5 3/9 页 6 所不 ) ； 0024 (3)将步骤(1)所合成的人源胶原II型1链全长基因(SEQ ID No.1)连接到转 移载体 pFBDM( 购至深圳市宝珠生物科技有限公司， 货号 zt323)， 构建 pFBDM-col II， 将步 骤(2)所合成的IRES以及mCherry共同连接入pFBDM-col II， 构建重组质粒pFBDM-IM-col II， 构建载体时需转化大肠杆菌感受态细胞 ( 例如 Top 10) ； 0025 (4) 合成人源脯氨酸羟化酶 P4H 和 P4H 亚基基因 ( 序列分别为 SEQ ID No.2 和 。

21、SEQ ID No.3) ； 0026 (5) 将步骤 (4) 所合成的人源脯氨酸羟化酶 P4H 与 亚基基因共同 ( 此处的 “共同” 应该理解不论同时还是先后， 只要将 与 亚基基因都连接到同一个 pUCDM 载 体中并且二者的连接符合阅读框就行 ) 连接至转移载体 pUCDM(Sun， Jingchen， et al， A High Effi cient Method of Constructing Recombinant Bombyx mori(Silkworm)Multiple Nucleopolyhedrovirus Based on Zero-Background Tn7-Med。

22、iated Transposition in Escherichia coli， Biotechnol.Prog.， 2009， Vol.25， No.2， pp524-529)， 获得重组质粒 pUCDM-P4H-P4H ； 0027 (6) 将重组质粒 pFBDM-IM-col II 和 pUCDM-P4H-P4H 分别通过转座的方式导 入 asd 营养缺陷型宿主大肠杆菌 SW106 感受态细胞 ( 本实验室按照常规方法改造， 改造方 法参见 Sun， Jingchen et al， Biotechnol.Appl.Biochem.(2010)， 57， 117-125(Printed i。

23、n Great Britain)doi ： 10.1042/BA20100148)， 构建生产人源胶原蛋白的重组基因病毒 DNA ： BmMNPV-pFBDM-IM-col II-pUCDM-P4H-P4H ； 0028 (7)对步骤(5)构建的重组大肠杆菌在Grace培养基(购自Gibco)中直接感染家 蚕细胞 BmN(ATCC CRL-8910) 产生杆状病毒 BmMNPV-hcol II。利用杆状病毒注射感染 5 龄 期家蚕幼虫， 饲养环境为 28， 湿度 60至 70之间， 每天给予足够的桑叶以及每天及时 清除蚕粪， 4 天后， 蚕出现荧光后收获， 确立了一种利用家蚕蚕体能有效生产人源。

24、胶原蛋白 的培养方式。 0029 (8) 将蚕体处死， 去掉丝腺、 中肠以及头前部口器， 加入胰蛋白酶抑制剂 ( 购自 Biosharp， 浓度 100ug/ml)， 研磨破碎， 15000rpm 离心 10 分钟， 取上清， 通过镍亲和层析柱、 分子筛纯化出胶原蛋白 II 型。 0030 (9) 纯化后的蛋白样品冻干浓缩， 在 96 孔板里加入 40ul 经过 0.22nm 的微孔滤膜 过滤的胶原蛋白样品， 在超净台内吹干过夜。阴性组为生理盐水以及超纯水。利用 balb/ c3T3(ATCC CCL-163) 细胞悬液接种到底层铺有类人胶原蛋白膜的培养皿中， 培养 4h。用 MTT 法比较各。

25、组细胞数， 测定胶原蛋白活性。 0031 换言之， 本发明提供一种生产重组人源胶原蛋白 II 型的方法， 其特征在于 ： 利用 杆状病毒载体表达系统， 构建出载体 pFBDM-IM-col II 和 pUCDM-P4H-P4H， 通过转座的 手段， 将带有目的基因的片段整合入 BmMultiBacNPV 基因组中 ； 将携带有外源基因的重组 杆状病毒 DAP 营养缺陷型大肠杆菌 SW106 菌液直接添加到 BmN 细胞培养基里， 细菌入侵细 胞后， 因为缺乏必需营养不能自身繁殖而死亡， 裂解后病毒基因组被动进入细胞， 从而构建 出重组病毒 BmMNPV-hcol II ； 利用构建出的重组病毒。

