人乳头瘤病毒8E7蛋白表达及应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104059934 A (43)申请公布日 2014.09.24 CN 104059934 A (21)申请号 201410194991.1 (22)申请日 2014.05.11 C12N 15/70(2006.01) C07K 16/08(2006.01) (71)申请人 浙江大学 地址 310027 浙江省杭州市西湖区浙大路 38 号 (72)发明人 程浩 陈贤祯 韩睿 朱可建 周强 丁杨 (74)专利代理机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 代理人 张法高 赵杭丽 (54) 发明名称 人乳头瘤病毒 8E7 蛋白表达及应用 (57) 摘要 本发明提供一种。

2、人类乳头瘤病毒 HPV-8E7 蛋 白的表达纯化方法， 通过设计 HPV-8E7 的扩增引 物， 并从 HPV-8E7 质粒中有效扩增出这个基因， 插 入到载体 pGEX-4T2 和 pEGFP-C1 中， 获得重组载 体， 转染， 收集上清与 4B 磁珠结合， 再用凝血酶切 除GST标签， 获取HPV-8E7蛋白， 行多点免疫， 获得 纯化的多克隆抗体。本发明增加了该蛋白原核表 达时的可溶性， 从而降低下游大规模生产成本以 及分离纯化难度， 在提高表达量的同时也有利于 分离纯化， 使该蛋白在工业化放大生产时降低难 度， 减少成本， 并经纯化、 免疫， 得到高特异性、 高 效价比的多克隆抗体，。

3、 能大大提高检测的准确率， 为进一步研究治疗宫颈癌等疾病奠定基础。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表5页 附图2页 (10)申请公布号 CN 104059934 A CN 104059934 A 1/1 页 2 1. 人乳头瘤病毒 8E7 蛋白表达及纯化方法， 其特征在于， 通过以下步骤实现 ： （1）HPV-8E7基因的调取及扩增 ： 设计HPV-8E7的扩增引物， 并从 HPV-8E7 质粒中有 效扩增出这个基因， 其中用于扩增用于原核表达。

4、的HPV-8E7序列的上游引物序列 SEQ ID NO.1 ： 5 -GGATCCATGATTGGTAAAGAGGTCACTGT-3 ， 划线部分为EcoR 酶切位点， 下游引物序 列 SEQ ID NO.2 ： 5 -GAATTCTTATGATCCGCCATGTTTGCA-3 ， 划线部分为BamH 酶切位点 ； 用于扩增用于真核表达的HPV-8E7序列的上游引物序列 SEQ ID NO.3 ： 5 - GAATTCTATG ATTGGTAAAGAGGTCACTGT-3 ， 划线部分为BamH 酶切位点， 下游引物序列 SEQ ID NO.4 ： 5 - GGATCCTTATGATCCGCC。

5、ATGTTTGCA-3 ， 划线部分为EcoR 酶切位点 ； （2）HPV-8E7基因原核及真核表达载体的构建 ： 将步骤 （1） 中得到的这两个含不同酶切 位点的 HPV-8E7 基因序列按照先后顺序插入到载体 pGEX-4T2 和 pEGFP-C1 中， 获得用于后 续同源重组的重组载体 pGEX-4T2-(HPV-8E7) 和 pEGFP-C1-(HPV-8E7) ； （3） GST-(HPV-8E7) 融 合 蛋 白 的 原 核 表 达 ： 将 步 骤 （2）中 构 建 的 重 组 载 体 pGEX-4T2-(HPV-8E7) 转入大肠埃希菌 DH5， 优化 IPTG 浓度、 诱导时间。

6、和诱导温度 ； 在 250-300w 超声功率下， 超声时间 9 秒， 间歇时间 9 秒， 总时长约 3 分钟以破碎细菌， 收集上清 ； （4） GST-(HPV-8E7) 融合蛋白的纯化及 HPV-8E7 蛋白的获得 ： 通过 （3） 步骤获得的上清 与Glutathione-Sepharose 4B磁珠结合， 再用凝血酶切除GST标签， 获取HPV-8E7蛋白， PBS 透析过夜获得纯化的 HPV-8E7 蛋白。 2.根据权利要求1所述的人乳头瘤病毒8E7蛋白表达纯化方法， 其特征在于， 在设计蛋 白表达载体时， 选择含GST标签的pGEX-4T2， 且在蛋白纯化后， 可将GST标签切除，。

