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1、(10)申请公布号 CN 104293965 A (43)申请公布日 2015.01.21 CN 104293965 A (21)申请号 201410571512.3 (22)申请日 2014.10.23 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 中南民族大学 地址 430074 湖北省武汉市洪山区民族大道 708 号 (72)发明人 沈金花 吕印 刘庆华 (74)专利代理机构 武汉华旭知识产权事务所 42214 代理人 周宗贵 刘荣 (54) 发明名称 一种检测JUMPY基因11号外显子突变的方法 及探针 (57) 摘要 本发明提供了一种用。
2、于检测人类 JUMPY 基因 11 号外显子 R336Q 失活突变的方法， 该方法将荧 光定量PCR技术与TaqMan-MGB荧光探针技术相结 合。 本发明中还提供了用于检测的引物对、 特异性 探针以及阻断核酸。本发明中， 采用荧光定量 PCR 方法， 对失活突变区域序列进行特异性扩增检测， 同时利用阻断核酸抑制样品中野生型 DNA 模板与 引物探针的结合， 实现突变的特异性扩增。 本发明 建立的检测方法简单有效， 检测灵敏度高， 操作简 单快速， 结果判读简单客观， 是一种有效检测人类 JUMPY 基因 11 号外显子 R336Q 失活突变的方法。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页。
3、 说明书 6 页 序列表 1 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书6页 序列表1页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104293965 A CN 104293965 A 1/2 页 2 1.一种用于检测人类JUMPY基因11号外显子R336Q失活突变的方法， 其特征在于包括 以下步骤 ： (1)、 合成检测所需的引物对， 包括上游引物和下游引物， 所述上游引物的基因序列如 SEQ ID NO:1 所示 ： 5 -CGGGCTGCTGGTACACTGTAT-3 ； 所述下游引物的基因序列如 SEQ ID NO:2所示 ： 5 -。
4、ATCCTAACACACCCAAAGAGCAG-3 ； 合成特异性探针， 其基因序列如SEQ ID NO:3 所示 ： 5FAM-TGGGATCGGACCCC-MGB-NFQ-3 ； (2)、 合 成 阻 断 核 酸， 其 基 因 序 列 如 SEQ ID NO:4 所 示 ： 5VIC-TGGGATCAGACCC C-MGB-NFQ-3 ； (3)、 对待检测样品进行处理并提取 DNA ； (4)、 配制荧光定量 PCR 反应体系 A， 对待测样品上样量进行监测， 利用引物对和特异性 探针扩增待测样品， 得到样品 DNA 的检测 Ct 值， 作为样品的质控 Ct 值 ； (5)、 配制荧光定。
5、量 PCR 反应体系 B， 对待测样品进行 PCR 扩增检测， 利用阻断核酸抑 制待测样品中存在的野生型 DNA 即未发生 JUMPY 基因 11 号外显子突变的 DNA， 利用引物对 和特异性探针扩增待测样品中可能存在的 JUMPY 基因 11 号外显子无义突变 DNA， 得到样品 DNA 的突变检测 Ct 值 ； (6)、 以质控 Ct 值作为上样量是否适当的标准， 质控 Ct 值 30 则上样量合适， 检测结 果有效 ； 30 质控 Ct 值 34 则上样量偏低， 可适当提高上样量后检测 ； 以突变检测 Ct 值 与质控Ct的差值Ct值作为JUMPY基因11号外显子是否发生无义突变的判断。
