《毛叶茶无色花青素还原酶LAR及其编码基因.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《毛叶茶无色花青素还原酶LAR及其编码基因.pdf（10页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 104099303 A (43)申请公布日 2014.10.15 CN 104099303 A (21)申请号 201410326686.3 (22)申请日 2014.06.29 C12N 9/02(2006.01) C12N 15/53(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 1/21(2006.01) (71)申请人 江苏省中国科学院植物研究所 地址 211225 江苏省南京市溧水县白马镇国 家农业科技园江苏省中国科学院植物 研究所基地 申请人 江苏凯吉生物科技有限公司 (72)发明人 李密密 杭。
2、悦宇 温尧林 渠艳秋 (54) 发明名称 毛叶茶无色花青素还原酶 LAR 及其编码基因 (57) 摘要 本发明提供了一种来源于毛叶茶的无色花青 素酶及其编码序列 CpLAR。本发明人将毛叶茶中 分离得到的 CpLAR 基因转入大肠杆菌中， 并进行 诱导表达， 最终检测到 CpLAR 基因在大肠杆菌中 的高效表达。本发明涉及的蛋白及其编码序列对 植物儿茶素合成及其调控机制的研究， 尤其是反 式儿茶素的积累机制具有重要的理论和实际意 义， 将在培育反式儿茶素为主的茶品种中发挥重 要作用， 应用前景广阔。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 3 页 附图 2 页 (1。
3、9)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 序列表3页 附图2页 (10)申请公布号 CN 104099303 A CN 104099303 A 1/1 页 2 1. 一种无色花青素还原酶， 是具有 SEQ ID No.2 氨基酸残基序列之一的蛋白质 ； 2. 根据权利要求 1 所述无色花青素还原酶的编码基因， 其特征在于所述脂肪酸延长酶 的基因 cDNA 为下述核苷酸序列之一 ： (a) 是具有 SEQ ID No.1 的核苷酸序列 ； (b) 与多核苷酸 (a) 互补的核苷酸序列 ； (c) 编码序列表中 SEQ ID No.2 氨基酸残基序列的核苷。
4、酸序列。 3. 扩增权利要求 2 所述序列的引物对 petLAR_F 和 petLAR_R， 其特征在于包括具有序 列表 SEQ ID No.3 和 SEQ ID No.4 的核苷酸序列。 4. 含有权利要求 2 任一所述的基因的重组表达载体。 5. 含有权利要求 2 任一所述的基因的转基因细胞系。 6. 含有权利要求 2 任一所述的基因的工程菌。 7. 权利要求 1 任一所述的蛋白在培育反式儿茶素改良植物中的应用。 8. 权利要求 2 任一所述的基因在培育反式儿茶素改良植物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 104099303 A 2 1/3 页 3 毛叶茶无色花青素还原酶 LAR 及其编。
5、码基因 技术领域 0001 本发明涉及分子生物学和基因工程领域中毛叶茶 (Camellia ptilophylla) 无色 花青素还原酶 (leucoanthocyanidin reductase， LAR)、 其编码基因、 表达方法。 背景技术 0002 毛叶茶 (Camellia ptilophylla Chang)， 又称可可茶， 是一种天然无咖啡碱 茶 种 质 资 源，与 传 统 茶 (C.sinensis(L.)O.Ktze.&C.assamica var.kucha Chang et Wang) 儿茶素成分的区别在于 ： 毛叶茶以反式儿茶素为主， 即没食子儿茶素没食子酸 酯 (+)。
6、-gallocatechin-3-gallate， GCG、没 食 子 儿 茶 素 (+)-gallocatechin， GC， (+)-catechin-3-gallate， CG、 儿茶素 (+)-catechin， C 等 ； 传统茶以顺式儿茶素为主， 即表没食子儿茶素没食子酸酯 (-)-epigallocatechin-3-gallate， EGCG、 表没食子儿茶 素 (-)-epigallocatechin， EGC、 表儿茶素没食子酸酯 (-)-epicatechin-3-gallate， ECG、 表儿茶素 (-)-epicatechin， EC 等。 0003 反式儿茶素， 。
