一种具有天冬氨酸激酶活性的多肽及其应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104099308 A (43)申请公布日 2014.10.15 CN 104099308 A (21)申请号 201310113874.3 (22)申请日 2013.04.03 CCTCC NO:M 2013100 2013.03.22 C12N 9/12(2006.01) C12N 15/54(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12P 13/08(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (71)申请人 上海凯赛生物技术研发中心有限公 司 地址 201203 上海市浦东新区张江高科技园 。

2、区蔡伦路 1690 号 5 幢 4 楼 申请人 凯赛生物产业有限公司 (72)发明人 周豪宏 刘驰 庞振华 陈祖华 吴亚斌 李乃强 (74)专利代理机构 上海华工专利事务所 ( 普通 合伙 ) 31104 代理人 应云平 (54) 发明名称 一种具有天冬氨酸激酶活性的多肽及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种具有天冬氨酸激酶 III 活 性的多肽， 天冬氨酸激酶 III 的第 342 位异亮氨 酸残基被除了异亮氨酸以外的任意氨基酸残基取 代。过量表达本发明的突变型天冬氨酸激酶能够 提高赖氨酸产量。这为优化赖氨酸的生物合成提 供了更多选择， 有助于构建赖氨酸生产菌株或提 高赖氨酸产量。 (8。

3、3)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 9 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 序列表9页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104099308 A CN 104099308 A 1/1 页 2 1.一种具有天冬氨酸激酶III活性的多肽， 其特征在于， 天冬氨酸激酶III的第342位 异亮氨酸残基被除了异亮氨酸以外的任意氨基酸残基取代。 2.根据权利要求1所述的多肽， 其特征在于， 天冬氨酸激酶III的第342位异亮氨酸残 基被丙氨酸残基取代。 3.根据权利要求1或2所述的多肽。

4、， 其特征在于， 所述天冬氨酸激酶III具有如SEQ ID NO ： 1 所示的氨基酸序列。 4.一种具有天冬氨酸激酶III活性的多肽， 其特征在于， 在如权利要求1-3中任一项所 述的多肽的基础上插入、 缺失或取代一个或多个氨基酸残基。 5. 一种多聚核苷酸， 其特征在于， 所述多聚核苷酸编码如权利要求 1-4 中任一项所述 的多肽。 6. 一种表达载体， 其特征在于， 包含如权利要求 5 所述的多聚核苷酸。 7.一种宿主细胞， 其特征在于， 包含如权利要求5所述的多聚核苷酸或如权利要求6所 述的表达载体。 8. 根据权利要求 7 所述的宿主细胞， 其特征在于， 所述宿主细胞为细菌。 9. 。

5、根据权利要求 8 所述的宿主细胞， 其特征在于， 所述细菌为大肠杆菌， 保藏号为 CCTCC M2013100。 10. 如权利要求 7-9 中任一项所述的宿主细胞在生产赖氨酸中的应用。 权 利 要 求 书 CN 104099308 A 2 1/8 页 3 一种具有天冬氨酸激酶活性的多肽及其应用 技术领域 0001 本发明属于基因工程领域， 具体地说， 本发明涉及一种具有天冬氨酸激酶活性的 多肽及其应用。 背景技术 0002 氨基酸被广泛用于饲料添加、 食品、 营养品和药品。近年来， 全球氨基酸年产量达 到数百万吨。其中天冬氨酸家族的氨基酸， 如赖氨酸、 苏氨酸， 得到广泛应用。天冬氨酸族 氨。

6、基酸可以通过微生物发酵进行生产， 使用的微生物主要包括谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌。 0003 天冬氨酸家族氨基酸在大肠杆菌内的生物合成需要经过一系列生化反应步骤。 其 中至关重要的一个步骤， 天冬氨酸变为 - 磷酸天冬氨酸， 是由天冬氨酸激酶催化的。在 大肠杆菌中， 天冬氨酸激酶有三种同工酶 ： 天冬氨酸激酶 I、 II 和 III。天冬氨酸激酶 I 和 II 是双功能酶， 它们同时具备高丝氨酸脱氢酶活性。天冬氨酸激酶 I 是由 thrA 基因 编码的， 其活性受苏氨酸的抑制， 它的表达受苏氨酸和异亮氨酸抑制 （F.Falcoz-Kelly et al.(1969),Eur.J.Biochem.8。

