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1、(10)申请公布号 CN 104152376 A (43)申请公布日 2014.11.19 CN 104152376 A (21)申请号 201410369354.3 (22)申请日 2014.07.30 C12N 1/20(2006.01) C12Q 1/06(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (71)申请人 湖南豫园生物科技有限公司 地址 410005 湖南省长沙市芙蓉区五一西路 2 号第一大道 909 (72)发明人 郑锦华 陈剑 黄旭明 李庆红 谭欢 袁新荣 苏红 (74)专利代理机构 北京康信知识产权代理有限 责任公司 11240 代理人 吴贵明 (54) 发明。
2、名称 芽孢保护剂、 应用及微生物肥料中产芽孢菌 含量的检测方法 (57) 摘要 本发明提供了一种芽孢保护剂、 应用及微生 物肥料中产芽孢菌含量的检测方法， 芽孢保护剂， 包括氯化钠浓度为810的生理盐水以及用量 为生理盐水用量 1 5wt.的聚天冬氨酸。本 发明提供的芽孢杆菌保护剂能保护已经萌发的芽 孢， 使其 70以内的灭菌温度下仍能继续在培养 基中生长， 从而保证了后续对微生物肥料中芽孢 菌含量的检测准确性。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 1041。
3、52376 A CN 104152376 A 1/1 页 2 1. 一种芽孢保护剂， 其特征在于， 包括氯化钠浓度为 8 10的生理盐水以及用量为 所述生理盐水用量 1 5wt.的聚天冬氨酸。 2. 根据权利要求 1 所述的芽孢保护剂， 其特征在于， 由氯化钠浓度为 8 10的生理 盐水以及用量为所述生理盐水用量 1 5wt.的聚天冬氨酸组成。 3.根据权利要求2所述的芽孢保护剂， 其特征在于， 由氯化钠浓度为8.5的生理盐水 以及用量为所述生理盐水用量 4wt.的聚天冬氨酸组成。 4. 一种权利要求 1 3 中任一项所述的芽孢保护剂在灭菌处理中的应用。 5. 根据权利要求 4 所述的应用， 。
4、其特征在于， 包括以下步骤 ： 将含芽孢萌发菌体的待处 理物分散于所述芽孢保护剂中， 得到菌悬液 ； 在 70 80下对所述菌悬液进行灭菌处理 ； 优选所述分散步骤包括在 200r/ 分钟的摇床上振荡 60 分钟。 6. 一种微生物肥料中产芽孢菌含量的检测方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： 1) 将待检测肥料分散于如权利要求 1 3 中任一项所述的芽孢保护剂中， 配置成菌悬 液 ； 2) 对所述菌悬液在 70 80下水浴 15 分钟进行灭菌处理， 得到灭菌悬液 ； 3) 将所述灭菌悬液接种至芽孢培养基中， 培养后形成菌落， 根据芽孢培养基上所形成 菌落数量计数后， 得出所述待检测肥料的含菌。
5、量。 7. 根据权利要求 6 所述的方法， 其特征在于， 所述芽孢培养基为由胰蛋白胨 4.0 6.0g/L、 酵母浸粉 2.0 3.0g/L、 葡萄糖 0.5 1.5g/L、 七水硫酸镁 0.2 1g/L、 氯化钠 0.51.5g/L、 碳酸钙0.51.5g/L、 磷酸氢二钾2.03.0g/L、 硫酸锰0.01g/L、 TTC0.01g/ L 和琼脂 16 20g/L 组成。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述芽孢培养基为由胰蛋白胨5.0g/L、 酵 母浸粉 2.5g/L、 葡萄糖 1.0g/L、 七水硫酸镁 0.5g/L、 氯化钠 1.0g/L、 碳酸钙 1.0g/L、 磷酸。