7、 使获得的 蛋白更接近天然 HPV-8E7 蛋白， 在诱导蛋白表达时为避免形成不可溶的包涵体， 采取降低 IPTG 的浓度， 缩短诱导时间， 降低诱导温度。 3. 根据权利要求 1 所述的人乳头瘤病毒 8E7 蛋白表达纯化方法， 其特征在于， 步骤 (1)、 (2)、 (3) 中， 大肠埃希菌宿主 DH5、 真核表达载体 pEGFP-C1 购于大连宝生物 TaKaRa， 原核表达载体 pGEX-4T2 从 GE health care 公司购得， HPV-8 型 E7 质粒来源于德国癌症研 究中心应用病毒研究所。 4. 根据权利要求 1 所述方法获得的人乳头瘤病毒 8E7 蛋白在制备多克隆抗体。

8、中的应 用。 权 利 要 求 书 CN 104059934 A 2 1/5 页 3 人乳头瘤病毒 8E7 蛋白表达及应用 技术领域 0001 本发明属生物技术领域， 涉及病毒蛋白的诱导表达和抗体制备， 具体涉及人乳头 瘤病毒 8 型 E7 蛋白原核表达及在制备多克隆抗体中的应用。 背景技术 0002 人乳头瘤病毒 8 型 （Human Papillomavirus type 8, HPV-8） 与皮肤癌的发生发 展密切相关， HPV-8E7 是其主要的致癌蛋白之一。HPV-8E7 蛋白的表达成功可为疫苗的研制 提供技术支持， 也可作为感染干预性研究提供理论方法。 目前临床上缺乏可靠的检测方法，。

9、 HPV-8E7 蛋白抗体的发明可为 HPV 临床检测提供新的方法， 同时为科学研究提供新的方法 学基础。 发明内容 0003 本发明的目的是提供一种人类乳头瘤病毒 HPV-8E7 蛋白的表达、 纯化方法， 通过 以下步骤实现 ： （a）HPV-8E7基因的调取及扩增 ： 设计HPV-8E7的扩增引物， 并从 HPV-8E7 质粒中有效 扩增出这个基因。 0004 其中用于扩增用于原核表达的HPV-8E7序列的上游引物序列 SEQ ID NO.1 ： 5 -G GATCCATGATTGGTAAAGAGGTCACTGT-3 ， 划线部分为EcoR 酶切位点， 下游引物序列 SEQ ID NO.2。

10、 ： 5 -GAATTCTTATGATCCGCCATGTTTGCA-3 ， 划线部分为BamH 酶切位点 ； 用于扩增用于真核表达的HPV-8E7序列的上游引物序列 SEQ ID NO.3 ： 5 - GAATTCTATG ATTGGTAAAGAGGTCACTGT-3 ， 划线部分为BamH 酶切位点， 下游引物序列 SEQ ID NO.4 ： 5 - GGATCCTTATGATCCGCCATGTTTGCA-3 ， 划线部分为EcoR 酶切位点 ； （b）HPV-8E7基因原核及真核表达载体的构建 ： 将步骤 （a） 中得到的这两个含不同酶切 位点的 HPV-8E7 基因序列按照先后顺序插入到。

11、载体 pGEX-4T2 和 pEGFP-C1 中， 获得用于后 续同源重组的重组载体 pGEX-4T2-(HPV-8E7) 和 pEGFP-C1-(HPV-8E7)。 0005 （c） GST-(HPV-8E7) 融合蛋白的原核表达 ： 将步骤 （b）中构建的重组载体 pGEX-4T2-(HPV-8E7) 转入大肠埃希菌 DH5， 优化 IPTG 浓度、 诱导时间和诱导温度。在 250-300w 超声功率下， 超声时间 9 秒， 间歇时间 9 秒， 总时长约 3 分钟以破碎细菌， 收集上 清。 0006 （d） GST-(HPV-8E7) 融合蛋白的纯化及 HPV-8E7 蛋白的获得 ： 通过。

