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1、(10)申请公布号 CN 104195145 A (43)申请公布日 2014.12.10 CN 104195145 A (21)申请号 201410333927.7 (22)申请日 2014.07.15 C12N 15/31(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) A61K 45/00(2006.01) A61P 1/16(2006.01) (71)申请人 浙江大学 地址 310027 浙江省杭州市西湖区浙大路 38 号 (72)发明人 李兰娟 秦楠 (74)专利代理机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 代理人 林松海 (54) 发明名称 肝硬化的生物标志物及其应用。
2、 (57) 摘要 本发明公开了肝硬化的生物标志物及其应 用。从 98 个肝硬化患者、 83 个健康对照的粪便样 品开展整个肠道菌群微生物的关联分析研究描述 粪便微生物群落及功能成分特征。15 个基因构成 生物标志物作为一个高精确的区分病人的指数。 在另外独立群体中对发现进行检验， 证实了其准 确性， 确认了检测菌群和肝硬化之间的关联鲁棒 性。 生物标志物选自如下一组15种基因中的至少 10种。 15种基因在肝硬化患者的肠道菌群中得到 了富集。 治疗肝硬化的药物， 促进或者增加所述的 基因的数量或者表达。一种生产或筛选药物的方 法， 所述药物促进或者增加所述的生物标志物的 数量或者表达。一种检测。
3、肝硬化、 监测治疗进程， 或者生产、 筛选药物的试剂盒， 用于检测所述的生 物标志物。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 12 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 序列表12页 附图5页 (10)申请公布号 CN 104195145 A CN 104195145 A 1/1 页 2 1. 一种生物标志物， 其特征在于， 包括 (a) 选自如下一组 15 种基因中的至少 10 种 ： MH0008_gene_7932 （SEQ ID NO: 1） 、 L38_ gene_38350 （SEQ 。
4、ID NO: 2） 、 NLM003_gene_35418（SEQ ID NO: 3） 、 H16_gene_75905（SEQ ID NO: 4） 、 H50_gene_73395 （SEQ ID NO: 5） 、 NLF009_gene_80134 （SEQ ID NO: 6） 、 MH0085_ gene_62624 （SEQ ID NO: 7） 、 DOM014_gene_22875 （SEQ ID NO: 8） 、 L106_gene_52730 （SEQ ID NO: 9） 、 H67_gene_32100 （SEQ ID NO: 10） 、 L74_gene_31448 （SEQ。
5、 ID NO: 11） 、 DOF013_ gene_35560（SEQ ID NO: 12） 、 H55_gene_127852（SEQ ID NO: 13） 、 NOF008_gene_3070 （SEQ ID NO: 14） 、 DOM016_gene_86198（SEQ ID NO: 15） ； 所述的 15 种基因在肝硬化患者 的肠道菌群中得到了富集 ； 和 / 或 (b) 所述至少 10 种基因的同源或者互补序列 ； 和 / 或 (c) 所述至少 10 种基因的产物。 2. 根据权利要求 1 所述的生物标志物， 其特征在于， 它为所述的 15 种基因。 3. 一种治疗肝硬化的药物，。
6、 其特征在于， 所述药物促进或者增加如权利要求 1 中所述 的基因的数量或者表达。 4. 一种生产或筛选药物的方法， 其特征在于， 所述药物促进或者增加如权利要求 1 中 所述的生物标志物的数量或者表达。 5. 根据权利要求 4 所述的方法， 其特征在于， 所述的药物治疗或干预前， 检测对象肠道 菌群中是否富集有如权利要求 1 或 2 中所述的生物标志物。 6. 根据权利要求 5 所述的方法， 其特征在于， 所述的检测步骤包括 ： 、 从对象粪便中提取 DNA 样本 ； 、 针对 DNA 样本构建测序文库 ； 、 对测序文库进行高通量测序， 获得测序结果 ； 、 根据测序结果， 确定所述对象的。
7、肠道菌群中是否存在所述的生物标志物。 7. 根据权利要求所述的方法， 其特征在于， 所述的步骤中进一步包括 ： 针对肠道 菌群中的生物标志物的相对丰度进行检测， 通过所得到的相对丰度值与预定的 cutoff 值 进行比较。 8. 一种检测肝硬化、 监测治疗进程， 或者生产、 筛选药物的试剂盒， 其特征在于， 用于检 测如权利要求中所述的生物标志物。 权 利 要 求 书 CN 104195145 A 2 1/7 页 3 肝硬化的生物标志物及其应用 技术领域 0001 本发明涉及基因工程和生物医药领域， 具体涉及肝硬化的生物标志物及其应用。 背景技术 0002 肝硬化 (Liver cirrhos。