7、:146-152） 。 天冬氨酸激酶II是由metL基因编码的， 它的表达 受甲硫氨酸抑制 （J.C.Patte et al.(1967),Biochim.Biophys.Acta.136:245-257） 。天冬 氨酸激酶 III 是由 lysC 基因编码的， 它的活性和表达都受到赖氨酸的抑制 （Truffa-Bachi et al.(1968),Eur.J.Biochem.5:73-80） 。 0004 野生型的大肠杆菌天冬氨酸激酶 III 基因序列如 SEQ ID NO ： 2 所示。天冬氨酸 激酶 III 在以发酵法制备赖氨酸和苏氨酸的生产中受到广泛关注。过量表达天冬氨酸激酶 III，。

8、 包括野生型和突变型， 对提高赖氨酸产量有很大帮助。例如， US5661012 报道了有助于 提高赖氨酸产量的如下几个氨基酸位点的突变型 ： 318， 323， 325， 345， 347， 349。但寻找更 多、 更有效的天冬氨酸激酶仍然是十分重要的。 发明内容 0005 本发明公开了与已公开的突变位点不同的天冬氨酸激酶 III 的突变位点。发明人 对大肠杆菌天冬氨酸激酶 III（SEQ ID NO ： 1） 的 Ile342 氨基酸位点进行了氨基酸置换， 得 到突变型的天冬氨酸激酶 III。 0006 具体而言， 本发明公开了一种具有天冬氨酸激酶 III 的活性的多肽， 该种多肽包 括氨基。

9、酸序列SEQ ID NO ： 1， 或具有同样酶活性的该序列的多肽片段或同源多肽， 且在相当 于 SEQ ID NO ： 1 序列中的 Ile342 氨基酸位点处有氨基酸置换突变。在保留天冬氨酸激酶 的活性的前提下， 上述突变位点处的氨基酸残基可以用任意天然或非天然氨基酸或氨基酸 类似物替代。 0007 因为突变型的天冬氨酸激酶要应用于赖氨酸或苏氨酸生产， 因此突变不能严重降 低天冬氨酸激酶的活性。 本发明中提供的多肽至少部分地保有SEQ ID NO ： 1序列所示的天 冬氨酸激酶的活性。 0008 用于取代上述位点处原有氨基酸残基的不局限于某些特定的氨基酸。 任意蛋白氨 说 明 书 CN 1。

10、04099308 A 3 2/8 页 4 基酸或非蛋白氨基酸都可以用来取代上述位点处原有的氨基酸残基。在一些实施例中， 上 述位点的原氨基酸残基被其他天然的、 蛋白氨基酸置换。所提到的其他蛋白氨基酸， 是指 在天然多肽分子中发现的除异亮氨酸 （Ile） 以外的 22 个氨基酸， 即丙氨酸 （Ala） ， 亮氨酸 （Leu） ， 天冬酰胺 （Asn） ， 赖氨酸 （Lys） ， 天冬氨酸 （Asp） ， 甲硫氨酸 （Met） ， 半胱氨酸 （Cys） ， 苯 丙氨酸 （Phe） ， 谷氨酸 （Glu） ， 苏氨酸 （Thr） ， 谷氨酰胺 （Gln） ， 色氨酸 （Trp） ， 甘氨酸 （Gly。

11、） ， 缬氨酸 （Val） ， 脯氨酸 （Pro） ， 丝氨酸 （Ser） ， 酪氨酸 （Tyr） ， 精氨酸 （Arg） ， 组氨酸 （His） ， 硒 代半胱氨酸， 硒代甲硫氨酸， 吡咯赖氨酸。在一些优选的实施例中， 用于置换的氨基酸是 L- 氨基酸。 0009 在另外一些实施例中， 用于取代突变位点处原有的氨基酸残基的可以是非蛋白氨 基酸， 即不存在于天然多肽中的氨基酸。非蛋白氨基酸包括 ： - 氨基己二酸， - 氨基己 二酸， - 氨基丁酸， - 氨基异丁酸， - 丙氨酸， 4- 氨基丁酸， 5- 氨基戊酸， 6- 氨基己酸， 8- 氨基辛酸， 9- 氨基壬酸， 10- 氨基癸酸， 1。

12、2- 氨基十二烷酸， - 氨基辛二酸， - 环己基丙 氨酸， 瓜氨酸， 脱氢丙氨酸， - 环己基甘氨酸， 炔丙基甘氨酸， 焦谷氨酸， 4- 苯甲酰苯丙氨 酸， - 羟赖氨酸， 4- 羟脯氨酸， 别异亮氨酸， 羊毛硫氨酸 （Lan） ， 正亮氨酸， 正缬氨酸， 鸟氨 酸， 苯甘氨酸， 哌啶酸， 肌氨酸， 1,2,3,4- 四氢异喹啉 -3- 羧酸， 别苏氨酸， 噻唑烷 -4- 羧酸， - 氨基丁酸 （GABA） ， 异半胱氨酸， 二氨基丙酸， 2,4- 二氨基丁酸， 3,4- 二氨基丁酸， 联苯丙 氨酸， 4- 氟苯丙氨酸等。 0010 非蛋白氨基酸还包括蛋白氨基酸的衍生物， 例如， 高甲硫氨酸。