12、 （c）步骤获 得 的 上 清 与 Glutathione-Sepharose 4B 磁珠 （GE healthcare）结合， 再用凝血酶 （GE healthcare） 切除 GST 标签， 获取 HPV-8E7 蛋白， PBS 透析过夜获得纯化的 HPV-8E7 蛋白。 0007 步骤 (1)、 (2)、 (3 中， 大肠埃希菌宿主 DH5、 真核表达载体 pEGFP-C1 购于大连宝 生物 TaKaRa。原核表达载体 pGEX-4T2 从 GE health care 公司购得， HPV-8 型 E7 质粒来源 于德国癌症研究中心应用病毒研究所。 0008 本发明的另一个目的是提供 H。

13、PV-8E7 蛋白在制备多克隆抗体中的应用。本发明获 说 明 书 CN 104059934 A 3 2/5 页 4 得的人类乳头瘤病毒 HPV-11E7 蛋白， 通过免疫动物获得血清并经过纯化获得高特异性、 高 效价比的多克隆抗体。 0009 本发明解决的技术问题是通过原核表达产生可溶性 HPV-8E7 蛋白， 并经纯化、 免 疫， 得到高特异性、 高效价比的多克隆抗体， 为进一步研究治疗宫颈癌等疾病奠定基础。 0010 利用本领域周知的方法可以完成同源重组载体的构建， 在引物的两端引入酶切位 点， 通过酶切产生粘性末端， 可克隆到所需载体。所用标准的分子克隆过程见 （J萨姆布鲁 克等，分子克。

14、隆实验指南 第三版， 科学出版社， 2008.)。 0011 大肠埃希菌 DH5 购于大连宝生物 TaKaRa 公司， pGEX-4T2 原核表达载体购于 GE healthcare， HPV-8 型 E7 基因质粒来源于德国癌症研究中心应用病毒研究所， 293T 细胞购 于中科院上海生命科学研究院细胞资源中心。 0012 转化重组质粒至宿主细菌中可用通常的方法， 如电穿孔、 制备感受态细胞等。 成功 转化的细胞可通过人们熟知的技术加以鉴定， 如细菌经收集并裂解， 提取质粒， 然后 PCR 鉴 定、 酶切鉴定或测序鉴定。 0013 体外获得 HPV-8E7 蛋白， 是通过基因工程手段先在大肠埃。

15、希菌中进行原核表达 GST-HPV-8E7融合蛋白， 经过纯化， 并切除GST标签蛋白， 最终得到HPV-8E7蛋白。 该蛋白在 尖锐湿疣发病机制研究中极具前景， 是 HPV 诊断试剂开发和疫苗研发的基础。 0014 病毒蛋白一般具有不同程度的毒性， 原核表达极容易形成不溶性的包涵体， 申请 人前期在大量的实验条件下， 摸索可溶性蛋白的表达方式。后采用引入 GST 标签， 并降低 IPTG 浓度， 降低诱导时的温度， 缩短诱导时间等措施。增加了该蛋白原核表达时的可溶性， 从而降低下游大规模生产成本以及分离纯化难度， 在提高表达量的同时也有利于分离纯 化， 使该蛋白在工业化放大生产时降低难度， 。

16、减少成本。 为进一步研究治疗宫颈癌等疾病奠 定基础。 0015 HPV 8型是引起尖锐湿疣的主要原因之一， 目前的检测手段很有限， 如PCR,容易造 成假阳性， 或假阴性。 HPV-8抗体的发明可通过免疫组化， 免疫荧光， 酶联免疫吸附反应等技 术来检测HPV 8型病毒的感染， 并且可与PCR技术联用， 来检测HPV 8型的感染， 能大大提高 检测的准确率。 0016 说明书附图 图 1 为重组质粒 pGEX-4T2-(HPV-8E7) 的电泳示意图。图中泳道 M1 ： TaKaRa DL 15,000 DNA marker ； 泳道 1 ： HPV-8E7 基因 （用 PCR 法从 HPV-。

17、8E7 质粒中扩增得到） ； 泳道 2 ： 重 组 pMD-18T-HPV-8E7 质粒 ； 泳道 3 ： 重组 pMD-18T-HPV-8E7 经EcoR 和Xho酶切 ； 泳 道 4 ： pGEX-4T2 质粒 ； 泳道 5 ： pGEX-4T2 质粒经EcoR 和Xho酶切 ； 泳道 6 ： 重组 pGEX-4T2-HPV-8E7 ； 泳道 7 ： 重组 pGEX-4T2-HPV-8E7 经EcoR 和Xho酶切 ； 泳道 M2 ： TaKaRa DL 2,000 DNA marker。 0017 图 2 为重组质粒 pEGFP-C1-(HPV-8E7) 的电泳示意图。泳道 M1 ： T。