6、氢 二钾 2.5g/L、 硫酸锰 0.01g/L、 TTC0.01g/L 和琼脂 16g/L 组成。 9. 根据权利要求 6 8 中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述菌悬液中还包括 1 2 滴 /L 分散剂。 10. 根据权利要求 9 所述的方法， 其特征在于， 所述分散剂为吐温或 OP-10。 权 利 要 求 书 CN 104152376 A 2 1/5 页 3 芽孢保护剂、 应用及微生物肥料中产芽孢菌含量的检测方 法 技术领域 0001 本发明涉及微生物肥料检测领域， 特别地， 涉及一种芽孢保护剂、 应用及微生物肥 料中产芽孢菌含量的检测方法。 背景技术 0002 现有技术中， 对微生。
7、物肥料中活菌数的检测一直沿用农业部的检测标准。检测方 法为 ： 将菌剂制品通过稀释， 将稀释到一定浓度的菌液接入预先制备好的平板检测培养基 中， 培养后， 对培养基中的菌落数进行肉眼观察计数， 从而计算得出产品的含菌数。为了保 证检测的准确性， 需根据肥料中所含菌种类， 分别选择对应的培养基进行培养。 0003 对微生物肥料中各种以芽孢形式存在的细菌含量的检测结果常出现较大偏差。 这 主要是因为检测时各类芽孢菌的芽孢还未萌发， 检测出的总菌数中不含这些以芽孢形式存 在的细菌的数量， 从而降低了微生物肥料中实际的含菌量。 发明内容 0004 本发明目的在于提供一种芽孢保护剂、 应用及微生物肥料中。
8、产芽孢菌含量的检测 方法， 以解决现有技术中微生物肥料中以芽孢形式存在的芽孢含量无法准确获知的技术问 题。 0005 为实现上述目的， 根据本发明的一个方面， 提供了一种芽孢保护剂， 包括氯化钠浓 度为 8 10的生理盐水以及用量为生理盐水用量 1 5wt.的聚天冬氨酸。 0006 进一步地， 由氯化钠浓度为 8 10的生理盐水以及用量为生理盐水用量 1 5wt.的聚天冬氨酸组成。 0007 进一步地， 由氯化钠浓度为 8.5的生理盐水以及用量为生理盐水用量 4wt.的 聚天冬氨酸组成。 0008 根据本发明的另一方面还提供了一种上述的芽孢保护剂在灭菌处理中的应用。 0009 进一步地， 包括。
9、以下步骤 ： 将含芽孢萌发菌体的待处理物分散于芽孢保护剂中， 得 到菌悬液 ； 在 70 80下对菌悬液进行灭菌处理。 0010 根据本发明的另一方面还提供了一种微生物肥料中产芽孢菌含量的检测方法， 包 括以下步骤 ： 1) 将待检测肥料分散于如上述的芽孢保护剂中， 配置成菌悬液 ； 2) 对菌悬液 在 70 80下水浴 15 分钟进行灭菌处理， 得到灭菌悬液 ； 3) 将灭菌悬液接种至芽孢培养 基中， 培养后形成菌落， 根据芽孢培养基上所形成菌落数量计数后， 得出待检测肥料的含菌 量。 0011 进一步地， 芽孢培养基为由胰蛋白胨 4.0 6.0g/L、 酵母浸粉 2.0 3.0g/L、 葡。
10、萄 糖 0.5 1.5g/L、 七水硫酸镁 0.2 1g/L、 氯化钠 0.5 1.5g/L、 碳酸钙 0.5 1.5g/L、 磷 酸氢二钾 2.0 3.0g/L、 硫酸锰 0.01g/L、 TTC0.01g/L 和琼脂 16 20g/L 组成。 0012 进一步地， 芽孢培养基为由胰蛋白胨 5.0g/L、 酵母浸粉 2.5g/L、 葡萄糖 1.0g/L、 说 明 书 CN 104152376 A 3 2/5 页 4 七水硫酸镁 0.5g/L、 氯化钠 1.0g/L、 碳酸钙 1.0g/L、 磷酸氢二钾 2.5g/L、 硫酸锰 0.01g/L、 TTC0.01g/L 和琼脂 16g/L 组成。。