13、， 高丝氨酸， 高脯氨 酸， 高苏氨酸， 高色氨酸， 高酪氨酸， 高组氨酸， 高赖氨酸等。 0011 在一些实施例中， SEQ ID NO ： 1 序列所示的天冬氨酸激酶在 342 氨基酸位点处被 如下氨基酸置换 ： Ala， Leu， Asn， Lys， Asp， Met， Cys， Phe， Glu， Thr， Gln， Trp， Gly， Val， Pro， Ser， Tyr， Arg， 或 His。 0012 在优选的实施例中， 天冬氨酸激酶的 342 位点处的氨基酸残基被 Ala 置换。 0013 需要指出的是， 本发明所述的天冬氨酸激酶的序列不只限于 SEQ ID NO ： 1 所。

14、示的 序列。 与SEQ ID NO ： 1具有序列同源性的并具有同样酶活性的多肽序列都在本发明所述的 天冬氨酸激酶涵盖的范围内。例如， 本发明同样适用于来源于其它微生物种属或其它大肠 杆菌菌株的天冬氨酸激酶。 0014 与SEQ ID NO ： 1具有序列同源性的多肽序列， 可以在除本发明中公开的相当于SEQ ID NO ： 1序列的342突变位点以外的一个或多个氨基酸位点处与SEQ ID NO ： 1序列相比出 现氨基酸置换、 氨基酸删除或插入。并且， 对于同源的多肽序列， 在至少部分保留天冬氨酸 激酶活性的前提下， 也可以在其他氨基酸位点处进行氨基酸置换、 氨基酸删除或插入。 通常 来说，。

15、 在保留天冬氨酸激酶活性的前提下， SEQ ID NO ： 1 序列中除 342 以外的任意氨基酸位 点， 都可以进行氨基酸置换。在一些实施例中， SEQ ID NO ： 1 序列中的 1， 2， 3， 5， 10， 20， 30， 40， 50 个氨基酸位点， 都进行了氨基酸置换。在一些实施例中， SEQ ID NO ： 1 序列中的 50， 60， 70， 80， 90， 100 个氨基酸位点， 都进行了氨基酸置换。 0015 与SEQ ID NO ： 1序列相比含有一个或多个氨基酸插入的多肽视为SEQ ID NO ： 1序 列的同源序列。氨基酸插入可以发生在 SEQ ID NO ： 1 。

16、序列的任意位点。同样地， 与 SEQ ID NO ： 1 序列相比含有一个或多个氨基酸删除的多肽视为 SEQ ID NO ： 1 序列的同源序列。氨 基酸删除可以发生在 SEQ ID NO ： 1 序列的除 342 以外的任意位点。 说 明 书 CN 104099308 A 4 3/8 页 5 0016 SEQ ID NO ： 1 序列的同源序列有至少 75%， 80%， 85%， 90%， 95%， 99% 与 SEQ ID NO ： 1 序列相同。序列比对使用本领域内公知的方法或计算机软件。 0017 本发明还包括包含相当于 SEQ ID NO ： 1 序列中 342 氨基酸突变位点的， 。

17、有天冬氨 酸激酶活性的 SEQ ID NO ： 1 序列的一个片段， 以及所述多肽片段的同源多肽。上述带有天 冬氨酸激酶活性的多肽片段， 与 SEQ ID NO ： 1 序列或其同源序列的不同之处在于， 在 N- 末 端和 / 或 C- 末端有一个或多个氨基酸缺失。例如， 在至少部分保留天冬氨酸激酶活性的前 提下， SEQ ID NO ： 1 序列的片段可以在 N- 末端和 / 或 C- 末端有 5 个， 10 个， 15 个， 20 个， 30 个， 40 个， 或 50 个氨基酸缺失。同样地， 在至少部分保留天冬氨酸激酶活性的前提下， SEQ ID NO ： 1 序列的同源序列的片段可以在。