8、is) 是临床常见的慢性进行性肝病， 由一种或多种病因长 期或反复作用形成的弥漫性肝损害。 肝硬化是许多肝脏疾病的晚期病变， 是由病毒性肝炎、 酒精中毒、 营养障碍、 胆汁淤积、 血吸虫病、 循环障碍等各种原因所致， 其特点是肝细胞变性 和坏死。 早期肝硬化通过及时防治可以逆转或不再进展， 而晚期将不可逆转， 严重影响患者 的生活质量， 甚至危及生命。 0003 在中国最常见的病因是病毒性肝炎， 主要是乙型病毒性肝炎， 其次为丙型肝炎。 而 自发性腹膜炎、 肝腹水、 肝肾综合征、 肝性脑病、 食道静脉曲张、 出血、 原发性肝癌等这些肝 硬化并发症的危害也是有目共睹的。面对现代如此多的治疗手段，。
9、 却有很大一部分肝硬化 患者依旧痛苦不堪， 每日仍遭受着肉体上的折磨、 心理上的恐惧以及精神上的摧残。 0004 肝硬化患者由于门脉高压， 肝脏功能障碍致胆汁分泌异常， 解毒能力下降， 宿主 抵抗力降低等因素， 导致肠道屏蔽功能破坏， 微生物环境发生改变， 肠道菌群失调。然而， 与肝硬化进程相关的肠道微生物的系统发育及功能成分的变化还不清楚。尽管有些研究 (Garcia et al2004,Wiest et al2012,Bass et al2010) 表明肠道微生物的改变在末期肝 硬化并发症中起重要作用 ( 如自发细菌腹膜炎及肝性脑病 )， 以及诱导早期肝脏疾病及促 进肝损伤作用 ( 如酒精。
10、性肝病及非酒精性脂肪肝病 )， 肠道菌群与人肝脏病理之间的明确 关联仍未知。有研究 (Yi JH et al1999,Paik YH et al2003) 表明可能是由于患者肠道细 菌过度繁殖并产生内毒素 , 抑制肠上皮细胞蛋白质合成 , 小肠微绒毛出现形态学的改变 , 肠细胞质膜异常,细胞支架组织结构发生改变,肠刷状缘载体位置或细胞骨架上载体锚定 点改变 , 导致氨基酸和碳水化合物在通过空肠刷状缘薄膜的运输过程缺陷， 然而其具体机 制有待于进一步的研究。 0005 肝硬化及酒精性肝病患者通过 16S rRNA 测序研究揭示了一个肠道微生物中的类 似实质性的改变(Chen Y et al201。
11、1,Yan A W.et al2011)。 肠道微生物中系统发育机制怎 样发生改变尚不清晰。 发明内容 0006 为了克服现有技术的不足， 本发明的目的是提供肝硬化的生物标志物 ( 基因标记 物 ) 及其应用。 0007 一种生物标志物， 0008 (a) 选自如下一组 15 种基因中的至少 10 种 ： MH0008_gene_7932(SEQ ID NO:1)、 L38_gene_38350(SEQ ID NO:2)、 NLM003_gene_35418(SEQ ID NO:3)、 H16_gene_75905(SEQ ID NO:4)、 H50_gene_73395(SEQ ID NO:。
12、5)、 NLF009_gene_80134(SEQ ID NO:6)、 MH0085_ gene_62624(SEQ ID NO:7)、 DOM014_gene_22875(SEQ ID NO:8)、 L106_gene_52730(SEQ 说 明 书 CN 104195145 A 3 2/7 页 4 ID NO:9)、 H67_gene_32100(SEQ ID NO:10)、 L74_gene_31448(SEQ ID NO:11)、 DOF013_ gene_35560(SEQ ID NO:12)、 H55_gene_127852(SEQ ID NO:13)、 NOF008_gene_3。
13、070(SEQ ID NO:14)、 DOM016_gene_86198(SEQ ID NO:15) ； 所述的15种基因在肝硬化患者的肠道菌群中 得到了富集 ； 和 / 或 0009 (b) 所述至少 10 种基因的同源或者互补序列 ； 和 / 或 0010 (c) 所述至少 10 种基因的产物。 0011 优选的为所述的 15 种基因。 0012 一种治疗肝硬化的药物， 所述药物促进或者增加所述的基因的数量或者表达。 0013 一种生产或筛选药物的方法， 所述药物促进或者增加所述的生物标志物的数量或 者表达。 0014 所述的药物治疗或干预前， 检测对象肠道菌群中是否富集有所述的生物标志物。
14、。 0015 所述的检测步骤包括 ： 0016 a、 从对象粪便中提取 DNA 样本 ； 0017 b、 针对 DNA 样本构建测序文库 ； 0018 c、 对测序文库进行高通量测序， 获得测序结果 ； 0019 d、 根据测序结果， 确定所述对象的肠道菌群中是否存在所述的生物标志物。 0020 所述的步骤 d 中进一步包括， 针对肠道菌群中的生物标志物的相对丰度进行检 测， 通过所得到的相对丰度值与预定的 cutoff 值进行比较。 0021 一种检测肝硬化、 监测治疗进程， 或者生产、 筛选药物的试剂盒， 用于检测所述的 生物标志物。 0022 本发明的有益效果 ： 0023 根据本发明的。