11、 0013 进一步地， 菌悬液中还包括 1 2 滴 /L 分散剂。 0014 进一步地， 分散剂为吐温或 OP-10。 0015 本发明具有以下有益效果 ： 0016 本发明提供的芽孢杆菌保护剂能保护已经萌发的芽孢， 使其 70以内的灭菌温度 下仍能继续在培养基中生长， 从而保证了后续对微生物肥料中芽孢菌含量的检测准确性。 0017 除了上面所描述的目的、 特征和优点之外， 本发明还有其它的目的、 特征和优点。 下面将对本发明作进一步详细的说明。 具体实施方式 0018 以下结合实施例对本发明进行详细说明， 但是本发明可以由权利要求限定和覆盖 的多种不同方式实施。 0019 本发明提供的芽孢杆。
12、菌保护剂包括氯化钠浓度为 8 10的生理盐水以及用量 为生理盐水用量 1 5wt.的聚天冬氨酸。 0020 现有技术中聚天冬氨酸多被用作肥料增效剂， 可以强化作物对 N， P， K 及微量元素 的全面吸收， 效果显著， 适用于多种作物和土壤。 而本发明通过试验发现将其用于分散含芽 孢的待检测样品， 能保护其中以及已经萌发的芽孢菌种， 防止其在后续去除其他杂菌的加 热过程中失活， 而无法在培养阶段继续生长， 从而影响检测所得含菌数的准确性。 通过添加 此比例的聚天冬氨酸后， 能对分散于其中的待测物料中所含已经萌发的芽孢菌体起到保护 作用。 0021 聚天冬氨酸因含有肽键和羧基等活性基团的结构特点。
13、， 具有极强的螯合、 分散、 吸 附等作用， 且配伍性极佳。 具体的机理不得而知， 猜测可能是由于聚天冬氨酸能附着于萌发 后的芽孢菌体表面， 阻挡高温对菌体的损伤。 作为70的萌发芽孢菌体保护剂十分的有效。 生理盐水有维持细胞正常渗透压的作用， 从而起到保护芽孢菌的作用。二者联合使用起到 对萌发芽孢菌体的保护作用。 0022 优选由氯化钠浓度为 8 10的生理盐水以及用量为生理盐水用量 1 5wt. 的聚天冬氨酸组成。 更有选此时该保护剂对芽孢菌萌发菌体的保护效果较优。 经过70下 水浴 15 分钟后， 萌发菌体存活率可达到 80以上。 0023 更优选的由氯化钠浓度为 8.5的生理盐水以及用。
14、量为生理盐水用量 4wt.的 聚天冬氨酸组成。此时经过 70下水浴 15 分钟后， 萌发芽孢菌体存活率可达到 90以上。 0024 优选保护剂的保护条件为 70 80下水浴 15 分钟。此温度和水浴时间下， 保护 剂能有效保护萌发芽孢菌体， 同时能将待检测物料中的其他非芽孢萌发菌体杀灭。起到提 高检测结果准确性的作用。 0025 本发明另一方面还提供了一种上述的芽孢保护剂在灭菌处理中的应用。 包括以下 步骤 ： 将含芽孢萌发菌体的待处理物分散于芽孢保护剂中， 得到菌悬液 ； 在 70 80下对 菌悬液进行灭菌处理。本发明提供的芽孢保护剂通过对芽孢萌发菌体起到保护作用， 保护 其分散成为菌悬液后。
15、再 70 80下不被杀灭。 0026 优选分散步骤包括在 200r/ 分钟的摇床上振荡 60 分钟。在此条件下进行分散能 说 明 书 CN 104152376 A 4 3/5 页 5 提高菌体的分散均匀性。防止局部菌体浓度过高导致的萌发菌体受损死亡。 0027 本发明另一方面还提供了一种微生物肥料中产芽孢菌含量的检测方法， 包括以下 步骤 ： 0028 1) 将待检测肥料分散于如前述的芽孢保护剂中， 配置成菌悬液 ； 0029 2) 对菌悬液在 70 80下水浴 15 分钟进行灭菌处理， 得到灭菌悬液 ； 0030 3) 将灭菌悬液接种至芽孢培养基中， 培养后形成菌落， 根据芽孢培养基上所形成。
16、 菌落数量计数后， 得出待检测肥料的含菌量。 0031 采用该方法能有效检测微生物肥料中芽孢类细菌的数量， 如固氮类芽孢杆菌、 巨 大芽孢杆菌、 胶质芽孢杆菌、 地衣芽孢杆菌、 侧胞芽孢杆菌、 枯草芽孢杆菌等等菌种。 采用该 方法结合上述芽孢保护液， 能有效保护微生物肥料中已经萌发的芽孢体避免在灭菌过程中 被杀灭。同时灭菌过程能保证将菌悬液中的其他菌体杀灭。在分散带检测肥料时可以在其 中加入分散剂。分散剂的加入量为 1 2 滴 /L。分散剂能将菌悬液中的抱团菌体分散开， 防止抱团后稀释过程中无法将其有效分开， 而导致检测结果不准确。分散剂可以为常用的 各类分散剂， 优选为吐温或 OP-10( 。
