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1、(10)申请公布号 CN 104068371 A (43)申请公布日 2014.10.01 CN 104068371 A (21)申请号 201410276810.X (22)申请日 2014.06.20 A23L 1/24(2006.01) C12N 1/14(2006.01) C12N 1/16(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/08(2006.01) C12R 1/225(2006.01) C12R 1/69(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 贵州大学 地址 550025 贵州省贵阳市花溪区贵州大学 (北区) 科。
2、技处 (72)发明人 曾海英 秦礼康 杨成友 贺圣凌 (74)专利代理机构 贵阳东圣专利商标事务有限 公司 52002 代理人 袁庆云 (54) 发明名称 一种豆瓣辣酱促熟增香发酵菌剂及其制备方 法 (57) 摘要 本发明公开了一种豆瓣辣酱促熟增香发酵 菌剂及其制备方法, 由下述菌种短小芽胞杆菌、 发酵乳杆菌、 双发酵乳杆菌、 鲁氏酵母、 米曲霉经 扩繁培养 ; 混合按 4%-8% 比例接种于灭菌基质 载体培养基上, 32条件下, 培养 48h, 菌落计数 达 108-1010cfu/mL ; 发酵完成后添加 6-10% 蔗糖, 1-5%明胶与2-5%甘油作抗热保护剂, 并将其平铺 薄层, 于。
3、50-60下, 远红外干燥2-3h后真空包装 即得。本发明强化豆瓣辣酱促熟、 增香发酵, 稳定 和提升豆瓣辣酱产品品质。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 (10)申请公布号 CN 104068371 A CN 104068371 A 1/1 页 2 1. 一种豆瓣辣酱促熟增香发酵菌剂, 由下述菌种制得 : 短小芽胞杆菌 (Bacillus pumilus)、 发酵乳杆菌 (L. fermentum) 、 双发酵乳杆菌 (L. bifermentans) 、 鲁氏酵母 (Zygos。
4、accharomyces rouxii) 、 米曲霉 (Aspergillus oryzae) 。 2. 一种豆瓣辣酱促熟增香发酵菌剂的制备方法, 包括下述步骤 : (1) 扩繁培养 : 短小芽胞杆菌 (Bacillus pumilus) 经活化纯检合格后, 接种于营养肉汤培养基中 35-37条件下, 培养 24h, 菌落计数达 106-109cfu/mL 时, 离心取沉淀, 蒸馏水洗脱沉淀 2-4 次, 制备成休止态细胞 ; 发酵乳杆菌 (L. fermentum) 与双发酵乳杆菌 (L. bifermentans), 分别经活化纯检合 格后, 接种于MRS液体培养基中40-42条件下, 培。
5、养36h, 菌落计数达106-109cfu/mL时, 离 心取沉淀, 蒸馏水洗脱沉淀 2-4 次, 制备成休止态细胞 ; 鲁氏酵母 (Zygosaccharomyces rouxii) 与米曲霉 (Aspergillus oryzae) , 经活化纯检 合格后, 接种于PDA液体培养基中26-28条件下, 培养48h, 菌落计数达106-109cfu/mL时, 离心取沉淀, 蒸馏水洗脱沉淀 2-4 次, 制备成休止态细胞 ; (2) 混合发酵 : 按重量份, 将步骤 (1) 制得的短小芽胞杆菌 20-30 份、 发酵乳杆菌 10-15 份、 双发酵乳 杆菌 10-15 份、 鲁氏酵母 20-3。