6、标准， Ct 值 6 则样品存在突变， Ct 值 6 则样品无该突变或低于突变检测下限。 2.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于 ： 步骤(4)中所述的荧光定量PCR反应 体系A包括PCR缓冲液、 上游引物、 下游引物、 特异性探针、 Taq酶、 样品DNA以及水， 其中PCR 缓冲液的体积浓度为 50-60， 上游引物和下游引物的浓度均为 0.2M-1M， 特异性探针 的浓度为 0.1M-0.5M， Taq 酶的酶活力为 0.5U-1.0U， 样品 DNA 的体积浓度为 8-20。 3. 根据权利要求 1 所述的检测方法， 其特征在于 ： 步骤 (5) 中所述的荧光定量 PCR 反 。
7、应体系 B 包括 PCR 缓冲液、 上游引物、 下游引物、 特异性探针、 阻断核酸、 Taq 酶、 样品 DNA 以 及水， 其中 PCR 缓冲液的体积浓度为 50-60， 上游引物、 下游引物和阻断核酸的浓度均为 0.2M-1M， 特异性探针的浓度为0.1M-0.5M， Taq酶的酶活力为0.5U-1.0U， 样品DNA 的体积浓度为 8-20。 4. 根据权利要求 1 所述的检测方法， 其特征在于 ： 步骤 (4) 和 (5) 中 PCR 扩增反应步 骤为 ： 95 5min ； 95 15s， 60 1min， 40 个循环 ； 每个循环后收集 FAM 或 VIC 荧光信号。 5. 权利。
8、要求 1 中所述的用于检测人类 JUMPY 基因 11 号外显子 R336Q 失活突变的基因 探针， 其特征在于 ： 该探针的基因序列如 SEQ ID NO:3 所示 ： 5 FAM-TGGGATCGGACCCC-MGB-N FQ-3 。 6. 权利要求 1 中所述的用于检测人类 JUMPY 基因 11 号外显子 R336Q 失活突变的引 物对， 其特征在于 ： 包括上游引物和下游引物， 所述上游引物的基因序列如 SEQ ID NO:1 所示 ： 5 -CGGGCTGCTGGTACACTGTAT-3 ； 所述下游引物的基因序列如 SEQ ID NO:2 所示 ： 5 -ATCCTAACACAC。
9、CCAAAGAGCAG-3 。 7. 权利要求 1 中所述的用于检测人类 JUMPY 基因 11 号外显子 R336Q 失活突变的阻断 核酸， 其特征在于 ： 所述阻断核酸的基因序列如 SEQ ID NO:4 所示 ： 5 VIC-TGGGATCAGACCCC 权 利 要 求 书 CN 104293965 A 2 2/2 页 3 -MGB-NFQ-3 。 权 利 要 求 书 CN 104293965 A 3 1/6 页 4 一种检测 JUMPY 基因 11 号外显子突变的方法及探针 技术领域 0001 本发明提供了一种用于检测人类 JUMPY 基因 11 号外显子 R336Q 失活突变的方法，。
10、 并提供了相关的扩增引物及探针， 属于生物医学技术领域。 背景技术 0002 hJUMPY( 也称为 MTMR14， FLJ22405,Gene ID:64419,C3orf29) 基因是近几年通过 生物信息学方法， 采用人类肌微管素蛋白序列作为诱饵筛选到的一个新基因。 该基因位于3 号染色体上 (3p25.3)， 由 19 个外显子组成， 根据 EST 数据显示第 17 个外显子和第 18 个外 显子是可变的。 预测该基因编码650aa的蛋白(accession no.AK074792)， 并且与已知的肌 微管素的催化环高度同源。该预测的蛋白与果蝇中 II 号染色体上 CG6542 基因编码。