26、 BmMNPV-hcol II 注射感染家蚕幼虫， 通过体视荧光显微镜观察红色荧光 ( 即由 mCherry 表达的荧光蛋白 ) 来判断人源胶原蛋白 是否表达。 说 明 书 CN 104313053 A 6 4/9 页 7 0032 其中asd营养缺陷型宿主大肠杆菌SW106通过在大肠杆菌基因组上引入嗜血杆菌 入侵 inv 基因， 缺失 asd 基因改造获得， 其特征在于具有入侵细胞昆虫细胞的功能 ( 即， inv 基因的功能 )， 并在缺失 DAP 情况下死亡 ( 即， 缺失 asd 基因引起 )。关于 asd 营养缺陷型 宿主大肠杆菌 SW106 的改造方法参见 Sun， Jingchen。

27、 et al， Biotechnol.Appl.Biochem. (2010)， 57， 117-125(Printed in Great Britain)doi ： 10.1042/BA20100148。 0033 本发明的生产重组人源胶原蛋白 II 型的方法特征在于利用杆状病毒表达系统表 达全长的人源 II 型胶原蛋白。杆状病毒是有囊膜的 dsDNA 大形病毒， 宿主仅限于无脊椎动 物。杆状病毒基因组是大小为 80 到 160kb 的单一闭合环状双链 DNA 分子， 其基因组能在 昆虫细胞核复制和转录。DNA 复制后会组装在杆状病毒壳衣内， 壳衣具有较大的柔韧性， 可 容纳大片段外源 DN。

28、A 的插入， 是理想的表达大片段 DNA 的载体。现阶段多用核型多角体病 毒 (nuclear polyhedrosis virus， NPV) 作为外源基因表达载体的杆状病毒。杆状病毒表 达系统相对于其它表达系统具有下述特点 ： 杆状病毒所表达的重组蛋白具有完整的生物 学功能， 杆状病毒表达系统可为表达的外源蛋白在细胞内进行二硫键的搭配、 正确折叠及 寡聚物的形成提供良好的环境， 可使表达产物在功能与结构上更加接近天然蛋白。能进 行翻译后的加工修饰。杆状病毒表达系统具有对蛋白质完整的翻译后加工能力， 包括磷酸 化、 糖基化、 磷酸化、 信号肽切除、 切割和分解等， 所修饰的位点与天然蛋白在细。

29、胞内的修饰 位点完全一样。能容纳大分子的插入片段。杆状病毒自身毒粒可以扩大， 能包装较大的 基因片段。具有同时表达多个基因的能力。杆状病毒表达系统具有在同一细胞内表达多 个基因的能力， YAO 等所建立的杆状病毒表达系统具有能同时表达 10 个基因的能力。表 达水平高。 与其它真核表达系统比较， 杆状病毒表达系统能获得高量表达的重组蛋白， 最高 可使目的蛋白的表达量达到细胞总蛋白的 50。 0034 在本发明的生产人源胶原蛋白 II 型全长的方法中， 其利用家蚕幼虫表达全长的 人源 II 型胶原蛋白。家蚕核型多角体病毒 (Bombyx mori multicapsid Polyhedrosis。

30、 Virus， BmMNPV) 是一种带外壳的双链 DNA 病毒， 可以感染多种鳞翅目昆虫， 被用作基因表达 系统的载体。利用带有外源目的基因的 BmMNPV(BmMNPV-hcol II) 感染家蚕蚕体表达目的 蛋白。 0035 在本发明的生产人源胶原蛋白II型全长的方法中， 大肠杆菌宿主菌SW106具有入 侵细胞昆虫细胞 BmN 的功能， 并在缺失 DAP 情况下死亡。目前本实验室在杆状病毒载体表 达系统的发展中也取得了一些成果， 例如 ： 利用零背景 Tn7 转座菌株构建重组 Bacmid ； 利 用侵染蛋白介导的营养缺陷型的大肠杆菌进行无脂质体转染系统等。( 龙虎等， 南方医科 大学学。

31、报， 1673-4254(2010)07-1491-05 ； Sun， Jingchen， et al， ， Biotechnol.Prog.， 2009， Vol.25， No.2， pp524-529 ； Sun， Jingchen et al， Biotechnol.Appl.Biochem.(2010)， 57， 117-125(Printed in Great Britain)doi ： 10.1042/BA20100148)。其中， 利用侵染蛋白介 导的营养缺陷型的大肠杆菌 asd 缺失型 rSW106-inv， 直接将细菌加入细胞中感染， 细菌中 所表达的侵染蛋白会入侵到细胞内，。