15、肝硬化的基因标记物(生物标志物)可以有效监测肝硬化的易感人 群 ( 包括家族遗传和外来因素引起 ) 或者发现早期患者， 以及监控肝硬化的治疗效果。另 外， 该生物标志物可用于生产诊断试剂盒及治疗药物等。 附图说明 0024 图 1 为实验分析流程图 ； 0025 图 2a、 2b 分别为 LC 基因集与 T2D,MetaHIT， MetaHIT,HMP 基因集的比较结果示意 图 ； 0026 图 3 为健康组和肝硬化组的生物标志物的 PCA 分析结果 ； 0027 图 4 为标记基因在肝硬化组和 T2D 组的 P 值比较结果 ； 0028 图 5 为生物标志物的最优数值分析结果。 具体实施方式。
16、 0029 本发明的实施第一阶段为发现阶段 ： 98 个肝硬化患者及 83 个健康对照组的肠道 微生物成分及功能改变阶段 ； 第二阶段为验证阶段 ： 25个肝硬化患者及31个健康对照组验 证第一阶段结果的准确性。 0030 实施例 1 ： 样本收集和 DNA 提取 0031 肝硬化患者来自杭州浙江大学第一附属医院， 匹配健康对照组是志愿者， 实验共 说 明 书 CN 104195145 A 4 3/7 页 5 采集了 181 例粪便样品， 98 个中国肝硬化患者的粪便样品及 83 个健康中国人的粪便样品， 其中每个个体的新鲜粪便样品分成 200mg/ 份， 共 5 份， 立即 -80冰箱冷冻保。
17、存。 0032 98个中国肝硬化患者的粪便样品及83个健康中国人的粪便样品中提取总DNA。 苯 酚三氯甲烷处理提取 DNA 方法提取 DNA。 0033 实施例 2 ： 构建文库及测序 0034 DNA 建库按仪器制造商 (Illumina) 的操作指南进行。对文库进行 PE2*100bp 测 序。Illumina HiSeq2000(Illumina,San Diego,CA) 平台对 181 个样品的文库进行测序。 每个样本平均产生 4.74Gb(sd.2.04Gb) 高质量测序结果， 总计 858Gb 测序数据量。 0035 参照图 1 的实验流程， 鉴定肝硬化的相关生物标志物， 其中，。
18、 其中省略的步骤或者 细节为本领域技术人员所熟知， 几个重要步骤介绍如下面几个实施例所述。 0036 实施例 3 ： 生物标志物的鉴定 0037 3.1 测序数据的基本处理 0038 获得第一期的 181 个样品的测序数据以后， 对其进行过滤， 质控按以下标准进行 ： a) 移除大于 3 个 N 碱基的 reads ； b) 去除低质量 (Q20) 的 N50reads ； c) 移除超过 10 个低 质量 (Q2) 的碱基或指定尾部 N 碱基数。丢失成对 reads 的序列被认为是单条 reads 用于 组装。 0039 3.2 获得一套肝硬化微生物组基因集 0040 宏基因组生物标志物主体。
19、是基因和相对应的功能， 因此需要对测序序列进行组装 和基因预测， 去冗余， 构建非冗余参考基因集。用 SOAPdenovo 软件将所有样品 reads 组装 成 contigs。将样本的未组装 reads 合并进行 de novo 组装。终由总 reads 数的 61.68 产生 440 万 contigs( 最小片段长度为 500bp)。这些 contigs 总长 11.1Gb， N50 长度范围 为 1,673 48,822bp， 平均长度为 8,644bp。 0041 为了预测 181 个样本的每个样本微生物基因， 我们采用 MetaHIT 人类肠道基因 组研究中的方法。MetaGene。
20、 程序从预测到 13,371,697 个长度大于 100bp 的开放阅读框 (ORFs)。预测的 ORFs 总长为 9,495,923,532bp， 占 contigs 总长度的 90.28。在 ORFs 中， 1,047,855(54.6 ) 是完整的基因， 869,808(45.4 ) 是不完整的。通过去除多余 ORFs 来 建立非冗余 “LC 基因集” ， 定义为配对后超过 95与 90配对的短 ORFs 一致。最终的非冗 余肝硬化肠道基因集包含 2,668,468 个 ORFs， 平均长度 750bp， 42的 reads 可比对到基因 库。 0042 将我们的 LC 基因集与 3 个。
21、其他肠道微生物基因集对比， MetaHIT， HMP 和 T2D。比 对时所有基因预测使用相同的标准。MetaHIT 库包含 3,452,726 个基因， HMP 含 4,768,112 个基因 ,T2D 含 2,148,029 个基因。四个基因集的有 674,131 共有基因。LC、 MetaHIT、 HMP、 T2D 基因集分别包含 794,647、 1,429,517、 2,620,096、 623,570 个 unique 基因。 0043 来自 LC、 T2D、 MetaHIT 基因库的基因与非冗余基因集合并， 随后进行分析。不包含 HMP 肠道基因集， 因为它包含 sanger、 。