11、的卵衍 生的酪氨酸磷酸酶 (egg-derived tyrosine phosphatase,EDTP) 高度同源。更有趣的是， 在果蝇中， 由于 P- 元件的插入导致了该基因的失活从而致使果蝇产生了 JUMPY 表型 ： 肌肉 功能缺陷、 伴随颤抖以及运动缓慢的肌肉控制功能的逐渐消失。该基因名称也由此而来。 0003 人类肌微管素蛋白 (myotubularins) 是一个大的家族。该家族在人类基因组中至 少有 14 个成员， 分别命名为 MTM1 以及 MTMR(myotubularin-related)1-13。其中 9 个成员 (MTM1、 MTMR1、 MTMR2、 MTMR3、 M。
12、TMR4、 MTMR6、 MTMR7、 MTMR8 以及 MTMR14) 拥有催化活性 , 可 以导致 PI(3)P 以及 PI(3,5)P2 等底物的去磷酸化 , 其它的家族成员由于蛋白酪氨酸磷酸 酶位点上缺乏保守的半胱氨酸残基而不具备催化活性， 因而并认为是 “死的磷酸酶” 。唯一 例外的是 MTMR7， 它最特异的底物是 Ins(1,3)P2。在细胞内， MTM/MTMR 主要调控细胞内的 PI(3)P 以及 PI(3,5)P2， 从而调控细胞内含物与膜转运， 这是 MTM/MTMR 最重要， 也是研究 最清楚的功能。然而， 这些脂质磷酸酶也能调节许多其它的生物学过程， 包括细胞增殖、 。
13、分 化、 坏死、 细胞骨架以及细胞间隙及迁移等。许多磷酸酶都与人类遗传疾病相关， 所以 MTM 或者 MTMR 基因一旦突变会导致两种严重的功能紊乱和疾病 ： 一种是 X- 偶联的肌管肌无力 XLMTM(X-linked myotubular myopathy)， 另外一种是 CMT 疾病 (Charcot-Marie-Tooth)， 主要表现为骨骼肌或者外周神经病变。所有有活性的蛋白酪氨酸磷酸酶 / 双特异性磷酸酶 (PTP/DSPs)(如PTP1B)以及磷脂酰肌醇磷酸酶(如PTEN)都含有保守的CX5R序列。 hJUMPY 也含有预测的 PTP/DSPs 结构域和进化上高度保守的 CX5R。
14、 序列， 因而提示 hJUMPY 主要的 功能也是磷酸酶。的确， hJUMPY 能水解一系列磷酸肌醇， 其中最特异的底物是 PI(3)P 和 PI(3,5)P2。hJUMPY 在不同的组织中表达， 而在骨骼肌组织中高表达， 提示其可能参与骨骼 肌功能的调节。hJUMPY 由于其结构与功能均与上述这些肌微管素蛋白及其相近， 因而后来 也被命名为 MTMR14。 0004 2006 年 Jocelyn Laporte 课题组报道， 在人类中央核肌肉疾病患者中发现了该基 因的一个无义突变 (11 号外显子上的 CGG 突变为了 CAG， 导致了 R336Q 突变 )， 因而进一步 提示 hJUMPY。
15、 与人类遗传病密切相关。后来， 科研人员建立了该基因特异性敲除小鼠， 也进 一步证实在小鼠中该基因的缺失也会导致骨骼肌肌肉疲劳和肌无力。 近年研究也进一步揭 示了该基因与细胞自噬、 心肌肥厚及机体代谢密切相关， 提示该基因非常重要。因而， 设计 说 明 书 CN 104293965 A 4 2/6 页 5 出一套该基因突变的检测方法对于临床上遗传病的筛查也非常必要。 0005 目前基因突变检测的方法很多， 如直接测序法， 焦磷酸测序法， 高分辨率溶解曲线 检测法 (High Resolution Melting Analysis， HRM)， 荧光定量 PCR 法等。其中最常见方法 为测序法，。
16、 该方法费用较低， 但操作耗时长且灵敏度低 ； 高分辨率溶解曲线法对设备要求比 较特殊， 在临床推广存在一定的困难 ； 传统荧光定量 PCR 法在临床上应用较为广泛， 但该方 法检测缺失突变效果较差。 JUMPY基因11号外显子的无义突变发生在基因序列1007bp处， 其中 CGG 突变为 CAG， 导致其催化活性的急剧降低以及功能的紊乱 ( 见表 1)。因此， 需要建 立一种快速有效的检测 JUMPY 基因 11 号外显子无义突变的方法。 0006 表 1 ： JUMPY 基因失活突变 0007 发明内容 0008 本发明提供了一种用于检测人类 JUMPY 基因 11 号外显子 R336Q 。