18、 N- 末端和 / 或 C- 末端有 5 个， 10 个， 15 个， 20 个， 30 个， 40 个， 或 50 个氨基酸缺失。 0018 本发明还公开了一段多聚核苷酸， 其编码一段本发明所述的有天冬氨酸激酶活性 的多肽， 该多肽包括在342氨基酸位点处有氨基酸置换的SEQ ID NO ： 1所示的氨基酸序列、 带有天冬氨酸激酶活性的该序列的多肽片段， 或它们的同源序列。 例如， 多聚核苷酸可以具 有如 SEQ ID NO ： 2 所示的序列， 其中编码 Ile342 氨基酸位点的密码子被修改， 以造成在上 述位点处的氨基酸置换。 本发明还包括由于使用了不同的简并密码子而造成的与上述序列 。

19、不同的多聚核苷酸序列， 以及针对不同宿主而进行了编码子优化的、 编码同样或同源的多 肽序列的多聚核苷酸序列。 0019 本发明还公开了一个表达载体， 该载体包含一段多聚核苷酸序列， 所述的序列编 码本发明所述的有酶活性的天冬氨酸激酶， 或天冬氨酸激酶的多肽片段， 以及它们的同源 多肽。表达载体是指一个多聚核苷酸构建物， 一般由 DNA 分子组成， 能够实现载体上一段多 聚核苷酸的基因转移、 在宿主细胞中的复制和基因表达。所述多聚核苷酸相对于宿主细胞 可以是异源的， 也可以是同源但经过修饰的。表达载体的复制可以通过整合到宿主细胞基 因组中进行复制， 或通过游离型载体 （如质粒） 进行复制。游离型。

20、载体带有可以在宿主细胞 中自我复制的复制子序列。 0020 在本发明所公开的方法中使用的表达载体， 可以是高拷贝数质粒， 以实现在宿主 细胞中表达高水平天冬氨酸激酶的目的， 也可以是中拷贝数或低拷贝数的质粒。表达载体 一般带有用于筛选转化子的标记基因。通常使用的标记基因为抗抗生素基因， 例如抗氨苄 青霉素、 卡那霉素或四环素的基因。标记基因的选择可以根据所用的宿主细胞和载体来决 定。 0021 本发明所述的表达载体是能够实现本发明所述的多聚核苷酸表达的载体。 通常来 说， 表达载体包含对想要表达的多聚核苷酸序列起作用的调节序列， 例如启动子和增强子。 表达载体中的启动子可以是组成型的， 也可以。

21、是诱导型的。调节序列可以依据所用的宿主 菌、 预期的多肽表达水平等进行选择。 在一些实施例中， 所构建的表达载体用于在原核生物 细胞中表达天冬氨酸激酶。在优选的实施例中， 所构建的表达载体用于在细菌中表达天冬 氨酸激酶， 例如大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。 0022 本发明所述的表达载体还包括能够实现将本发明所述的天冬氨酸激酶以融合蛋 白的形式表达的载体。 融合蛋白是指包含至少两段在天然状态下不相连的多肽或多肽片段 的杂合蛋白。表达融合蛋白的表达载体， 在所要表达的多肽的 N- 末端或 C- 末端增加一段 氨基酸序列。增加的氨基酸序列可能但不局限于提供如下作用， 例如增强天冬氨酸激酶在 说 明 书 。

22、CN 104099308 A 5 4/8 页 6 宿主细胞中的表达， 或者有利于天冬氨酸激酶的纯化。 0023 本发明还公开了包含所述多聚核苷酸或表达载体的宿主细胞。 多种不同的宿主细 胞可以用于表达本发明所述的天冬氨酸激酶。真核生物细胞 （例如酵母或动物细胞） 和原 核生物细胞都可以用于重组表达本发明所述的天冬氨酸激酶。宿主优选原核生物细胞。优 选细菌作为宿主。例如， 宿主可以是以下种属的细菌 ： 大肠埃希氏菌， 沙雷氏菌， 短杆菌， 棒 状杆菌等。优选大肠杆菌作为宿主菌。可以用于赖氨酸和苏氨酸生产的大肠杆菌菌株包括 K-12， JM109， GT3 等。 0024 用于发酵生产赖氨酸的宿主。

23、菌可以含有完整的 L- 赖氨酸生物合成途径， 能够独 立生产赖氨酸。例如， 含有编码 SEQ ID NO ： 1 多肽的基因序列的野生型大肠杆菌可以用作 宿主菌。但使用野生型菌株生产赖氨酸产量极低。向上述宿主菌中转化本发明所述的编码 天冬氨酸激酶突变型的多聚核苷酸， 能够明显提高赖氨酸的产量。 另外， 宿主菌也可以不包 含天冬氨酸激酶 III 基因， 或者不包含具有活性的天冬氨酸激酶 III 基因。向这种宿主菌 中转化本发明所述的多聚核苷酸， 能够使构建的重组菌生产赖氨酸、 苏氨酸。 0025 本发明所提到的宿主细胞， 可以包含其他有利于提高赖氨酸产量的基因突变、 基因删除或基因插入， 以及对。