18、aKaRa DL 15,000 DNA marker ； 泳道 1 ： HPV-8E7 基因 （用 PCR 法从 HPV-8E7 质粒中扩增得到） ； 泳道 2 ： 重 组 pMD-18T-HPV-8E7 质粒 ； 泳道 3 ： 重组 pMD-18T-HPV-8E7 经EcoR 和BamH 酶切 ； 泳 道 4 ： pEGFP-C1 质粒 ； 泳道 5 ： pEGFP-C1 质粒经EcoR 和BamH 酶切 ； 泳道 6 ： 重组 pEGFP-C1-(HPV-8E7) ； 泳道 7 ： 重组 pEGFP-C1-(HPV-8E7) 经EcoR 和BamH 酶切 ； 泳道 M2 ： TaKaRa 。

19、DL 2,000 DNA marker。 说 明 书 CN 104059934 A 4 3/5 页 5 0018 图 3 为重组蛋白 GST-HPV-8E7 诱导表达、 纯化、 酶切的 PAGE 分析。泳道 1 ： 蛋白预 染marker ； 泳道2 ： 细菌超声破碎后离心所得的上清 ； 泳道before dialysis ： 纯化酶切后的 HPV-8E7 蛋白 ； 泳道 after dialysis ： 透析后的 HPV-8E7 蛋白。 0019 图 4 为兔抗 HPV-8E7 蛋白多克隆抗体的 Western-Blot 效价鉴定。 0020 图 5 为 Western blotting 检。

20、测 HPV-8E7 在 293T 细胞中的表达。泳道 1 ： 293T ； 泳 道 2 ： 293T 转染 pEGFP-C1 质粒 ； 泳道 3 ： 293T 转染 pEGFP-C1-HPV-8E7 质粒。 0021 图 6 为免疫荧光检测 HPV-8E7 在 293T 细胞中的表达。 具体实施方式 0022 本发明结合附图和具体实施例做进一步的说明。 0023 实施例 1 ： HPV 8 型 E7 基因原核表达载体的构建 用 PCR 方法从 HPV-8 purifi ed plasmid DNA 扩增出 HPV-8E7 基因序列 （SEQ ID NO.5） ， 所 用的引物HPV-8E7_P。

21、 up（SEQ ID NO.1） 、HPV-8E7_P dn（SEQ ID NO.2） 由上海生工合成。用 于原核表达的上下游引物分别引入EcoR 和Xho酶切位点 HPV-8E7_P up ： 5 -GGATCCATGATTGGTAAAGAGGTCACTGT-3 HPV-8E7_P dn ： 5 -GAATTCTTATGATCCGCCATGTTTGCA-3 PCR 反应条件 ： 50L 反应体系中， 加入 1L 含 HPV-8 型 E7 基因的质粒， 20mol/L 的 上下游引物各 1L， 2.5mmol/L 的 dNTP mixture 4L， 5Buffer（Mg2+ plus） 10。

22、L， rTaq 聚合酶 0.5L， 剩余用 ddH2O 补足。用 ABI 公司的 ( 型号为 2720)PCR 仪， PCR 反应条件为 94预变性 5 分钟 ； 94变性 30s ； 56退火 30s ； 72延伸 30s， 共 40 个循环以后， 再 72 延伸7min。 通过1.5%凝胶电泳分析得到预期为340bp的用与原核表达的HPV-8E7序列 （SEQ ID NO.6） 。 0024 将上述扩增的产物电泳纯化后用 DNA 片段回收试剂盒回收纯化目的条带。连接至 pMD18-T Vector（TaKaRa ： D101A） ， 转化入 DH5 后， 铺于含 100g/ mL Amp 。