17、失活突变的方法， 该方法能够解决背景技术中的不足， 检测灵敏度高， 操作简单快速， 结果判读简单客观。 0009 实现本发明上述目的所采用的技术方案为 ： 0010 一种用于检测人类 JUMPY 基因 11 号外显子 R336Q 失活突变的方法， 包括以下步 骤 ： 0011 (1)、 合成检测所需的引物对， 包括上游引物和下游引物， 所述上游引物的基因序 列如 SEQ ID NO:1 所示 ； 所述下游引物的基因序列如 SEQ ID NO:2 所示 ； 合成特异性探针， 其基因序列如 SEQ ID NO:3 所示 ； 0012 (2)、 合成阻断核酸， 其基因序列如 SEQ ID NO:4 。
18、所示 ； 0013 (3)、 对待检测样品进行处理并提取 DNA ； 0014 (4)、 配制荧光定量 PCR 反应体系 A， 对待测样品上样量进行监测， 利用引物对和特 异性探针扩增待测样品， 得到样品 DNA 的检测 Ct 值， 作为样品的质控 Ct 值 ； 0015 (5)、 配制荧光定量 PCR 反应体系 B， 对待测样品进行 PCR 扩增检测， 利用阻断核酸 抑制待测样品中存在的野生型 DNA 即未发生 JUMPY 基因 11 号外显子突变的 DNA， 利用引物 对和特异性探针扩增待测样品中可能存在的 JUMPY 基因 11 号外显子无义突变 DNA， 得到样 品 DNA 的突变检测。
19、 Ct 值 ； 0016 (6)、 以质控 Ct 值作为上样量是否适当的标准， 质控 Ct 值 30 则上样量合适， 检 测结果有效 ； 30质控Ct值34则上样量偏低， 可适当提高上样量后检测 ； 以突变检测Ct 值与质控 Ct 的差值 Ct 值作为 JUMPY 基因 11 号外显子是否发生无义突变的判断标准， Ct 值 6 则样品存在突变， Ct 值 6 则样品无该突变或低于突变检测下限。 说 明 书 CN 104293965 A 5 3/6 页 6 0017 步骤(4)中所述的荧光定量PCR反应体系A包括PCR缓冲液、 上游引物、 下游引物、 特异性探针、 Taq 酶、 样品 DNA 以。
20、及水， 其中 PCR 缓冲液的体积浓度为 50-60， 上游引物和 下游引物的浓度均为 0.2M-1M， 特异性探针的浓度为 0.1M-0.5M， Taq 酶的酶活力 为 0.5U-1.0U， 样品 DNA 的体积浓度为 8-20。 0018 步骤 (5) 中所述的荧光定量 PCR 反应体系 B 包括 PCR 缓冲液、 上游引物、 下游 引物、 特异性探针、 阻断核酸、 Taq 酶、 样品 DNA 以及水， 其中 PCR 缓冲液的体积浓度为 50-60， 上游引物、 下游引物和阻断核酸的浓度均为 0.2M-1M， 特异性探针的浓度为 0.1M-0.5M， Taq 酶的酶活力为 0.5U-1.0。
21、U， 样品 DNA 的体积浓度为 8-20。 0019 步骤 (4) 和 (5) 中 PCR 扩增反应步骤为 ： 95 5min ； 95 15s， 60 1min， 40 个 循环 ； 每个循环后收集 FAM 或 VIC 荧光信号。 0020 本 发 明 所 提 供 的 上 述 特 异 性 探 针 的 的 基 因 序 列 如 SEQ ID NO:3 所 示 ： 5FAM-TGGGATCGGACCCC-MGB-NFQ-3 。所述上游引物的基因序列如 SEQ ID NO:1 所 示 ： 5 -CGGGCTGCTGGTACACTGTAT-3 ； 所述下游引物的基因序列如 SEQ ID NO:2 所。