17、烷基酚聚氧乙烯醚 )。分散效果较优。 0032 经过灭菌处理的菌悬液需要按常规方法进行稀释。 稀释倍数根据待检测肥料中菌 种数量进行按常规方法进行选择。可参考平板培养法中的稀释方法进行。 0033 之后将灭菌后的菌悬液接种至芽孢培养基中。优选芽孢培养基为由胰蛋白胨 4.0 6.0g/L、 酵母浸粉 2.0 3.0g/L、 葡萄糖 0.5 1.5g/L、 七水硫酸镁 0.2 1g/L、 氯化钠 0.5 1.5g/L、 碳酸钙 0.5 1.5g/L、 磷酸氢二钾 2.0 3.0g/L、 硫酸锰 0.01g/L、 TTC0.01g/L 和琼脂 16 20g/L 组成。按此比例制得的芽孢培养基具有促进。
18、菌悬液中未萌 发芽孢萌发的作用。尤其还能有利于得到芽孢保护液保护的芽孢萌发体进一步萌发生长。 该培养基中胰胨、 酵母浸粉提供氮源、 维生素和生长因子 ； 七水硫酸镁、 氯化钠维持均衡的 渗透压和增强细胞活力 ； 葡萄糖提供碳源 ； 碳酸钙， 磷酸氢二钾为缓冲剂 ； 硫酸锰促进芽孢 菌生长， 形成芽孢 ； TTC( 氯化三苯四氮唑 ) 是显色剂， TTC 和活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢 酶反应， 生成红色的甲月赞， 用来表示细胞的活力 ； 琼脂是培养基的凝固剂。硫酸锰的加入 量， 既能促进芽孢菌生长， 形成芽孢， 又能避免对生长中的菌体的毒害作用。 0034 更优选芽孢培养基为由胰蛋白胨 5.0g。
19、/L、 酵母浸粉 2.5g/L、 葡萄糖 1.0g/L、 七 水硫酸镁 0.5g/L、 氯化钠 1.0g/L、 碳酸钙 1.0g/L、 磷酸氢二钾 2.5g/L、 硫酸锰 0.01g/L、 TTC0.01g/L 和琼脂 16g/L 组成。该培养基对芽孢体及受保护萌发体有效生长。就生长的细 菌数和菌落直径而言， 该培养基优于 中国药典 中所使用细菌计数营养琼脂培养基 (NA)。 0035 灭菌处理时， 菌悬液经过 70后迅速冷却至 30 40以便有效杀死其中的非芽 孢类细菌而使芽孢类细菌萌发菌体更好的萌发生长。热处理一方面杀死营养体， 也能分散 菌团。 水浴完迅速冷却。 冷却后的菌悬液还需经过旋。
20、转式摇床上200r/分钟， 充分振荡40 60 分钟， 得到灭菌液。 0036 实施例 0037 以下实施例和对比例中所用物料和仪器均为市售。 0038 存活率 (70处理菌悬液测得的活菌数 / 未经热处理常温菌悬液测得的活菌 数 )*100 0039 检测结果与标注菌数的正负偏差 ( ) ( 检测菌数 - 标注菌数 )/ 标注菌 说 明 书 CN 104152376 A 5 4/5 页 6 数 *100 0040 实施例 1 0041 1) 将待检测肥料 ( 标注含菌量为 50 亿 / 克 ) 分散于芽孢保护剂 ( 氯化钠浓度为 10的生理盐水和生理盐水 5wt.的聚天冬氨酸、 1 滴吐温 。
21、) 中， 配置成菌悬液 ； 0042 2) 用玻璃棒搅拌使之溶解吸水均匀后菌悬液在 70下水浴 15 分钟， 迅速冷却到 40， 上旋转式摇床上 200r/ 分钟充分振荡 60 分钟， 得到灭菌悬液 ； 0043 3) 对灭菌悬液稀释 10-7倍接种至芽孢培养基中， 培养后形成菌落， 根据芽孢培养 基上所形成菌落数量计数后， 得出待检测肥料的含菌量 ； 0044 其中芽孢培养基为由胰蛋白胨 6.0g/L、 酵母浸粉 3.0g/L、 葡萄糖 1.5g/L、 七水硫 酸镁 1g/L、 氯化钠 1.5g/L、 碳酸钙 1.5g/L、 磷酸氢二钾 3.0g/L、 硫酸锰 0.01g/L、 TTC0.0。