23、的 LB 琼脂平 皿， 37培养过夜。挑选平皿上数个克隆接种 5mL 含 100g/ mL Amp 的 LB 液体培养基中， 37培养过夜。用质粒抽提试剂盒提取 pMD-18T-HPV-8E7 质粒， 并用EcoR 和Xho双酶 切进行初步鉴定， 阳性克隆送上海博尚进一步测序验证正确。 0025 将测序正确的 pMD-18T-HPV-8E7（原核） 用EcoR 和Xho双酶切， 酶切后的产 物电泳纯化后用 DNA 片段回收试剂盒回收纯化目的条带。 0026 原核表达质粒 pGEX-4T2 也用EcoR 和Xho双酶切， 电泳纯化后用 DNA 片段回 收试剂盒回收纯化目的条带。以适当比例将上述线。

24、性 pGEX-4T2 和 HPV-8E7 基因片段混合， 用 T4 DNA 连接酶在 16水浴中连接过夜。 ， 转化入 DH5 后， 铺于含 100g/ mL Amp 的 LB 琼脂平皿， 37培养过夜。挑选平皿上数个克隆接种 5mL 含 100g/ mL Amp 的 LB 液体培 养基中， 37培养过夜。用质粒抽提试剂盒提取 pGEX-4T2-(HPV-8E7) 质粒， 并用EcoR 和 Xho双酶切进行初步鉴定， 阳性克隆送上海博尚进一步测序验证正确。从而完成 HPV-8E7 基因原核表达载体的构建 （见图 1） 。 0027 实施例 2 ： HPV 8 型 E7 基因真核表达载体的构建 。

25、用 PCR 方法从 HPV-8 purifi ed plasmid DNA（ATCC ： 45150D） 扩增出 HPV-8 基因， 所用的 引物HPV-8E7_E up（SEQ ID NO.3） 、HPV-8E7_E dn（SEQ ID NO.4） 由上海生工合成。用于真 说 明 书 CN 104059934 A 5 4/5 页 6 核表达的上下游引物分别引入EcoR 和BamH 酶切位点。 0028 HPV-8E7_E up ： 5 -GAATTCTATGATTGGTAAAGAGGTCACTGT-3 HPV-8E7_E dn ： 5 -GGATCCTTATGATCCGCCATGTTTGCA。

26、-3 PCR 反应条件 ： 50L 反应体系中， 加入 1L 含 HPV-8 型 E7 基因的质粒， 20mol/L 的 上下游引物各 1L， 2.5mmol/L 的 dNTP mixture 4L， 5Buffer（Mg2+ plus） 10L， rTaq 聚合酶 0.5L， 剩余用 ddH2O 补足。用 ABI 公司的 ( 型号为 2720)PCR 仪， PCR 反应条件为 94预变性 5 分钟 ； 94变性 30s ； 56退火 30s ； 72延伸 30s， 共 40 个循环以后， 再 72 延伸7min。 通过1.5%凝胶电泳分析得到预期为310bp的用于真核表达的HPV-8E7序列。

27、 （SEQ ID NO.7） 。 0029 将上述扩增的产物电泳纯化后用 DNA 片段回收试剂盒回收纯化目的条带。连接至 pMD18-T Vector（TaKaRa ： D101A） ， 转化入 DH5 后， 铺于含 100g/ mL Amp 的 LB 琼脂平 皿， 37培养过夜。挑选平皿上数个克隆接种 5mL 含 100g/ mL Amp 的 LB 液体培养基中， 37培养过夜。用质粒抽提试剂盒提取 pMD-18T-HPV-8E7 质粒， 并用EcoR 和BamH 双 酶切鉴定重组质粒， 阳性克隆送上海生工进一步测序验证正确。 0030 将测序正确的 pMD-18T-HPV-8E7（真核） 。

28、用EcoR 和BamH 双酶切， 酶切后的产 物电泳纯化后用 DNA 片段回收试剂盒回收纯化目的条带。 0031 真核表达质粒 pEGFP-C1 也用EcoR 和BamH 双酶切， 电泳纯化后用 DNA 片段 回收试剂盒回收纯化目的条带。以适当比例将上述线性 pEGFP-C1 和 HPV-8E7 基因片段混 合， 用 T4 DNA 连接酶在 16水浴中连接过夜。转化入 DH5 后， 铺于含 50g/ mL kana 的 LB 琼脂平皿， 37培养过夜。挑选平皿上数个克隆接种 5mL 含 50g/ mL kana 的 LB 液体 培养基中， 37培养过夜。用质粒抽提试剂盒提取 pEGFP-C1-。