7、尤其是 GCG， 在抗过敏、 对环氧酶和酪氨酸酶等许多酶的抑制作用、 清 除自由基活性等方面的生理活性要强于顺式儿茶素 EGCG， 并被发现具有独特的美白、 抗良 性前列腺增生、 抗病毒、 抑制胆固醇吸收、 抑制破骨细胞形成等活性。 0004 儿茶素合成途径中， 无色花青素还原酶(leucoanthocyanidin reductase， LAR)催 化无色花青素转变为反式儿茶素C和GC。 然而， 目前尚未对于毛叶茶LAR进行克隆， 对其合 成反式儿茶素的机制也尚未明确。 0005 本发明通过对毛叶茶 CpLAR 基因的克隆， 进行原核表达， 最终获得目的表达蛋白。 发明内容 0006 本发明。
8、的目的在于提供一种来自于以反式儿茶素为主的毛叶茶中的无色花青素 还原酶 (leucoanthocyanidin reductase， LAR) 及其编码基因。 0007 本发明的毛叶茶 LAR 基因由 1029 个碱基组成， 含有一个完整的开放阅读框， 为序 列表中的 1 号序列， 将此基因命名为 CpLAR。 0008 本发明的毛叶茶 LAR 蛋白由 342 个氨基酸组成， 开放阅读框的起始密码子为 ATG， 终止密码子为 TGA。毛叶茶 LAR 蛋白的理论分子量为 37.6kDa， 等电点为 5.32。 0009 含有上述序列 1 及其开放阅读框架的多核苷酸的载体， 以及用上述序列 1 及。
9、其开 放阅读框架的多核苷酸转化的生物细胞， 均是本发明需要保护的内容。 0010 本发明基因的发现， 使通过基因调控来控制反式儿茶素合成成为可能， 对于培育 反式儿茶素为主的茶种质资源具有重要意义。 0011 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。 附图说明 0012 图 1 为毛叶茶嫩叶总 RNA 检测图 说 明 书 CN 104099303 A 3 2/3 页 4 0013 图 2 为 CpLAR 基因全长 PCR 扩增产物 0014 图 3 为原核表达载体 pET-28a-CpLAR 的构建流程图 0015 图 4 为载体 pET-28a-CpLAR 的酶切图谱 0016 图 5 为大。
10、肠杆菌中 CpLAR 表达产物的 Western Blot 分析 具体实施方式 0017 以下实施例、 实验例仅对本发明进行进一步的说明， 不应构成对本发明的进一步 的限制。 0018 实施例 1、 CpLAR 基因的克隆 0019 具体步骤如下 ： 0020 毛叶茶产自广东省惠州市象头山， 移植于江苏省中科院植物研究所种植圃， 成活 后， 与生长旺盛期采集鲜叶叶片， 液氮速冻后用于总 RNA 的提取， 总 RNA 经过反转录合成 cDNA， cDNA 进行特异引物 PCR 反应， 最终获得 CpLAR 基因。 0021 1、 毛叶茶总 RNA 的提取和 cDNA 反转录 0022 Biote。
11、ke公司多糖多酚植物总RNA快速提取试剂盒提取毛叶茶总RNA， 电泳检测结 果如图 1 所示。总 RNA 通过 Takara 公司 PrimeScriptTM lst Strand cDNA Synthesis 反转 录为 cDNA。 0023 2、 PCR 反应 0024 以上述得到的毛叶茶 cDNA 为模版， 以分别带有 BamH I 与 Hind III 酶切位点的 petLAR_F(5-CGCGGATCCATGACTGTGTTGGAATC-3)(下划线为BamH I)与petLAR_R(5-CCC AAGCTTTCAAGCACACATTGTG-3 )( 下划线为 Hind III) 为。
12、引物， 按以下反应扩增出 CpL4R 基 因。50L 反应体系如下 ： 0025 0026 0027 按以下程序进行扩增反应 ： 先 94预变性 5min ； 然后 94变性 45sec， 55退火 45sec， 72延伸 1min， 35 个循环 ； 最后 72延伸 8min。电泳检测 PCR 产物， 如图 2 所示， 有 一条带大小约 1000bp， 与理论值相符。 0028 通过切胶回收 1000bp 左右的目的条带， 将该 DNA 片段连接到 pMD19-T 载体上， 生成 pMD-CpLAR 重组载体， 转化大肠杆菌 DH5， 经测序后在 GenBank 中 (http ： /bla。