32、 又因为其自身不能合成其细胞壁的主要成分 DAP( 二 氨基庚二酸 )， 不能继续繁殖而死亡， 细菌内的 bacmid 释放出来， 在昆虫细胞内进行转录进 而表达组装出杆状病毒。 0036 在本发明的生产人源胶原蛋白 II 型全长的方法中， 构建出的病毒感染细胞后， 通 过构建入载体的荧光蛋白标签 ( 例如， 红色或者绿色的荧光蛋白标签等 ) 作为判定细胞是 说 明 书 CN 104313053 A 7 5/9 页 8 否感染成功与人源胶原蛋白 II 型是否表达。其中上述所用的荧光蛋白标签可以选自 gfp、 yfp、 mCherry 等。在本发明中， 在 mCherry 荧光蛋白基因开放阅读框。

33、前端加入 IRES 序列 ( 内部核糖体进入位点 )， 这样改造的目的是通过 IRES 的特性提高 mCherry 的表达量。 0037 利用本发明的方法生产的重组人源胶原蛋白 II 型具有由 3 条 (G-X-Y)n重复序列 的肽链形成三股螺旋结构， 其中 X 表示 Pro， Y 表示 Hy-Pro 或 Hy-Lys， n 表示多段重复。换 言之， 利用本发明的方法生产的重组人源胶原蛋白II型保持天然胶原蛋白II型的构象， 具 有天然胶原蛋白 II 型的活性。 0038 本研究基于杆状病毒表达系统能够多基因表达， 承载大基因片段及高水平表达的 优点， 通过基因改造实现了重组人源胶原蛋白 II。

34、 型和人源脯氨酸羟化酶的共表达， 其中胶 原蛋白脯氨酸被羟基化的程度是决定胶原蛋白质量高低的标准， 脯氨酸羟化酶与胶原蛋白 共表达， 能够最大化地使胶原蛋白的脯氨酸被羟基化成羟脯氨酸。 而这种技术， 只需要一种 病毒， 即可表达多个基因。基于这种思路， 本发明人建立了一种简便、 快速和高效的胶原蛋 白生产工艺， 为其实际应用提供理论基础， 因此本发明的工作具有一定的理论和实际意义。 0039 本发明具有以下优点 ： 0040 (1) 本发明采用胶原蛋白 II 型， 表达其全长序列， 表达产物具有胶原蛋白特征的 三股螺旋结构。 0041 (2) 生产的人源胶原蛋白 II 型全长具有非常好的稳定性。

35、与亲水性， 其氨基酸序列 与天然人源胶原蛋白 II 型完全相同。应用人体不产生排斥反应与过敏反应， 可用于医疗美 容领域。 0042 (3) 方法简单、 操作容易、 成本低廉、 容易实现规模产业化的优点。 0043 综上所述， 本发明提供下述技术方案 ： 0044 1. 一种生产重组人源胶原蛋白 II 型的方法， 所述方法包括下述步骤 ： 0045 (1) 获得 SEQ ID No.1 所示的人源胶原蛋白 II 型 1 链全长基因， 并连接至转移 载体 pFBDM 中构建重组质粒 pFBDM-col II ； 0046 (2) 向步骤 (1) 构建的重组质粒 pFBDM-col II 中插入 。

36、IRES 序列和荧光蛋白编码 序列 ； 0047 (3) 获得 SEQ ID No.2 所示的人源脯氨酸羟化酶 亚基和 SEQ ID No.3 所示的 人源脯氨酸羟化酶 亚基序列， 共同符合阅读框地连接至转移载体 pUCDM， 获得重组质粒 pUCDM-P4H-P4H ； 0048 (4) 将步骤 (2) 构建的重组质粒和步骤 (3) 构建的重组质粒 pUCDM-P4H-P4H 通过转座的方式导入 asd 营养缺陷型宿主大肠杆菌 SW106 感受态细胞， 构建生产人源胶原 蛋白的重组基因病毒 DNA 的重组大肠杆菌 SW106 细胞 ； 0049 (5)将步骤(4)制备的重组大肠杆菌SW106。

37、细胞感染昆虫细胞产生杆状病毒， 再利 用所述杆状病毒上清液感染昆虫细胞， 进行重组蛋白的表达 ； 并且 0050 (6) 收集感染的昆虫细胞的培养液上清， 亲和纯化得到所述重组人源胶原蛋白 II 型， 并进行测活 ； 0051 其中步骤 (5) 的昆虫细胞为家蚕细胞 BmN 或 SF9 细胞。 0052 2. 一种生产重组人源胶原蛋白 II 型的方法， 所述方法包括下述步骤 ： 0053 (1) 获得 SEQ ID No.1 所示的人源胶原蛋白 II 型 1 链全长基因， 并连接至转移 说 明 书 CN 104313053 A 8 6/9 页 9 载体 pFBDM-IM 中构建重组质粒 pFB。