29、(HPV-8E7) 质粒， 并用EcoR 和BamH 双酶切进行初步鉴定， 阳性克隆送上海博尚进一步测序验证正确。从而完成 HPV-8E7 基因真核表达载体的构建 （见图 2） 。 0032 实施例 3 ： HPV 8 型 E7 蛋白的诱导表达 pGEX-4T2-(HPV-8E7) 质粒分别转化至大肠杆菌 JM109， 接种于含氨苄青霉素 （Amp） 100g/mL 的 LB 培养液， 待细菌 OD 值介于 0.6-0.8 之间， 加 IPTG 至终浓度为 0.2mM， 诱导 温度 ： 26-28， 诱导 4-6h 后收集细菌， 冰浴超声裂解菌体， 4 12000 rpm 10min 离心分离。

30、 上清和沉淀， 并经 15% 聚丙烯凝胶电泳鉴定 （见图 3） 。 0033 实施例 4 ： HPV 8 型 E7 蛋白的纯化和酶切 取菌体上清与 Glutathione-Sepharose 4B 磁珠结合， 再用凝血酶切除 GST 标签， 获取 HPV-8E7 蛋白， PBS 透析蛋白过夜， 并经聚丙烯凝胶电泳鉴定 （见图 3） 。 0034 实施例 5 ： HPV 8 E7 蛋白兔多克隆抗体的制备和纯化 用纯化后的 HPV-8E7 蛋白免疫新西兰雌兔， 体重为 2.5kg 为宜。初次免疫用含 E7 蛋白 500g 的抗原完全弗氏佐剂乳化剂 1.6mL 于兔子背部多点皮内注射， 以后每隔 1。

31、0d 用含 E7 蛋白 500g 的抗原不完全弗氏佐剂乳化剂加强免疫 3 次。耳缘静脉采血， 双向免疫扩散 法测定血清中多价抗血清效价 （1 ： 8 以上符合要求） 。10d 后， E7 蛋白 500g 直接腹股沟 区肌肉注射。5d 后麻醉下心脏取血， 分离血清后分装并置 -20保存。血清按 rProtein G Agaros 说明书操作， 亲和层析获得抗体 IgG。 0035 实施例 6 ： HPV 8 型 E7 多克隆抗体 IgG 的 Western-Blot 效价分析 说 明 书 CN 104059934 A 6 5/5 页 7 将诱导表达的蛋白及牛血清白蛋白 （Bovine Serum。

32、 Albumin, BSA） 作为空白对照， 经 15% SDS-PAGE 凝胶电泳后转膜， 5% 脱脂奶粉封闭 2h， 以多个稀释滴度的兔抗 HPV 8 型 E7 多 克隆抗 IgG 为一抗、 1 ： 5000 羊抗兔 IgG-HRP 为二抗进行免疫印迹， ECL 显色。 （见图 4） 实施例 7 ： HPV 8 型 E7 蛋白多克隆抗体 IgG 的特异性鉴定 （Western blot） 转染 24h 前将 293T 细胞以 5106个 /mL 浓度接种于 10cm 的培养皿 （含 10%FBS 和双抗 的 DMEM 培养基、 5%CO2、 37） 。转染前， 培养基换成无血清的 DMEM。

33、。转染按 Lipofectamine 2000 说明书操作， 将质粒 pEGFP-C1、 重组质粒 pEGFP-C1-(HPV-8E7) 各取 10g 分别与 20l 转染试剂 Lipofectamine 2000 在 DMEM 培养基中形成复合物， 混合室温放置 30 分钟 后覆盖于 10cm 的培养皿， 293T 未转染细胞做转染空白对照。转染 6h 后， 将培养基换成含 10%FBS 的 DMEM， 培养 24h 后， 荧光显微镜下观察转染效率， 终止转染。用 RIPA 细胞裂解液 提取蛋白， 用 BCA 试剂盒 （碧云天） 测蛋白浓度， 以每孔 40g 的总蛋白经 95变性后 5min。