6、0 份、 米曲霉 20-30 份混合, 混合菌剂按 4%-8% 比例接种于灭 菌基质载体培养基上, 32条件下, 培养 48h, 菌落计数达 108-1010cfu/mL ; 其中 : 基质载体培养基配方为 : 基质载体 (面粉 : 米粉 =2-4:1-3) 过 40 目, 并加入葡萄 糖 5-10%, 蛋白粉 2-6%, 蒸馏水 15-25%, pH6.5-7.5, 灭菌 ; (3) 常压干燥 : 发酵完成后添加6-10%蔗糖, 1-5%明胶与2-5%甘油作抗热保护剂, 并将其平铺薄层, 于 50-60下, 远红外干燥 2-3h 后真空包装即得。 3. 如权利要求 1 所述的一种豆瓣辣酱促熟。
7、增香发酵的生物发酵菌剂的制备方法, 其 中 : 平铺薄层是平铺为高度 1.0cm 的薄层。 权 利 要 求 书 CN 104068371 A 2 1/6 页 3 一种豆瓣辣酱促熟增香发酵菌剂及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及食品生物技术领域, 具体来说是一种豆瓣辣酱促熟增香发酵菌剂, 同 时还涉及该豆瓣辣酱促熟增香发酵菌剂的制备方法。 0002 背景技术 0003 发酵食品, 因微生物生化改良所赋予的高营养价值和生理功能, 已逐渐成为全球 化趋势食品, 占世界膳食消费的30-40 %, 日益受到世界各国的高度重视。 豆瓣(broad-bean sauce) 作为一种中国独有的名特发酵。
8、调味品, 起源于四川民间, 有近 300 年的生产历史。 0004 豆瓣产品可分为甜豆瓣 ( 不加辣椒 ) 和辣豆瓣 ( 加入辣椒 ) 两大类, 其中豆瓣辣 酱或称蚕豆辣酱, 以色泽油润红亮、 酱酯香浓郁、 味鲜辣醇和、 体态粘稠绒实等特点而著称, 能够增加菜肴的色、 香、 味、 形, 是川、 黔菜烹调及火锅底料加工中不可缺少的主料, 有 “川菜 之魂” 的美誉, 产量占豆瓣总量的 70以上。近年来, 随着饮食习惯的不断交融与渗透, 国 内外豆瓣辣酱需求量日益剧增, 据了解年需求量可达几十亿元, 产量已有供不应求之势。 传 统豆瓣辣酱的制作工艺 (蚕豆豆瓣、 浸泡、 蒸煮裹面粉自然富集或纯菌接。
9、种制曲、 蚕豆曲加 盐水制醅、 室外瓦缸日晒夜露或大池保温发酵、 豆瓣原汁与腌制辣椒醅混合、 室外瓦缸日晒 夜露或大池保温后熟) 劳动强度大, 投料受季节限制, 接种不均匀, 制曲质量不稳定, 卫生指 标不易控制, 产品质量难以保证。更为突出的是, 豆瓣辣酱传统工艺发酵周期极长, 一般至 少半年以上, 有的产品甚至要求后熟期长达 1 年以上, 严重制约着其产业的发展, 成为企业 急待解决的难题。 0005 发明内容 0006 本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种强化豆瓣辣酱促熟、 增香发酵, 稳 定和提升豆瓣辣酱产品品质的豆瓣辣酱促熟增香发酵菌剂。 0007 本发明的另一目的在于提供该豆瓣。
10、辣酱促熟增香发酵菌剂的制备方法。 0008 本发明的一种豆瓣辣酱促熟增香发酵菌剂, 由下述菌种制得 : 短小芽胞杆菌 (Bacillus pumilus)、 发酵乳杆菌 (L. fermentum) 、 双发酵乳杆菌 (L. bifermentans) 、 鲁氏酵母 (Zygosaccharomyces rouxii) 、 米曲霉 (Aspergillus oryzae) 。 0009 本发明的一种豆瓣辣酱促熟增香发酵菌剂的制备方法, 包括下述步骤 : (1) 扩繁培养 : 短小芽胞杆菌 (Bacillus pumilus) 经活化纯检合格后, 接种于营养肉汤培养基中 35-37条件下, 培养。
11、 24h, 菌落计数达 106-109cfu/mL 时, 离心取沉淀, 蒸馏水洗脱沉淀 2-4 次, 制备成休止态细胞 ; 发酵乳杆菌 (L. fermentum) 与双发酵乳杆菌 (L. bifermentans), 分别经活化纯检合 格后, 接种于MRS液体培养基中40-42条件下, 培养36h, 菌落计数达106-109cfu/mL时, 离 说 明 书 CN 104068371 A 3 2/6 页 4 心取沉淀, 蒸馏水洗脱沉淀 2-4 次, 制备成休止态细胞 ; 鲁氏酵母 (Zygosaccharomyces rouxii) 与米曲霉 (Aspergillus oryzae) , 经活。