24、基因表达调节序列的修饰。例如赖氨酸生物合成途径中一 些酶的突变和中心代谢途径中一些酶的突变。例如二氢吡啶二羧酸合成酶 （SEQ ID NO ： 3） ， 它催化天冬氨酸 - 半醛和丙酮酸的脱水缩合反应， 这是天冬氨酸家族氨基酸生物 合成途径分支为赖氨酸生物合成途径的第一个专属酶。该酶由 dapA 基因 （SEQ ID NO ： 4）编码， 它的活性也受到赖氨酸的抑制 （Blickling,S.and Knablein,J.(1997)Biol. Chem.378:207-10） 。EP0733710 提到了 2 种有助于提高赖氨酸产量的二氢吡啶二羧酸合成 酶的突变型。 0026 表达载体可以根。

25、据所用的宿主细胞进行选择。例如， 适用于大肠杆菌的表达载 体包括 ： pBluescript 系列载体， pUC 系列载体 （如 pUC18， pUC19， pBR322， pBR329， pQE70， pQE60， pQE-9， pNH8A， pNH16A， pNH18A， pNH46A， ptrc99a， pKK223-3， pKK233-3， pDR540， pRIT5， pLG338， pKC30， pHSG299， pHSG399， pRep4， pACYC177， pACYC184， pRSF1010， pBW22 等） 。适用于谷氨酸棒杆菌的表达载体包括 ： 大肠杆菌 / 谷氨酸。

26、棒杆菌穿梭载体 （如 pEC-XT99A， pEC-XC99E， pET-XK99E 等） 。还有一些其他的表达载体可供选择， 如 Kirchner et al.,2003,J.Biotechnol.,104:287-299， 和 “Cloning Vectors” (Pouwels et al.(eds.) Elsevier,Amsterdam New York Oxford,1985) 中所表述的载体。表达载体可以用任何适 合的方法转化进宿主细胞， 例如 Maniatis et al. 在 Molecular Cloning,A laboratory Manual(1982,Cold Sp。

27、ring Harbor Laboratory)一书中阐述的一些方法， 比如 ： 电转， 显微 注射， 基因枪， 或化学转化法 （如磷酸钙法） 。 0027 本发明还公开了一种生产 L- 赖氨酸或 L- 苏氨酸的方法， 包括 ：（i） 在合适的培养 基里和在合适的培养条件下培养如上所述的宿主细胞， 表达有天冬氨酸激酶活性的多肽， 该多肽由 SEQ ID NO ： 1 序列组成， 或由具有同样酶活性的 SEQ ID NO ： 1 序列片段或其同源 多肽组成， 且在相当于 SEQ ID NO ： 1 序列的 Ile342 氨基酸位点处有突变 ；（ii） 从上述培养 液中提取 L- 赖氨酸或 L- 苏。

28、氨酸。 0028 所利用的培养基必须适合特定宿主细胞的需要。 可以利用的碳源是糖和碳水化合 物， 例如葡萄糖， 蔗糖， 乳糖， 果糖， 麦芽糖， 糖蜜， 淀粉和纤维素 ； 油和脂肪， 例如大豆油， 向 说 明 书 CN 104099308 A 6 5/8 页 7 日葵油， 花生油和椰子脂肪 ； 脂肪酸， 例如棕榈酸， 硬脂酸和亚油酸 ； 醇， 例如甘油和乙醇 ； 以及有机酸， 例如乙酸。这些物质可以单独或混合使用。可以利用的氮源是有机含氮化合 物， 如胨， 酵母提取物， 肉膏， 麦芽抽提物， 玉米浆， 大豆粉和尿素 ； 或无机化合物， 如硫酸铵， 氯化铵， 磷酸铵， 碳酸铵和硝酸铵。氮源可以单。

29、独或混合使用。磷源可以是磷酸二氢钾或磷 酸氢二钾或对应的钠盐。培养基还可以含有金属盐， 例如硫酸镁或硫酸铁。最后， 除以上提 到的物质外， 可以添加必需的促生长物质如氨基酸和维生素。所说的添加物可以一次或分 批添加到培养基中。 0029 培养本发明所述的宿主细胞可以采用普遍使用的发酵方法。例如， 细胞可以 进行分批培养， 补料分批培养， 或连续培养。培养方法在 Encyclopedia of Bioprocess TechnologyFermentation,Biocatalysis,and Bioseparation,Volumes1-5,Flickinge r,M.C.,Drew,S.W.。