34、 后， 以10% SDS-PAGE凝胶电泳后转膜， 5%脱脂奶粉封闭2h， 以兔抗HPV 8型E7多克隆抗IgG 为一抗， 稀释比 1 ： 5000， 1 ： 5000 羊抗兔 IgG-HRP 为二抗进行免疫印迹， ECL 显色。 （见图 5） 实施例 8 ： HPV 8 型 E7 蛋白多克隆抗体 IgG 的特异性鉴定 （免疫荧光） 转染 24h 前将 293T 细胞以 2.5105个 /mL 浓度接种于放有细胞爬片的 6 孔板 （含 10%FBS 和双抗的 DMEM 培养基、 5%CO2、 37） 。转染前， 培养基换成无血清的 DMEM。转染按 Lipofectamine 2000 说明书。

35、操作， 将质粒 pEGFP-C1、 重组质粒 pEGFP-C1-(HPV-8E7) 各取 4 g 分别与 8 l 转染试剂 Lipofectamine 2000 在 DMEM 培养基中形成复合物， 混合室温放 置 30 分钟后覆盖于 6 孔板中， 293T 未转染细胞做转染空白对照。培养 24h 后， 荧光显微镜 下观察转染效率， 终止转染。将 6 孔板中的细胞爬片用 PBS 洗 3 遍后依次 4% 多聚甲醛室温 固定 10 分钟、 0.1%TritonX-100 室温孵育 7 分钟， 期间 PBS 洗 3 遍， 每次 5 分钟。置于 4保 存或进行免疫荧光分析。免疫荧光实验在暗盒中进行。取出。

36、上述爬有 293T 细胞 （未转染的 作对照） 盖玻片于 10% 山羊血清室温封闭 2h， 1 ： 500（5% 山羊血清稀释） 的 HPV-8E7 兔多克 隆抗体 IgG 为一抗 4孵育过夜， 1 ： 500（5% 山羊血清稀释） 的 Alexa Flour555 羊抗兔 IgG 为二抗室温孵育 1h， 0.5g/ml DAPI 染色 8 分钟， 期间用 PBS 洗 3 遍每次 5min。封片后荧 光显微镜观察 （见图 6） 。 说 明 书 CN 104059934 A 7 1/5 页 8 浙江大学 人乳头瘤病毒 8E7 蛋白表达及应用 7 1 29 DNA 人工序列 从含 HPV-8E7 。

37、基因的质粒中扩增 HPV-8E7 基因的上游引物 （用于原核表达） 1 ggatccatga ttggtaaaga ggtcactgt 29 2 27 DNA 人工序列 从含 HPV-8E7 基因的质粒中扩增 HPV-8E7 基因的下游引物 （用于原核表达） 2 gaattcttat gatccgccat gtttgca 27 3 30 DNA 人工序列 从含 HPV-8E7 基因的质粒中扩增 HPV-8E7 基因的上游引物 （用于真核表达） 3 gaattctatg attggtaaag aggtcactgt 30 4 27 DNA 人工序列 从含 HPV-8E7 基因的质粒中扩增 HPV-。

38、8E7 基因的下游引物 （用于真核表达） 4 序 列 表 CN 104059934 A 8 2/5 页 9 ggatccttat gatccgccat gtttgca 27 5 312 DNA Human papillomavirus type 8 E7 gene CDS (1)(312) 人乳头瘤病毒 8 型 E7 基因序列 5 001-060 atg att ggt aaa gag gtc act gtg caa gat ttt gtg ttg gag tta agt gag ata cag cct MET Ile Gly Lys Glu Val Thr Val Gln Asp Phe V。

39、al Leu Glu Leu Ser Glu Ile Gln Pro 1 5 10 15 20 061-120 gaa gtg tta cca gtt gac ctg ctt tgt gaa gag gaa tta cca aac gaa cag gaa acg gag Glu Val Leu Pro Val Asp Leu Leu Cys Glu Glu Glu Leu Pro Asn Glu Gln Glu Thr Glu 21 25 30 35 40 121-180 gag gag cta gac atc gaa aga act gta ttc aaa att gtt gca ccg t。

40、gt ggc tgc agc tgc Glu Glu Leu Asp Ile Glu Arg Thr Val Phe Lys Ile Val Ala Pro Cys Gly Cys Ser Cys 41 45 50 55 60 181-240 tgt cag gtc aag cta cgt ctt ttt gtc aac gca act gat tcg ggt atc agg acc ttt caa Cys Gln Val Lys Leu Arg Leu Phe Val Asn Ala Thr Asp Ser Gly Ile Arg Thr Phe Gln 61 65 70 75 80 241。