38、DM-col II ； 0054 (2) 向步骤 (1) 构建的重组质粒 pFBDM-col II 中插入 IRES 序列和荧光蛋白编码 序列 ； 0055 (3) 获 得 SEQ ID No.2 所 示 的 人 源 脯 氨 酸 羟 化 酶 亚 基 和 SEQ ID No.3 所示的人源脯氨酸羟化酶 亚基序列， 共同连接至转移载体 pUCDM， 获得重组质粒 pUCDM-P4H-P4H ； 0056 (4) 将步骤 (2) 构建的重组质粒和步骤 (3) 构建的重组质粒 pUCDM-P4H-P4H 通过转座的方式导入 asd 营养缺陷型宿主大肠杆菌 SW106 感受态细胞， 构建生产人源胶原 蛋。

39、白的重组基因病毒 DNA 的重组大肠杆菌 SW106 细胞 ； 0057 (5) 将步骤 (4) 制备的重组大肠杆菌 SW106 细胞感染家蚕细胞 BmN， 产生杆状病 毒， 并利用所述杆状病毒上清液注射感染家蚕5龄期幼虫， 感染4天后收获在体视荧光显微 镜下显现所述荧光蛋白颜色的蚕体的表皮 ； 并且 0058 (6) 将步骤 (5) 的表皮破碎离心收集上清， 将表达的重组人源胶原蛋白 II 型通过 亲和纯化， 得到所述重组人源胶原蛋白 II 型， 并进行测活。 0059 3.根据第1或2项所述的方法， 其中所述人源胶原蛋白II型1链全长基因插入 载体 pFBDM 的 MCS1 中的位点中， 。

40、并且所述 IRES 序列和荧光蛋白编码序列插入载体 pFBDM 的 MCS2 中的位点中， 并且所述 IRES 序列和荧光蛋白编码序列与人源胶原蛋白 II 型 1 链 全长基因是符合阅读框地插入到载体 pFBDM 中。 0060 4. 根据第 1 或 2 项所述的方法， 其中在步骤 (3) 中， 所述人源脯氨酸羟化酶 亚 基序列插入载体 pUCDM 的 MCS1 中的位点中， 并且所述人源脯氨酸羟化酶 亚基序列可以 插入载体 pUCDM 的 MCS2 中的位点中。 0061 5. 根据第 1 或 2 项所述的方法， 其中步骤 (2) 所用的荧光蛋白编码序列编码选自 GFP、 YFP 或 mCh。

41、erry 的荧光蛋白。 0062 6. 根据第 5 项所述的方法， 其中步骤 (2) 所用的荧光蛋白编码序列编码 mCherry 荧光蛋白。 0063 7. 根据第 1 或 2 项所述的方法， 其中 asd 营养缺陷型宿主大肠杆菌 SW106 通过在 大肠杆菌基因组上引入嗜血杆菌入侵 inv 基因， 缺失 asd 基因改造获得。 0064 8.根据第1项所述的方法， 其中步骤(5)中得到的感染成功的家蚕细胞BmN或SF9 细胞的培养条件为 ： 商业化Grace培养基成分， PH 6.4， 添加浓度为80ug/ml的抗坏血酸盐， 温度 28， 静止培养 3 天。 0065 9. 根据第 1 或 。

42、2 项所述的方法， 其中步骤 (6) 的亲和纯化利用镍柱进行。 附图说明 0066 从下面结合附图的详细描述中， 本发明的上述特征和优点将更明显， 其中 ： 0067 图 1 ： 载体 EX-5512-B21 双酶切图 (Xba I 和 Avr II)。泳道 1 ： 1kb 分子量标记， 从下至上依次为1kb、 2kb、 3kb、 4kb、 5kb、 6kb、 7kb、 8kb、 9kb、 10kb ； 泳道2 ： 载体EX-5512-B21 双酶切， 箭头所示的目标条带为胶原蛋白 II 型， 大小为 4635bp。 0068 图 2 ： 重组质粒 pFBDM-col II 双酶切鉴定图。泳道。