30、(eds.),1999John Wiley&Sons. 一书中有全面描述。培养温度可以是 20 C 到 42 C， 优选 30 C 到 40 C， 优选 30 C 到 37 C。培养基的 pH 可以是 5.0 到 9.0， 优选 6.0 到 8.0， 例如 7.0。培养时间可以从几个小时到几天。例如， 如果采用分批培 养， 培养时间可以是 12h 到 36h ； 如果采用连续培养， 培养时间可以长达 21 天或更长。 0030 从培养液中提取产品 （L- 赖氨酸或 L- 苏氨酸）可以采用公知的方法， 例如 US5342766 中所述的使用离子交换树脂的方法。 0031 本发明所公开的经过突变的。

31、具有天冬氨酸激酶活性的多肽或多肽片段有助于提 高赖氨酸和苏氨酸的生物合成产量。在本发明的基础上， 可以构建用于氨基酸生产的基因 工程菌， 包括谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌。 表达本发明所述的突变型天冬氨酸激酶的宿主菌， 在合适的培养基里可以生产 L- 赖氨酸和 L- 苏氨酸。 0032 本发明公开了新的大肠埃希氏菌天冬氨酸激酶 III 的突变型， 其突变位点与已报 道的突变型不同。过量表达本发明的突变型天冬氨酸激酶能够提高赖氨酸产量。这为优化 赖氨酸的生物合成提供了更多选择， 有助于构建赖氨酸生产菌株或提高赖氨酸产量。 附图说明 0033 图 1 为天冬氨酸激酶和 / 或二氢吡啶二羧酸合成酶表达质粒。

32、结构图。 具体实施方式 0034 生物保藏信息 0035 大肠杆菌(Escherichia coli)CAT lys1303根据 布达佩斯协议 于2013年3月22 日保藏在中国典型培养物保藏中心 （CCTCC） ， 地址中国武汉， 武汉大学， 保藏编号为 CCTCC NO ： M2013100。 0036 实施例 1 ： 野生型大肠杆菌天冬氨酸激酶 III 基因 （lysC） 的克隆和表达质粒的构 建 0037 以 大 肠 杆 菌 BL21（北 京 博 迈 德 生 物 科 技 有 限 公 司）基 因 组 DNA 为 模 板， 以 引 物 1 ： AGGAGTTAATGAATGTCTGAAAT。

33、TGTTGTCTC（SEQ ID NO ： 5） 和 引 物 2 ： ACTGAAAGCTTTTACTCAAACAAATTACTAT（SEQ ID NO ： 6） 为引物， 进行 PCR 反应。 0038 PCR反应得到约1.4kb DNA产物。 电泳纯化该PCR产物， 与pMD18-T载体 （TaKaRa） 连接。将连接产物转化进大肠杆菌 JM109 （北京博迈德生物科技有限公司） 。对转化子做菌 说 明 书 CN 104099308 A 7 6/8 页 8 落 PCR 检验 lysC 基因在质粒中的方向， 所用引物为引物 3 ： GAGTTAGCTCACTCATTAGG （SEQ ID N。

34、O ： 7） 和引物 2（SEQ ID NO ： 6） 。如果 lysC 基因与载体上 lac 启动子方向一致， 会产生约 1.4kb的PCR产物。 选择lysC基因与载体上lac启动子方向一致的质粒， 命名为pUC-lysC。 0039 实施例 2 ： 突变型 lysC 基因的构建和表达质粒的构建 0040 以 pUC-lysC 为模板， 以引物 1（SEQ ID NO ： 5） 和引物 4 ： GTCTACCGAAATATTATGCC （SEQ ID NO ： 8） 为引物， 扩增 lysC 基因片段 I（约 1kb） ； 以引物 2（SEQ ID NO ： 6） 和引物 5 ： GGCA。

35、TAATATTTCGGTAGACTTAGCCACCACGTCAGAAGTGAGC（SEQ ID NO ： 9） 为引物， 扩增 lysC 基因片段 II（约 0.3kb） 。 0041 电泳纯化两个 PCR 产物。以等摩尔量混合 lysC 基因片段 I 和 II， 作为模板， 以引 物 1（SEQ ID NO ： 5） 和引物 2（SEQ ID NO ： 6） 为引物， 进行重叠 PCR。PCR 反应液体积为 50l， 成分如下 ： 0042 lysC 片段 I 和 II ： 每个 0.05pmole 0043 引物 ： 每个 50pmole 0044 TaKaRaTaq DNA Polyme。