41、-297 gaa ttg ctg ttc aga gac cta cag ctt ctg tgt cct gag tgc cgc ggt aac tgc aaa cat Glu Leu Leu Phe Arg Asp Leu Gln Leu Leu Cys Pro Glu Cys Arg Gly Asn Cys Lys His 81 85 90 95 98 301 ggc gga tca taa Gly Gly Ser * 101 103 6 1000 DNA 人工序列 序 列 表 CN 104059934 A 9 3/5 页 10 CDS (21)(333) 重组载体 pGEX-4T2-(H。

42、PV-8E7) 6 1 gga tct ggt tcg cgt gga tcc atg att ggt aaa gag gtc act gtg caa gat ttt gtg ttg MET Ile Gly Lys Glu Val Thr Val Gln Asp Phe Val Leu 61 gag tta agt gag ata cag cct gaa gtg tta cca gtt gac ctg ctt tgt gaa gag gaa tta Glu Leu Ser Glu Ile Gln Pro Glu Val Leu Pro Val Asp Leu Leu Cys Glu Glu G。

43、lu Leu 121 cca aac gaa cag gaa acg gag gag gag cta gac atc gaa aga act gta ttc aaa att gtt Pro Asn Glu Gln Glu Thr Glu Glu Glu Leu Asp Ile Glu Arg Thr Val Phe Lys Ile Val 181 gca ccg tgt ggc tgc agc tgc tgt cag gtc aag cta cgt ctt ttt gtc aac gca act gat Ala Pro Cys Gly Cys Ser Cys Cys Gln Val Lys L。

44、eu Arg Leu Phe Val Asn Ala Thr Asp 241 tcg ggt atc agg acc ttt caa gaa ttg ctg ttc aga gac cta cag ctt ctg tgt cct gag Ser Gly Ile Arg Thr Phe Gln Glu Leu Leu Phe Arg Asp Leu Gln Leu Leu Cys Pro Glu 301 tgc cgc ggt aac tgc aaa cat ggc gga tca taa gaa ttc ccg ggt cga ctc gag cgg ccg Cys Arg Gly Asn C。

45、ys Lys His Gly Gly Ser * 361 cat cgt gac tga ctg acg atc tgc ctc gcg cgt ttc ggt gat gac ggt gaa aac ctc tga 421 cac atg cag ctc ccg gag acg gtc aca gct tgt ctg taa gcg gat gcc ggg agc aga caa 481 gcc cgt cag ggc gcg tca gcg ggt gtt ggc ggg tgt cgg ggc gca gcc atg acc cag tca 541 cgt agc gat agc gga。

46、 gtg tat aat tct tga aga cga aag ggc ctc gtg ata cgc cta ttt 601 tta tag gtt aat gtc atg ata ata atg gtt tct tag acg tca ggt ggc act ttt cgg gga 661 aat gtg cgc gga acc cct att tgt tta ttt ttc taa ata cat tca aat atg tat ccg ctc 721 atg aga caa taa ccc tga taa atg ctt caa taa tat tga aaa agg aag agt。

47、 atg agt att 781 caa cat ttc cgt gtc gcc ctt att ccc ttt ttt gcg gca ttt tgc ctt cct gtt ttt gct 序 列 表 CN 104059934 A 10 4/5 页 11 841 cac cca gaa acg ctt ggt gaa agt aaa aga tgc tga aga tca gtt ggg gtg cac gag tgg 901 gtt aca tcg aat ggg atc tca aca tgc ggt aag atc ctt gag agt ttt tcg ccc cga aga 96。

48、1 acg ttt tcc aat gat gag cac ttt tta aag ttt ctg cta t 7 897 DNA 人工序列 CDS (64)(375) 重组 pEGFP-C1-(HPV-8E7) 7 1 tct ctc ggc atg gac gag ctg tac aag tcc gga ctc aga tct cga gct caa gct tcg aat 61 tct atg att ggt aaa gag gtc act gtg caa gat ttt gtg ttg gag tta agt gag ata cag MET Ile Gly Lys Glu Val Thr Val Gln Asp Phe Val Leu Glu Leu Ser Glu Ile Gln 121 cct 。