22、示 ： 5 -ATCCTAACACACCCAAAGAGCAG-3 。所述阻断核酸的基因序列如 SEQ ID NO:4 所示 ： 5 VIC -TGGGATCAGACCCC-MGB-NFQ-3 。 0021 本发明中， 采用荧光定量 PCR 方法， 对失活突变区域序列进行特异性扩增检测， 同 时利用阻断核酸抑制样品中野生型 DNA 模板与引物探针的结合， 实现突变的特异性扩增。 本发明建立的检测方法简单有效， 检测灵敏度高， 操作简单快速， 结果判读简单客观， 是一 种有效检测人类 JUMPY 基因 11 号外显子 R336Q 失活突变的方法。 附图说明 0022 图 1 是采用本发明提供的检测。
23、方法检测 JUMPY 基因野生型样品的扩增曲线图 ； 0023 图 2 为采用本发明提供的检测方法检测 JUMPY 基因 11 号外显子 R336Q 突变样品 的扩增曲线图。 具体实施方式 0024 下面结合附图及具体实施例对本发明做详细具体的说明， 但是本发明的保护范围 并不局限于以下实施例。 0025 本发明实施例中所用的技术， 除非特别说明， 均为本领域的技术人员已知的常规 技术 ； 所用的仪器设备、 试剂等， 除非特别说明， 均为本领域的研究和技术人员可以通过公 共途径获得。 0026 本发明实施例提供一种 JUMPY 基因 11 号外显子的 R336Q 失活突变检测方法， 包括 一组。
24、引物、 特异性探针、 阻断核酸。其中一组引物的序列为 SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2 ； 特异性探针序列为 SEQ ID NO:3 ； 阻断核酸序列为 SEQ ID NO:4， 且序列 3 端经过磷酸化修 饰。 0027 具体的， 所述引物序列如下所示 ： 0028 SEQ ID NO:15 -CGGGCTGCTGGTACACTGTAT-3 0029 SEQ ID NO:25 -ATCCTAACACACCCAAAGAGCAG-3 0030 具体的， 所述特异性探针为TaqMan MGB(Minor Groove Binder)探针类型， 序列如 说 明 书 CN 10429。
25、3965 A 6 4/6 页 7 下所示 ： 0031 SEQ ID NO:35FAM-TGGGATCGGACCCC-MGB-NFQ-3 0032 该特异性探针的5端标记FAM荧光基团， 此外还可选用其他荧光基团， 如VIC等 ； 该特异性探针的 3端连接 MGB 修饰基团， 可以将探针的 Tm 值提高 10左右， 因此对于同 样的 Tm 值， MGB 探针可以比普通 TaqMan 探针设计得更短， 既降低了合成成本， 也使得探针 设计的成功率大为提高。 0033 具体的， 所述阻断核酸为 3 磷酸化序列， 碱基序列如下所示 ： 0034 SEQ ID NO:45VIC-TGGGATCAGAC。
26、CCC-MGB-NFQ-3 0035 该阻断核酸为一条 3 磷酸化碱基序列， 与普通核酸序列的区别在于 3 端最后一 个碱基加入磷酸基团 (PO4)， 在扩增时无法正常延伸， 阻止与该阻断核酸结合的模板的扩 增。在本发明实施例中， 该阻断核酸与野生型 JUMPY 基因 11 号外显子序列结合， 阻止引物 SEQ ID NO:1与该模板的结合扩增 ； 该阻断核酸不与JUMPY基因11号外显子突变序列结合， 则引物 SEQ ID NO:1 与该模板的结合， 并与引物 SEQ ID NO:2、 探针 SEQ ID NO:3 完成突变 模板的特异性扩增， 实现 JUMPY 基因 11 号外显子突变的特。
27、异性检测。 0036 实施例 1 0037 制备本发明提供的 JUMPY 基因 11 号外显子失活突变检测体系。包括以下步骤 ： 0038 1、 引物及探针合成 0039 合成引物序列 SEQ ID NO:1， SEQ ID NO:2 ； 合成特异性探针序列 SEQ ID NO:3， 并 在 5 端标记 FAM 荧光基团， 3 端标记 MGB 修饰基团。 0040 将上述引物分别配制成 100M 的母液储存， 将上述探针分别配制成 100M 的母 液储存。 0041 2、 阻断核酸的合成 0042 合成阻断核酸序列 SEQ ID NO:4， 并在 3 端进行磷酸基团 (PO4) 修饰。 004。