22、454 或 Illumina16S 序列， 除了整个宏基因组数据， 它 由对照组健康人群产生， 而非患者。如图 2a、 2b 所示库含 5,382,817 个基因， 其中 797,690 个为其他三个基因库共有。LC 基因集中的基因有 63.9存在于其他一个或两个基因集中， 37.1是 unique 基因。如图 4 所示， 中国人基因在 LC 基因集和 T2D 基因集中存在极大的 差异。 说 明 书 CN 104195145 A 5 4/7 页 6 0044 3.3 生物丰度分析 0045 SOAPalign2.21 用 于 匹 配 针 对 冗 余 基 因 组 的 paired-end cle。
23、an reads， 参 数为 r2m200x1000。Reads 与冗余基因组比对， 可能被分为两部分 ： a)Unique reads(U) ： reads 只与一个基因组比对 ； 这些基因被定义为 unique reads。b)Multiple reads(M) ： 如果这些基因组来着同一物种， reads 与一个以上的基因组比对 ； 我们将这些 reads 定义为 unique reads。如果来着不同物种， 我们定义为 multiple reads。 0046 对于物种 S， 如果丰度为 Ab(S)， 可能与 U 特有 reads 和 M 共享 reads 相关， 评估方 式如下 ： 。
24、0047 Ab(S) Ab(U)+Ab(M) 0048 Ab(U) U/l 0049 0050 Ab(U) 和 Ab(M) 分别为 unique 和 multiple 的丰度， l 表示基因组长度。每个 multiple reads， 有特异物种系数 Co ； 使我们假设 M 在不同物种中有相关 N， 然后按以下 方法计算 CO ： 0051 0052 对于这些 reads， 我们加 N 的 unique 丰度作为标准。 0053 3.4 基因丰度分析 0054 当末端基因能对其在同一个基因上计算基因的丰度。 如果一个基因上配对末端只 有一个 read 可以对齐， 通过检查将先前未对齐的翻译区。
25、域或不读取 read 与组装序列进行 匹配。如果为匹配上了将读取的基因数进行验证， 如果没有， 那么就忽略。 0055 当计算基因的丰度， 我们使用生物的丰度分析相同的策略。对于给定的基因 G， 其 丰度为 Ab(G)， 可能与 U 独有 reads 和 M 共享 reads 相关， 评估方式如下 ： 0056 Ab(S) Ab(U)+Ab(M) 0057 Ab(U) U/l 0058 0059 Ab(U) 和 Ab(M) 分别为 unique 和 multiple 的丰度， l 表示基因组长度。每个 multiple reads， 有特有物种系数 Co ； 使我们假设 M 在不同物种中有相关。
26、 N， 然后按以下 方法计算 CO ： 0060 0061 对于这些 reads， 我们加 N 的 unique 丰度作为标准。 0062 3.5 基因丰度相关性分析 0063 为了研究正常人(83例)与肝硬化患者(98例)的肠道宏基因组学的相关性， 我们 在合并后的基因集中做了一个相关性的研究。基于 181 个样本的基因集上鉴定不同丰度的 说 明 书 CN 104195145 A 6 5/7 页 7 基因， 通过结合 Benjamini Hochberg 的多重检验的 Wilcoxon 秩和检验进行检验。使用一 个非常严格的阈值 (fdr 浙江大学 (Zhejiang University)。
27、 肝硬化的生物标志物及其应用 15 PatentIn version 3.5 1 1194 DNA Klebsiella pneumoniae 1 gtggaaaggt ttgatgccat tgtcgttggc gccggagcgg cgggaatgtt ttgcgcagcg 60 caggcgggcc agcttggctg ccgcgtcctg ctgctggata acggcaaaaa gccggggcga 120 aaaattctga tgtccggcgg cggccgctgc aactttacca acatgtatgt tgaaccggcg 180 gcctatttga gccaaa。