12、化纯检 合格后, 接种于PDA液体培养基中26-28条件下, 培养48h, 菌落计数达106-109cfu/mL时, 离心取沉淀, 蒸馏水洗脱沉淀 2-4 次, 制备成休止态细胞。 0010 (2) 混合发酵 : 按重量份, 将步骤 (1) 制得的短小芽胞杆菌 20-30 份、 发酵乳杆菌 10-15 份、 双发酵乳 杆菌 10-15 份、 鲁氏酵母 20-30 份、 米曲霉 20-30 份混合, 混合菌剂按 4%-8% 比例接种于灭 菌基质载体培养基上, 32条件下, 培养 48h, 菌落计数达 108-1010cfu/mL ; 其中 : 基质载体培养基配方为 : 基质载体 (面粉 : 米粉。
13、 =2-4:1-3) 过 40 目, 并加入葡萄 糖 5-10%, 蛋白粉 2-6%, 蒸馏水 15-25%, pH6.5-7.5, 灭菌。 0011 (3) 常压干燥 : 发酵完成后添加6-10%蔗糖, 1-5%明胶与2-5%甘油作抗热保护剂, 并将其平铺薄层, 于 50-60下, 远红外干燥 2-3h 后真空包装即得。 0012 上述的一种豆瓣辣酱促熟增香发酵的生物发酵菌剂的制备方法, 其中 : 平铺薄层 是平铺为高度 1.0cm 的薄层。 0013 本发明与现有技术相比, 具有明显的有益效果, 从以上技术方案可知 : 本发明所选 菌种均来源于各菌种保藏中心, 因此纯化菌株有保障, 通过活。
14、化、 复检、 筛选获得高蛋白酶 活、 高脂肪水解酶活、 高肽酶活、 高产香益酵安全菌株, 并经传统经典微生物形态学、 生理生 化学、 生态学鉴定及分子生物学鉴定 (16sDNA 测序、 26sDNA 测序、 ITS 测序) 验证生物学分 类地位和菌种生物学特性清楚。具有发酵性能好, 酶活性高, 安全、 易保藏等特点。制备的 生物菌剂干燥后菌剂活菌率可达 80%, 可实现人工接种、 菌群强化豆瓣辣酱促熟、 增香发酵。 有利于缩短生产周期, 稳定和提升产品品质。且方法简单, 易操作, 且活菌率高, 经济可行。 0014 下面通过具体实施方式对本发明作进一步说明。 0015 具体实施方式 0016 。
15、实施例 1 一种豆瓣辣酱促熟增香发酵菌剂的制备方法, 包括下述步骤 : (1) 扩繁培养 : 短小芽胞杆菌 (Bacillus pumilus) ACCC10615(来源于中国农业微生物菌种保藏管 理中心) 经活化纯检合格后, 接种于营养肉汤培养基中 37条件下, 培养 24h, 菌落计数达 106-109cfu/mL 时, 离心取沉淀, 蒸馏水洗脱沉淀 2-4 次, 制备成休止态细胞 ; 发酵乳杆菌 (L. fermentum) CCTCCM87079(来源于中国典型培养物保藏中心)与双 发酵乳杆菌 (L. bifermentans)CGMCC1.1876(来源于 JCM 日本微生物菌种保藏。
16、社 (Japan Culture Collection of Microorganisms) ) , 分别经活化纯检合格后, 接种于MRS液体培养 基中42条件下, 培养36h, 菌落计数达106-109cfu/mL时, 离心取沉淀, 蒸馏水洗脱沉淀2-4 次, 制备成休止态细胞 ; 鲁氏酵母 (Zygosaccharomyces rouxii) CICC32899(中国工业微生物菌种保藏管理 中心) 与米曲霉 (Aspergillus oryzae) (CGMCC3.4383 ; 来源中国普通微生物菌种保藏管 说 明 书 CN 104068371 A 4 3/6 页 5 理中心) , 经活化。
17、纯检合格后, 接种于 PDA 液体培养基中 28条件下, 培养 48h, 菌落计数达 106-109cfu/mL 时, 离心取沉淀, 蒸馏水洗脱沉淀 2-4 次, 制备成休止态细胞。 0017 (2) 混合发酵 : 按重量份, 将步骤 (1) 制得的短小芽胞杆菌 20 份、 发酵乳杆菌 10 份、 双发酵乳杆菌 10 份、 鲁氏酵母 20 份、 米曲霉 20 份混合, 混合菌剂按 4% 比例接种于灭菌基质载体培养基上, 32条件下, 培养 48h, 菌落计数达 108-1010cfu/mL ; 其中 : 基质载体培养基配方为 : 基质载体 (面粉 : 米粉 =2-4:1-3) 过 40 目, 。