28、3 将阻断核酸配制成 100M 的母液储存。 0044 3、 荧光定量 PCR 反应体系的制备 0045 分别制备质控检测反应体系 (PCR 反应体系 A) 和突变检测反应体系 (PCR 反应体 系 B)， 各组分如下表所示 ： 0046 说 明 书 CN 104293965 A 7 5/6 页 8 0047 实施例 2 0048 用本发明的方法检测 JUMPY 基因 11 号外显子的失活突变， 本实施例中收集 50 例 临床病理诊断为心脏病患者的血液标本， 并从中提取基因组 DNA， 用实施例 1 中得到的突变 检测体系检测样品是否存在JUMPY基因11号外显子的失活突变， 同时采用传统测序。
29、的方法 进行验证， 其步骤具体为 ： 0049 1、 样品的处理 0050 使用DNA提取试剂盒(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit,Cat No.56404)提取上述血 液标本的基因组 DNA。提取方法参照说明书进行。取 2l 所得溶液测 OD 值以确定 DNA 浓 度， 然后将样品 DNA 稀释到 10ng/l， 取 5l 进行下一步的 PCR 反应。 0051 2、 样本的荧光定量 PCR 检测 0052 将提取稀释后的 DNA 样品依次取 5l 分别加入质控检测反应体系和突变检测反 应体系， 并放入荧光定量 PCR 仪， 按如下所示设置 PCR 反应程序后进行扩增反应。
30、 ： 0053 95 5min ； 0054 95 15s， 60 1min， 40 个循环 ； 每个循环后收集 FAM 荧光信号。 0055 3、 样本的检测结果分析 0056 本发明利用阻断核酸抑制野生型模板的扩增， FAM 荧光信号检测缺失突变模板的 扩增， 通过检测的质控 Ct 值判断样本是否有效， 通过突变检测 Ct 值与质控 Ct 的差值判断 是否发生 JUMPY 基因 11 号外显子失活突变。 0057 具体的结果判读标准如下 ： 0058 质控 Ct 值 30 则表明上样量合适， 检测结果有效 ； 30 质控 Ct 值 34 则表明 上样量偏低， 可适当提高上样量后重新检测 ；。
31、 0059 以突变检测 Ct 值与质控 Ct 的差值作为目的基因是否发生突变的判断标准， Ct 值 6 则样品无此突变或低于突变检测下限 ； Ct 值 6 则样品存在此突变。 0060 检测结果如下 ： 0061 50 个样本中， 3 个未得到足量的基因组 DNA， 其余 JUMPY 基因 11 号外显子野生型 样本 45 例， 其中 35 例样本突变检测无 Ct 值， 10 例样本突变检测 Ct 值与质控 Ct 值的 Ct 说 明 书 CN 104293965 A 8 6/6 页 9 值 6， 其中一个检测结果如图 1 所示 ； 0062 JUMPY 基因 11 号外显子失活突变样本仅 2 例， 突变检测 Ct 值与质控 Ct 值的 Ct 值均 6， 其中一个检测结果如图 2 所示。 0063 将上述 2 个样品进行测序， 样本测序结果与荧光定量 PCR 检测结果一致。 0064 以上结果表明本发明用于人类JUMPY基因11号外显子失活突变检测结果可靠， 与 直接测序结果完全符合， 且本发明检测方法灵敏度高于传统测序方法， 操作简单快速， 利于 大规模推广。 说 明 书 CN 104293965 A 9 1/1 页 10 0001 序 列 表 CN 104293965 A 10 1/1 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104293965 A 11 。