28、accc gcatttttgc aaatctgccc tggcgcgcta cacccagtgg 240 gactttatcg agctggtcgg caaatatggc atcgcctggc atgagaagac cctcggccag 300 ctgttttgcg atgattcggc ggagcagatc gtcaatctgc tgctcgcgga atgtgaaaag 360 ggcggcgtgc agatccgtct gcgcagcgaa atcctcagcg tggagagcga tgaacaaggc 420 taccggctac aggtgaacgg cgaaacgctg atga。
29、ccaaaa agctggtgat cgcctccggc 480 ggtctgtcga tgccggggct cggcgcctcg ccgtttggct ataaagtcgc cgagcagttc 540 ggcctgaagg tgctgccgac ccgcgcggga ctggtgccgt ttaccctcca caagccattg 600 cttgagcagc tgcaggtcct ctccggcgtg tcggtgccgt cgaccattac cgccgagaac 660 序 列 表 CN 104195145 A 10 2/12 页 11 ggcactctgt ttcgcgaaaa t。
30、ctgctgttc acccaccgcg gcctttccgg accggcggtg 720 ctgcaaattt ccagctactg gcagcccggc gagttcgtca ccgttaatct gctaccggac 780 tgcgatcttg atgacttcct taacgagcag cgcagcgcgc atcccaacca gagcctgaag 840 aacaccctgg cgatgcagct gccgaagcgg ctggtggagt gtctgcagca gctggggcag 900 atacctgatg tgacgctcaa gcaactgaac gttcgcgatc。
31、 agcagacgct ggtggagacg 960 ttaaccgcct ggcgcgtgca gccgaacggc accgaaggct accggacggc ggaggtgacc 1020 ctcggcggcg tggacaccaa cgaactctcg tcgcgtacca tggaggcgcg taaggcgccg 1080 ggtctctact ttatcggcga agtgatggac gttaccggct ggctcggggg gtataacttc 1140 cagtgggcgt ggtcaagcgc ctgggcctgc gcgcaggcgc tggtggaagg gtaa 。
32、1194 2 963 DNA Klebsiella pneumoniae 2 gtgaaagacc atactatccc tttaacgcta atttctatcc ttgctgatgg cgagtttcac 60 tctggcgaac agcttggtga gcagttaggc atgagccggg cggcgattaa taagcacatc 120 cagaccttac gtgactgggg cgtcgatgtg tttactgtgc cgggcaaggg ttacagcctg 180 ccggagccta ttcatctatt agatgagaaa aagatttctc aagagata。
33、ga ccatggtcga 240 gtgacggtcc ttcccgtcat cgactctact aaccagtatt tgctggacag gcttgatgag 300 ctgacgtccg gagatgcctg tgtggctgaa tatcagcaag cagggcgagg ccggcgaggc 360 agaaaatggt tttcgccctt tggcgcgaat ctctatctct cgatgtactg gcgtctggag 420 序 列 表 CN 104195145 A 11 3/12 页 12 cagggcccgg cagcggctat tggcctaagc ctggt。
34、gatcg gtattgtgat cgctgaagtt 480 ctgcagcagc tcggggccga acaggttcgc gtgaaatggc caaacgatat ttacctgcag 540 gatcgtaagc tgtcagggat cctcgtggaa ctgacgggga aaacgggcga tgccgcacaa 600 atcgtcagcg gcgcgggtat caaccttgtg atgcgtcgcg tggagtctga tgtcgtcaat 660 caggggtgga tcagccttca ggaagcgggg gtggtcatcg accgtaacct cct。