18、并加入葡萄 糖 5-10%, 蛋白粉 2-6%, 蒸馏水 15-25%, pH6.5-7.5, 灭菌。 0018 (3) 常压干燥 : 发酵完成后添加6%蔗糖, 1%明胶与2%甘油作抗热保护剂, 并将其平铺为高度1.0cm的 薄层, 于 50下, 远红外干燥 3h 后真空包装即得。 0019 试验结果 对制得的豆瓣辣酱促熟增香生物菌剂进行活菌计数, 结果表明其细菌菌落总数测定为 1.6107CFU/g, 霉菌及酵母菌菌落总数测定为 5.3107CFU/g ; 水分含量为 8.1%。 0020 实施例 2 一种豆瓣辣酱促熟增香发酵菌剂的制备方法, 包括下述步骤 : (1) 扩繁培养 : 短小芽胞。
19、杆菌 (Bacillus pumilus) ACCC10615(来源于中国农业微生物菌种保藏管 理中心) 经活化纯检合格后, 接种于营养肉汤培养基中 35条件下, 培养 24h, 菌落计数达 106-109cfu/mL 时, 离心取沉淀, 蒸馏水洗脱沉淀 2-4 次, 制备成休止态细胞 ; 发酵乳杆菌 (L. fermentum) CCTCCM87079(来源于中国典型培养物保藏中心)与双 发酵乳杆菌 (L. bifermentans)CGMCC1.1876(来源于 JCM 日本微生物菌种保藏社 (Japan Culture Collection of Microorganisms) ) , 。
20、分别经活化纯检合格后, 接种于MRS液体培养 基中40条件下, 培养36h, 菌落计数达106-109cfu/mL时, 离心取沉淀, 蒸馏水洗脱沉淀2-4 次, 制备成休止态细胞 ; 鲁氏酵母 (Zygosaccharomyces rouxii) CICC32899(中国工业微生物菌种保藏管理 中心) 与米曲霉 (Aspergillus oryzae) (CGMCC3.4383 ; 来源中国普通微生物菌种保藏管 理中心) , 经活化纯检合格后, 接种于 PDA 液体培养基中 26条件下, 培养 48h, 菌落计数达 106-109cfu/mL 时, 离心取沉淀, 蒸馏水洗脱沉淀 2-4 次, 。
21、制备成休止态细胞。 0021 (2) 混合发酵 : 按重量份, 将步骤 (1) 制得的短小芽胞杆菌 25 份、 发酵乳杆菌 12 份、 双发酵乳杆菌 12 份、 鲁氏酵母 25 份、 米曲霉 25 份混合, 混合菌剂按 6% 比例接种于灭菌基质载体培养基上, 32条件下, 培养 48h, 菌落计数达 108-1010cfu/mL ; 其中 : 基质载体培养基配方为 : 基质载体 (面粉 : 米粉 =2-4:1-3) 过 40 目, 并加入葡萄 糖 5-10%, 蛋白粉 2-6%, 蒸馏水 15-25%, pH6.5-7.5, 灭菌。 0022 (3) 常压干燥 : 在混合发酵结束后添加 8% 。
22、蔗糖, 3% 明胶与 3% 甘油作抗热保护剂, 并将其平铺为高度 1.0cm 的薄层, 于 55下, 远红外干燥 2.5h 后真空包装即得。 0023 试验结果 说 明 书 CN 104068371 A 5 4/6 页 6 对制得的豆瓣辣酱促熟增香生物菌剂进行活菌计数, 结果表明其细菌菌落总数测定为 6.9106CFU/g, 霉菌及酵母菌菌落总数测定为 1.3107CFU/g ; 水分含量为 7.9%。 0024 实施例 3 一种豆瓣辣酱促熟增香发酵菌剂的制备方法, 包括下述步骤 : (1) 扩繁培养 : 短小芽胞杆菌 (Bacillus pumilus) ACCC10615(来源于中国农业微。