36、rase（TaKaRa） ： 2.5U 0045 10PCR Buffer ： 5l 0046 dNTPs ： 每种 10nmole 0047 重叠 PCR 反应得到一个约 1.4kb 的产物。电泳纯化 PCR 产物， 与 pMD18-T 载体 （TaKaRa） 连接。将连接产物转化进大肠杆菌 JM109。对转化子做菌落 PCR 检验 lysC 基因在 质粒中的方向， 所用引物为引物 3（SEQ ID NO ： 7） 和引物 2（SEQ ID NO ： 6） 。选择 lysC 基 因与载体上 lac 启动子方向一致的质粒， 用通用引物 M13F（-47） 和 M13R（-48） 进行测序， 确。

37、认在编码氨基酸残基342位点处有预设的IleAla突变。 将该质粒命名为pUC-lysC342 （图 1A） 。 0048 实施例 3 ： 野生型二氢吡啶二羧酸合成酶 （dapA） 的克隆 0049 以大肠杆菌 BL21 基因组 DNA 为模板， 以引物 6 ： ACTGAAAGCTTAGGAGGTAATGAATGTTC ACGGGAAGTATTGT（SEQ ID NO ： 10） 和引物 7 ： ACTGACATAT GTTACAGCAA ACCGGCATGC（SEQ ID NO ： 11） 为引物， 进行 PCR 反应。 0050 PCR 反应得到约 0.9kb DNA 产物。电泳纯化该 。

38、PCR 产物， 与 pMD18-T 载体连接。将 连接产物转化进大肠杆菌 JM109。对转化子做菌落 PCR 检验， 所用引物为引物 3（SEQ ID NO ： 7） 和引物 6（SEQ ID NO ： 10） ， 或引物 3（SEQ ID NO ： 7） 和引物 7（SEQ ID NO ： 11） 。无 论使用哪组引物， 如果 dapA 基因成功与载体相连， 会产生约 0.9kb 的 PCR 产物。选择含有 dapA 基因的质粒， 命名为 pUC-dapA。本领域的技术人员应该理解， dapA 基因相对于 lac 启 动子可能有两种连接方向。任意一种方向都可以满足本实施例和实施例 4 的需要。

39、。 0051 实施例 4 ： 突变型 dapA 基因的构建 0052 以 pUC-dapA 为模板， 以引物 8 ： GACCGGCGCTAACGTTACTGCGGAAGCC （SEQ ID NO ： 12） 为引物， 进行定点诱变 PCR。PCR 反应液体积为 50l， 成分如下 ： 0053 pUC-dapA 质粒 ： 100ng 0054 引物 8 ： 50pmole 0055 Pfu DNA Polymerase（北京博迈德生物科技有限公司） ： 5U 0056 Taq DNA Ligase（NEB） ： 40U 说 明 书 CN 104099308 A 8 7/8 页 9 0057 。

40、10Pfu Buffer ： 4l 0058 10Taq DNA Ligase Buffer ： 5l 0059 dNTPs ： 每种 10nmole 0060 PCR 反应条件如下 ： 0061 94 C， 5min 0062 94 C， 1min（循环开始） 0063 55 C， 1min 0064 65 C， 8min（30 个循环） 0065 65 C， 10min 0066 向 PCR 反应液中加入 10U DpnI （NEB） ， 于 37 C 反应 1h。取 10l 酶切处理后的 PCR 反应液， 转化大肠杆菌 JM109。 0067 提取多个转化子的质粒， 用通用引物 M13F。

41、（-47） 和 M13R（-48） 进行测序， 检验 dapA 基因中编码氨基酸残基 81 位点处是否有预期的 Ala Val 突变。将成功引入突变的 质粒命名为 pUC-dapA81（图 1B） 。 0068 实施例 5 ： LysC342/DapA81 共表达载体的构建 0069 用 HindIII 和 NdeI 酶切 pUC-dapA81 质粒， 获得带有 dapA 基因的 DNA 片段 （约 1kb） ； 用同样的酶切 pUC-lysC342 质粒， 获得带有 lysC 基因和质粒骨架部分的 DNA 片段 （约 4kb） 。将两片段连接， 把连接产物转化进大肠杆菌 JM109（图 1）。

42、 。 0070 用引物 1（SEQ ID NO ： 5） 和引物 7（SEQ ID NO ： 11） 对转化子进行菌落 PCR。如 果 dapA 基因与 lysC 基因成功连接， 会产生约 2.2kb 的 PCR 产物。选择成功连接的质粒， 命 名为 pUC-lysC342-dapA81（图 1C） 。 0071 实施例 6 ： 用含有突变型天冬氨酸激酶的宿主菌生产赖氨酸 0072 将质粒 pUC-lysC、 pUC-lysC342 和 pUC-lysC342-dapA81 分别转化进大肠杆菌 K-12substr.MG1655（DSM-18039） 。得到的菌株 MG1655/pUC-lys。