13、st. st-va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 进行 Blastn 比较， 结果表明， 该片段与数据库中的 说 明 书 CN 104099303 A 4 3/3 页 5 多种植物 LAR 基因有较高的同源性， 因此表明已分离得到毛叶茶的 LAR 基因。 0029 实施例 2、 CpLAR 的表达分析 0030 为了表明 CpLAR 基因的编码功能， 本发明将 CpLAR 基因克隆到 Novagen 公司的 pET-28a(含His-Taq)的BamHI和HindIII位点之间， 并转化到大肠杆菌BL21菌株中， 获得 了高效表达。 0031 1、 毛叶茶 LAR 同。
14、源性分析及二级结构分析 0032 将 CpLAR 编码的蛋白序列与其他高等植物的 LAR 进行同源性分析， Geneious 软件 分析结果表明 ： 与茶 (Camellia sinenesis， GU992401) 同源性最高为 98.5与其它植物的 同源性在60-70之间， 如， 柿(Diospyros kaki AB472681)76.1， 兔眼蓝莓(Vaccinium ashei， AB610768)75.3 ，可 可 (Theobroma cacao， GU324351)73.2 ，葡 萄 (Vitis viniferal， AJ865335)68.8， 毛果杨 (Populus t。
15、richocarpa， XM002312343)67.4， 百脉 根 (Lotus corniculatus， DQ349106)64.4， Phaseolus occineus(BN000698)63， 大豆 (Glycine max， JF433916)63.5， 苜蓿 (Medicago truncatula XM003591782)60.9， 红豆 草 (Onobrychis viciifolia， HM152981) 同源性最低， 仅 58.1。 0033 利用PredictProtein(https ： /www.predictprotein.org/)对CpLAR的二级结构 进行。
16、预测， 结果显示该蛋白包含 36.55的 螺旋， 15.5的 折叠以及 47.95的卷曲。 0034 二、 CpLAR 在大肠杆菌中的高效表达 0035 本发明是利用 Novagen 公司的 pET-28a(+) 高效表达载体的多克隆位点来实现 CpLAR 的高效表达的。本实验采用的酶切位点使 pET-28a(+) 表达载体表达出的产物 5 端 附加 6 个连续 His 的融合蛋白， 这 6 个连续的 His 构成了 i-NTA 凝胶特异结合的位点， 因此 可利用亲和层析来纯化表达产物。具体步骤如下 ： 0036 1、 pET-28a-CpLAR 重组载体构建 0037 将携带 CpLAR 基。
17、因的 pMD-CpLAR 重组载体与 pET-28a(+) 表达载体用相同的限制 性内切酶(BamHI和HindIII)酶切后， T4连接酶连接， 将连接产物转化大肠杆菌BL21菌株， 并用添加了终浓度为50g/L卡那霉素的LB培养基上培养进行选择。 载体的构建流程见 图3。 经质粒酶切鉴定(如图4所示)， 泳道1、 2为质粒pET-28a-CpLAR用BamHI和HindIII 酶切后， 再经过 PCR 鉴定后， 将筛出的连接正确的重组子进行测序， 证明插入载体的 DNA 序 列的阅读框架是正确的。把构建成带有 CpLAR 基因的表达载体， 命名为 pET-28a-CpLAR， 用 于诱导表。
18、达分析。 0038 2、 CpLAR 诱导表达 0039 将筛选并经鉴定确认的重组子， 接种到含卡那霉素 ( 终浓度为 50g/L) 的 LB 液体培养基中， 37下振荡培养过夜后， 按 1 50(V/V) 转入新的培养基继续培养， 待菌 液 OD600为 0.5 左右时， 加入异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG) 至 1mmol/L， 以 pET-28a 空载体 为对照， 分别培养 3h 收集菌体， 提取细胞总蛋白， 然后用 HisBind resin 纯化并进行 10 SDS-PAGE 电泳检测， 结果如图 5 所示， 从图中可以看出， CpLAR 在 pET-28a 中得到了高效表 达。 说 明 书 CN 104099303 A 5 1/3 页 6 0001 0002 序 列 表 CN 104099303 A 6 2/3 页 7 0003 序 列 表 CN 104099303 A 7 3/3 页 8 序 列 表 CN 104099303 A 8 1/2 页 9 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 104099303 A 9 2/2 页 10 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 104099303 A 10 。