35、cgccgcg 720 cgcctgatta aagagctgcg cctgggactg gagctgttcg agcaggaagg attggctccc 780 tatctaccgc gctgggaaaa actggataac tttattcatc gcccggtgaa actgattatc 840 ggtgataaag aaatttacgg catttcgcgt ggcattgacg cccagggcgc actattgctg 900 gagcaggatg gtgtaataaa agcctgggtg ggtggtgaaa tatcattgcg cagtgcagaa 960 taa 963 。
36、3 597 DNA Bacteroides fragilis 3 gttctgatag gacttggcat ttctgccggc ctgctctctc cgaactatgt gttcgctacg 60 tctttagaga cttatgagaa ccagtctgta gctgctgttc agcaagcaag gaagattacc 120 ggtacactga ccgatgctgt cggtgaacct attattggtg ctactgtttt agaaaaagga 180 aacccttcca atggtacgat taccgatatc aatggtaaat tctctctttc ggt。
37、ccatcct 240 aatgctgtga tcagtatttc gtatatagga tacataacac aaaatattaa gataactaat 300 caaacctcac tgaaagtggt tatgatggat gatacccagg cgctggaaga agtagtggta 360 序 列 表 CN 104195145 A 12 4/12 页 13 gtaggttatg gttcgcagaa gaaagcgaat ctgaccggag ccgtatcttc tgtgaaaatg 420 gatgaggtac tgggtgaccg tcctattttg aatgcatctg 。
38、atgctcttca ggagccgtgc 480 cgggactgtt tgtatctaat ggaggtaatg ctcccggaac cagcaagtcg ttccagattc 540 gtggagccta ttcggtgggt gtcaagaact cggacggttc atacggaaac acattaa 597 4 801 DNA Oscillibacter sp 4 atgaagattt atgtttgtgt caagcaggta cccgatacct ccggcaaggt ggctgtcaat 60 cccgatggta ctctgaaccg tgcttccatg cagacc。
39、atca ccaaccccga tgatatgaac 120 gctgttgagg ccgccctgaa gctgaaggac gccaccggct gcaaggtcac cgttgtcacc 180 atgggccccc ctcccgctgc cggtatgctg cgtgagctga tggccatggg cgctgacgag 240 ggcgtgctgg tttccgcccg tgagttcggc ggttccgata cctacgctac ctcccagatc 300 ctggccgccg ctctgagcac cctgggtgtt gagaaggacg atatcgtgat gtgc。
40、ggccgt 360 caggctatcg atggcgatac cgctcaggtc ggtccccaga tcgctgagaa gctgcacctg 420 ccccaggtca cctatgccgc cgacatcaag aaggacggcg acaccatcac tgtccagcgc 480 atgctggagg atggctacat gaccatcaag gtccagactc cctgcctgct gacctgcatc 540 aaggagctga acaacccccg ctatatgtcc atcggcggca tcctgtctac ctacagcaag 600 cccctgacc。
41、a ctctgggcta tgaggacctg aaggatcatc ccctgatcga cgctaccacc 660 atcggcctga agggctctcc caccaacatc ttcaagagct tcacgcctcc tcagaagggc 720 序 列 表 CN 104195145 A 13 5/12 页 14 gtcggcatga tgctggaggg cgacggtaag gaaacctgcg agaagctggc cggtattctg 780 gccgctaagc acatcatcta a 801 5 543 DNA Firmicutes bacterium 5 atga。