22、1g/ L 和琼脂 16g/L 组成。 0045 实施例 2 0046 1) 将待检测肥料 ( 标注含菌量为 45 亿 / 克 ) 分散于芽孢保护剂 ( 氯化钠浓度为 8的生理盐水和生理盐水 1wt.的聚天冬氨酸 ) 中， 配置成菌悬液 ； 0047 2) 用玻璃棒搅拌使之溶解吸水均匀后菌悬液在 75下水浴 15 分钟， 迅速冷却到 30， 上旋转式摇床上 200r/ 分钟充分振荡 40 分钟， 得到灭菌悬液 ； 0048 3) 对灭菌悬液稀释 10-7倍接种至芽孢培养基中， 培养后形成菌落， 根据芽孢培养 基上所形成菌落数量计数后， 得出待检测肥料的含菌量 ； 0049 其中芽孢培养基为由胰。
23、蛋白胨 4.0g/L、 酵母浸粉 2.0g/L、 葡萄糖 0.5g/L、 七水 硫酸镁 0.2g/L、 氯化钠 0.5g/L、 碳酸钙 0.5g/L、 磷酸氢二钾 2.0g/L、 硫酸锰 0.01g/L、 TTC0.01g/L 和琼脂 18g/L 组成。 0050 实施例 3 0051 1) 将待检测肥料 ( 标注含菌量为 40 亿 / 克 ) 分散于芽孢保护剂 ( 氯化钠浓度为 8.5的生理盐水和生理盐水 4wt.的聚天冬氨酸 ) 中， 配置成菌悬液 ； 0052 2) 用玻璃棒搅拌使之溶解吸水均匀后菌悬液在 80下水浴 15 分钟， 迅速冷却到 35， 上旋转式摇床上 200r/ 分钟充分。
24、振荡 50 分钟， 得到灭菌悬液 ； 0053 3) 对灭菌悬液稀释 10-7倍接种至芽孢培养基中， 培养后形成菌落， 根据芽孢培养 基上所形成菌落数量计数后， 得出待检测肥料的含菌量 ； 0054 其中芽孢培养基为由胰蛋白胨 5.0g/L、 酵母浸粉 2.5g/L、 葡萄糖 1.0g/L、 七水 硫酸镁 0.5g/L、 氯化钠 1.0g/L、 碳酸钙 1.0g/L、 磷酸氢二钾 2.5g/L、 硫酸锰 0.01g/L、 TTC0.01g/L 和琼脂 20g/L 组成。 0055 对比例 1 3 0056 与实施例 3 的区别在于 ： 所用芽孢保护液中没有使用聚天冬氨酸和菌悬液中没有 使用分散。
25、剂吐温或 OP-10。 0057 检测方法 ： 0058 分别对实施例 1 3 和对比例 1 3 中所得菌悬液和灭菌液进行平板稀释培养。 培养基为本发明提供的芽孢培养基。得到相应的菌数。 0059 实施例 1 3 中结果列于表 1 中。 0060 表 1 实施例 1 3 中菌体存活率表 说 明 书 CN 104152376 A 6 5/5 页 7 0061 0062 对比例 1 3 中所得灭菌液培养后， 平板计数所得结果列于表 2 中。 0063 表 2 对比例 1 3 中菌数变化表 0064 0065 由表 1 数据可见。经过灭菌处理后， 菌体中的芽孢在后续培养中得到萌发， 同时在 灭菌过程。
26、中已经萌发的芽孢体得到保护， 因而菌的平均存活率为107.74。 由实施例13 中所得结果可知， 其中菌悬液菌体检测结果的为正偏差， 平均值为 7.32， 灭菌液菌体检测 结果的为正偏差， 平均值为 14.99， 同时表明灭菌液检测结果比标注的菌数值高， 有显著 的分散和保护芽孢菌的作用。 由表2可见， 不采用聚天冬氨酸作为芽孢菌体保护剂。 待检测 肥料中， 已经萌发的芽孢菌体死亡数量巨大， 培养后活菌存活率仅为 52.76， 菌数损失近 一半。通过对比可见， 通过加入保护剂， 能有效保护芽孢中已经萌发的菌体， 防止其在灭菌 过程中被杀灭， 从而保护其在后续检查过程中能存留下。对比例 1 3 中， 菌悬液菌体检测 结果的为负偏差， 平均值为 -1.06， 灭菌液菌体检测结果为负偏差， 平均值为 -45.69， 由于存活率较低， 因而对生物有机肥等产品中所含菌体的检测结果与标注的菌数有较大偏 差。 0066 以上仅为本发明的优选实施例而已， 并不用于限制本发明， 对于本领域的技术人 员来说， 本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 104152376 A 7 。