43、C、 MG1655/pUC-lysC342 （即大肠杆菌 CAT lys1303， 保藏号 CCTCC M2013100） 和 MG1655/pUC-lysC342-dapA81 被接 种于种子培养液中， 于 30 C 培养 12h。以 2.0% 接种量将种子菌液接种于发酵培养液。于 30 C 培养 2h， 加入 1mM IPTG， 继续培养 36h。 0073 其中， 种子培养液 （100mL） 中含有 ： 0074 蔗糖 ： 0.32g ； 0075 硫酸铵 ： 0.55g ； 0076 酵母粉 ： 0.3g ； 0077 蛋白胨 ： 0.6g ； 0078 磷酸二氢钾 ： 0.3g ； 。

44、0079 硫酸镁 ： 0.01g ； 0080 硫酸亚铁 ： 0.01g ； 0081 异亮氨酸 ： 0.004g ； 0082 维生素 B1 ： 0.003g。 0083 其中， 发酵培养液 （100mL） 中含有 ： 0084 葡萄糖 ： 14g ； 说 明 书 CN 104099308 A 9 8/8 页 10 0085 蔗糖 ： 1g ； 0086 硫酸铵 ： 3.3g ； 0087 磷酸二氢钾 ： 0.42g ； 0088 硫酸镁 ： 0.05g ； 0089 硫酸亚铁 ： 0.01g ； 0090 玉米浆 ： 1.6g ； 0091 异亮氨酸 ： 0.02g ； 0092 尼克酰胺。

45、 ： 1.0mg ； 0093 维生素 B1 ： 3.0mg ； 0094 碳酸钙 ： 2.8g。 0095 赖氨酸浓度的测定方法 （比色法） 如下 ： 0096 将发酵原液稀释到大约 30mg/dl 赖氨酸盐酸盐浓度， 取稀释后的液体 1mL 置于 25mL的干燥试管中 ； 再分别取30mg/dl赖氨酸盐酸盐标准溶液和蒸馏水1mL， 分别置于不同 的干燥试管中 ； 分别在各个试管 （分别加入了待测液、 标准液、 空白水） 中加入 1mL 茚三酮溶 液 ； 混合均匀后， 用铝箔将试管封口 ； 将以上各个试管置于 100沸水浴中加热， 自沸水沸 腾起计时 10 分钟 ； 反应结束后， 取出试管，。

46、 置于冷水中冷却后， 分别准确吸取 8mL 蒸馏水于 各个试管中， 混匀 ； 然后， 在分光光度计上测定 475nm 的吸光值。空白样以空白试验试管的 液体作为参照， 所得吸光值按照茚三酮的标准曲线， 可以计算出发酵液稀释后的赖氨酸的 浓度。根据稀释度得到发酵原液中赖氨酸盐酸盐浓度。 0097 发酵摇瓶培养 36h 后， 经测定， 产酸水平如表 1 所示。 0098 表 1、 赖氨酸产量测定结果 0099 菌种编号赖氨酸 g/L MG16550.8 MG1655/pUC-lysC24.53.1 MG1655/pUC-lysC34240.23.4 pUC-lysC342-dapA8154.63.。

47、6 0100 由表 1 可见， 将本发明的突变型天冬氨酸激酶进行过量表达， 能够提高大肠杆菌 中赖氨酸的产量。本发明的方法为优化赖氨酸的生物合成提供了更多选择， 有助于构建赖 氨酸生产菌株或提高赖氨酸产量。 0101 对于本领域技术人员显而易见的是， 在不背离本发明的范围和精神的前提下， 可 对其进行各种修改和变动， 上述各项技术特征之间的组合及根据上述内容所完成的其它技 术方案改变均属本发明范围。 说 明 书 CN 104099308 A 10 1/9 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 104099308 A 11 2/9 页 12 0003 序 列 表 CN 10409930。

48、8 A 12 3/9 页 13 0004 序 列 表 CN 104099308 A 13 4/9 页 14 0005 序 列 表 CN 104099308 A 14 5/9 页 15 0006 序 列 表 CN 104099308 A 15 6/9 页 16 0007 序 列 表 CN 104099308 A 16 7/9 页 17 0008 序 列 表 CN 104099308 A 17 8/9 页 18 0009 序 列 表 CN 104099308 A 18 9/9 页 19 序 列 表 CN 104099308 A 19 1/1 页 20 图 1 说 明 书 附 图 CN 104099308 A 20 。