42、tcgaag aaatgctggc atataaccgc gaattcgtcc ggtccaaggg ctatgaaaag 60 ttccagacca gtaagttccc agacaagaaa atcgccatcc tcacctgcat ggatacccgt 120 ctggtggagt tgctccccgc agcgctgggc atccgcaacg gtgatgtgaa gctgatcaaa 180 aacgccggcg gcatgatcac cggccccttt gacagtgccg tgcgcagcct gctggtgggc 240 atcatcgagc tgggcgtgga gga。
43、ggtcatg gtcatcggcc acacggactg cggcgtagcc 300 cacatcaatg ccgacatgat gatccgccac ctgatccagc ggggcgtttc tcaggaccat 360 atcgacatga tgcgctactg cggcattgac tttgaggcgt ggctccgagg cttcgactgc 420 gtggagaact ccgtggcgga gaccgtggac ctgctgcgca accatcccct tatgcccgcc 480 gatgtcacca tccgaggcta cgtcatcaac accgaaaccg g。
44、cgagttggc cccgcaggag 540 taa 543 6 249 DNA Bacteroides 6 atgaaccaaa gaaaagaaga agacacaacc gaagccgatt tcatcatccg ctcgtacacc 60 序 列 表 CN 104195145 A 14 6/12 页 15 aaagccgaac ttgcacagct ttactgcccg ggactcgacc ccgtgctcgc cctgcagaaa 120 ctctaccgct ggatgcgtaa aaacaccgcc ctgacacagg cactgtccga tgtcaattac 180 。
45、aacaaatacc gccacagctt ccttaaacgg gaagtccggc tgatcgtgta ttacctggga 240 gaaccttga 249 7 414 DNA Bacteroides 7 atgtcaacct atgcaccttt tgccaaaccg ctctatgtaa tgctgaaacc ggtaggtgcg 60 gtatgcaatc tggcatgcga ttattgctat tatctggaga aatccaaact atatagagac 120 aaccccaagc atgtgatgag cgaggaactg ctggaaaagt tcatcgagg。
46、a gtacatcaac 180 tcgcagacca tgccccaggt tctgttcacc tggcatggcg gagagacgct gatgcgtccg 240 ctctctttct acaaacgtgc catggagctg caaaggaaat atgccaacgg acgcaccata 300 gacaactgca tacagaccaa cggcacgttg ctgaccgatg aatggtgccg ggttttcaaa 360 gaaaacaact ggctgggtgg gtgtctccat agacgggcct caggagttcc atga 414 8 639 DNA。
47、 Oscillospiraceae 8 gaggcccagg acccggataa ggatattcag ctttatatca acagccccgg cggctccgtg 60 序 列 表 CN 104195145 A 15 7/12 页 16 acggacggca tggccatcta cgataccatg cagtacgtca agtgcgacgt gtctaccatc 120 tgcgtgggca tggctgcgtc catgggagct ttcctgttgt cctccggcgc caagggtaag 180 cggatcgcgc tgcccaacgc cgaaattatg atcc。
48、accagc cctccgcagg tacgcagggc 240 aaggtcacgg acatggagat cgacgtggag cacttcctgc ggatcaagaa gaacctgaat 300 gagatcctgg cgtccaacac cggtaagacc gccgaagagg tcaaggcggc ctccgagcgg 360 gaccactgga tgacggctga caggccaagg acttcggtct ggtggataag atcatcactg 420 ctaagaagta aaagaggtaa taccatgagt gacgaaggca aaaaggccct gcgctgttcc 480 ttctgcggaa agcgggaaca gcaggtccat cgtatgatcc agggccccgg cgtccgcatc 540 tgcgacgagt gcgtgcagct ttgcatgagc attctgaacg a。