23、生物菌种保藏管 理中心) 经活化纯检合格后, 接种于营养肉汤培养基中 36条件下, 培养 24h, 菌落计数达 106-109cfu/mL 时, 离心取沉淀, 蒸馏水洗脱沉淀 2-4 次, 制备成休止态细胞 ; 发酵乳杆菌 (L. fermentum) CCTCCM87079(来源于中国典型培养物保藏中心)与双 发酵乳杆菌 (L. bifermentans)CGMCC1.1876(来源于 JCM 日本微生物菌种保藏社 (Japan Culture Collection of Microorganisms) ) , 分别经活化纯检合格后, 接种于MRS液体培养 基中41条件下, 培养36h, 菌。
24、落计数达106-109cfu/mL时, 离心取沉淀, 蒸馏水洗脱沉淀2-4 次, 制备成休止态细胞 ; 鲁氏酵母 (Zygosaccharomyces rouxii) CICC32899(中国工业微生物菌种保藏管理 中心) 与米曲霉 (Aspergillus oryzae) (CGMCC3.4383 ; 来源中国普通微生物菌种保藏管 理中心) , 经活化纯检合格后, 接种于 PDA 液体培养基中 27条件下, 培养 48h, 菌落计数达 106-109cfu/mL 时, 离心取沉淀, 蒸馏水洗脱沉淀 2-4 次, 制备成休止态细胞。 0025 (2) 混合发酵 : 按重量份, 将步骤 (1) 。
25、制得的短小芽胞杆菌 30 份、 发酵乳杆菌 15 份、 双发酵乳杆菌 15 份、 鲁氏酵母 30 份、 米曲霉 30 份混合, 混合菌剂按 8% 比例接种于灭菌基质载体培养基上, 32条件下, 培养 48h, 菌落计数达 108-1010cfu/mL ; 其中 : 基质载体培养基配方为 : 基质载体 (面粉 : 米粉 =2-4:1-3) 过 40 目, 并加入葡萄 糖 5-10%, 蛋白粉 2-6%, 蒸馏水 15-25%, pH6.5-7.5, 灭菌。 0026 (3) 常压干燥 : 在混合发酵结束后添加 10% 蔗糖, 5% 明胶与 5% 甘油作抗热保护剂, 并将其平铺为高度 1.0cm 。
26、的薄层, 于 60下, 远红外干燥 2h 后真空包装即得。 0027 试验结果 对制得的豆瓣辣酱促熟增香生物菌剂进行活菌计数, 结果表明其细菌菌落总数测定为 8.4107CFU/g, 霉菌及酵母菌菌落总数测定为 2.1107CFU/g ; 水分含量为 7.2%。 0028 应用例 将前述3个实施例所得豆瓣辣酱促熟增香生物菌剂, 按5%量接种于豆瓣、 辣椒混合样, 进行发酵后熟 30 天, 并与传统后熟 55 天的优质豆瓣辣酱进行对比, 结果如下 : (1) 感观评定 表 1 产品理化指标测定 项 目实施例 1 实施例 2 实施例 3 企业标准 (传统产品) 水分含量 %51.4150.1657。
27、.14 60.0(59.36) 盐分含量 g/100g10.2412.1812.97 18.0(12.76) 总酸 (以乳酸计) %1.411.481.52 1.6(1.62) 可溶性糖含量 g/kg12.5412.0211.54-(12.27) 蛋白质含量 (g/100g)5.725.875.43-(6.01) (2) 微生物检测 说 明 书 CN 104068371 A 6 5/6 页 7 表 2 产品微生物学指标测定 样品霉菌 (cfu/g)细菌 (cfu/g)大肠菌群 (MPN)致病菌 传统产品4.01041.41041100不得检出 实施例 12.41061.210775不得检出 实。
28、施例 28.51051.910575不得检出 实施例 32.61055.110575不得检出 (3) 色差测定 采用 WSC-S 测色色差仪对豆瓣辣酱促熟增香发酵菌剂使用后的实施例和传统产品进 行色差对比。结果显示实施例色差 ? 值与传统优质产品相比, 黑色减小、 红色加深, 产品色 泽得到明显的改善。对实施例和传统产品 L 、 A 、 B 值进行方差的单变量分析, 其 P 值 均小于 0.01, 表明两种产品在色差上存在着极显著性差异。 0029 表 3 产品色差值对比 色差值实施例 1 实施例 2 实施例 3 实施例 ? 值 传统产品 L (黑色)15.26415.23915.01915.。