43、 1 ： 1kb 分子量标记 ( 同图 1) ； 泳道 2 ： pFBDM-col II 双酶切， 箭头所示的目标条带为胶原蛋白 II 型， 大小为 4635bp。 说 明 书 CN 104313053 A 9 7/9 页 10 0069 图 3 ： 用本发明的方法制备的胶原 II 型表达产物 PAGE 图以及 Western Blot 检测 图。泳道 1 ： 蛋白分子量标记， 从上往下分别为 97.2、 66.4、 44.3KD ； 泳道 2 ： 空白对照 ； 泳道 3-4 ： 胶原 II 型 BmN 细胞蛋白表达， 目的蛋白条带如箭头所示 ； 泳道 5-6 ： Western Blot 检。

44、 测条带， 目的蛋白条带如箭头所示。 0070 图 4 ： 携带红色荧光标签的 BmMNPV-hcol II 病毒感染细胞的红色荧光图。 0071 图 5 ： 胶原蛋白活性测定， 分别为 0.2mg/ml、 0.1mg/ml、 0.05mg/ml 用本发明的方法 制备的胶原蛋白II型、 牛纤连蛋白阳性对照(0.004mg/ml)以及空白阴性对照(生理盐水) 处理的细胞的粘连情况。 0072 图 6 ： 用本发明的方法制备的胶原蛋白 II 型的扫描电镜 (SEM) 观察。 0073 图 7 ： pFBDM 质粒图谱 (MultiBac Expression System User Manual，。

45、 2004)。 0074 图 8 ： pUCDM 质粒图谱 (MultiBac Expression System User Manual， 2004)。 0075 序列表说明 0076 0077 具体实施方式 0078 以下结合具体事例详细说明本发明技术方案的实施方式和效果， 并非对本发明的 限制。 0079 实施例 1 ： 重组质粒的获得 0080 根据EX-5512-B31(由GeneCopoeia合成， Accession No. ： NM_033150， 其ORF序列 如 SEQ ID No.4 所示， 其中包含人源胶原蛋白 II 型全长序列 (SEQ ID No.1) 的多克隆位 。

46、点， 选择酶切位点 Xba I 和 Avr II 对 EX-5512-B31 进行双酶切， 获得所需目的基因， 即， 人 源胶原蛋白 II 型 1 链全长基因 ( 序列如 SEQ ID No.1 所示 )。并合成基因 IRES( 序列如 SEQ ID No.5 所示 ) 与 mCherry( 序列如 SEQ ID No.6 所示 )。然后， 利用 Xba I(Xba I 和 Avr II 互为同尾酶 ) 将人源胶原蛋白 II 型 1 链全长基因 ( 序列如 SEQ ID No.1 所示 ) 连接至转移载体 pFBDM( 购至深圳市宝珠生物科技有限公司， 货号 zt323)， 构建 pFBDM-。

47、col II， 将合成的 IRES 以及 mCherry 共同连接入 pFBDM-col II， 构建重组质粒 pFBDM-IM-col 说 明 书 CN 104313053 A 10 8/9 页 11 II。 0081 人工合成 SEQ ID No.2 所示的人源脯氨酸羟化酶 亚基和 SEQ ID No.3 所 示的人源脯氨酸羟化酶 亚基序列， 共同符合阅读框地连接至转移载体 pUCDM， 获得 重组质粒 pUCDM-P4H-P4H。pUCDM 载体的信息参见 Sun， Jingchen， et al， A High Efficient Method of Constructing Reco。

48、mbinant Bombyx mori(Silkworm)Multiple Nucleopolyhedrovirus Based on Zero-Background Tn7-Mediated Transposition in Escherichia coli， Biotechnol.Prog.， 2009， Vol.25， No.2， pp524-529。 0082 实施例 2 ： 重组人源胶原蛋白 II 型病毒感染 BmN 构建表达载体病毒 0083 将实施例 1 构建的重组质粒 pFBDM-IM-col II 和 pUCDM-P4H-P4H 通过转座 的方式导入 asd 营养缺陷型宿主大。

49、肠杆菌 SW106( 本实验室保存改造， 改造方法参见 Sun， Jingchen et al， Production of recombinant Bombyx mori nucleopolyhedrovirus in silkworm by intrahaemocoelic injection with invasive diaminopimelate auxotrophic Escherichia coli containing BmNPV-Bacmid， Biotechnol.Appl.Biochem. (2010)57， 117-125(Printed in Great Britain)doi ： 10.104。