29、17412.288 A (红色)33.09834.68335.92734.56927.312 B (黄色)0.4320.4570.4680.452-0.318 (4) 挥发性风味物质分析 在豆瓣辣酱后熟过程中采用固相萃取技术结合气质联用技术检查其挥发性物质, 发现 可检出的化合物主要有 : 醇、 酯、 酸、 酚和吡嗪等。 实施例共定性了主要风味物质40种 (以? 值计) , 其中烷类物质 9 种 (12.252%) , 酯类物质 11 种 (21.69%) , 醛类物质 4 种 (1.921%) , 醇类物质 3 种 (7.779%) , 酸类物质 5 种 (41.245%) , 其它物质 8。
30、 种 ; 其中花香味和果香味所 占比例很大, 且伴有浓郁酱香味。传统优质豆瓣辣酱共定性了主要风味物质 36 种, 其中烷 类物质 3 种 (1.364%) , 酯类物质 13 种 (11.419%) , 醛类物质 4 种 (0.936%) , 醇类物质 6 种 (75.594%) , 酸类物质 0 种, 其它物质 10 种。其中花香味和水果香味丰富多种, 但其酒味重, 且伴有杂醇油气味。对比可以看出, 实施例酱香味浓郁, 有丰富的花香味及果香味, 且香味 纯正, 柔和。 0030 (5) 氨基酸分析 采用 L-8800 氨基酸自动分析仪进行游离酸含量测量, 结果表明实施例 ? 游离氨基酸 总含。
31、量为 21.74765mg/g, 传统优质成品游离氨基酸总含量仅为 16.6641mg/g。实施例 ? 游离氨基酸种类为 17 种 ; 其中人体必需氨基酸有 7 种, 且总含量为 6.9521mg/g, 传统优 质成品游离氨基酸种类为 16 种, 缺苏氨酸 ; 其中人体必需氨基酸为 6 种, 且总含量仅为 5.972287mg/g。 0031 表 3-17 游离氨基酸含量测定 游离氨基酸名称传统产品 实施例 1(mg/g) 实施例 2(mg/g) 实施例 3(mg/g) 实施例 ? 值 (mg/g) 天冬氨酸 (Asp)1.6081.4581.4531.4621.458 苏氨酸 (Thr)-0。
32、.9380.7980.9890.908 丝氨酸 (Ser)2.0162.4112.2932.3032.336 谷氨酸 (Glu)3.5955.5935.3865.4895.489 甘氨酸 (Gly)0.3080.3670.3490.3490.355 丙氨酸 (Ala)0.8060.8710.8930.9880.917 缬氨酸 (Val)1.1501.3621.3881.3621.371 甲硫氨酸 (Met)0.2310.3120.3140.3230.316 异亮氨酸 (Ile)0.8561.0211.1380.9871.049 亮氨酸 (Leu)1.4381.7881.7071.7921.76。
33、2 说 明 书 CN 104068371 A 7 6/6 页 8 酪氨酸 (Tyr)0.6760.7430.7520.7230.739 苯丙氨酸 (Phe)1.2451.6211.6321.6111.621 赖氨酸 (Lys)1.0521.3091.2851.2911.295 氨气 (NH3)0.9081.2631.3011.2691.278 组氨酸 (His)0.0920.2490.2660.3470.287 精氨酸 (Arg)0.6840.6120.5310.5520.565 游离氨基酸总含量16.66421.91821.48621.83721.747 以上所述, 仅是本发明的较佳实施例而已, 并非对本发明做任何形式上的限制, 任何 未脱离本发明技术方案内容, 依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、 等同变化与修饰, 均仍属于本发明技术方案的范围内。 说 明 书 CN 104068371 A 8 。