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1、(10)申请公布号 CN 104151592 A (43)申请公布日 2014.11.19 CN 104151592 A (21)申请号 201410372692.2 (22)申请日 2014.07.31 C08J 7/12(2006.01) C08L 89/00(2006.01) C08J 5/18(2006.01) (71)申请人 浙江大学 地址 310027 浙江省杭州市西湖区浙大路 38 号 (72)发明人 杨明英 帅亚俊 (74)专利代理机构 杭州中成专利事务所有限公 司 33212 代理人 唐银益 (54) 发明名称 一种通过生物矿化提高丝蛋白膜力学性能的 方法 (57) 摘要 本。
2、发明公开了一种通过生物矿化提高丝蛋白 膜力学性能的方， 通过将丝蛋白水溶液或者丝蛋 白粉溶解在六氟丙酮、 六氟异丙醇、 甲酸等有机溶 剂中， 得到丝蛋白溶液， 再将丝蛋白水溶液或者丝 蛋白溶液滴加到塑料板上， 干燥后得到丝蛋白膜 等步骤实现， 本发明显著提高了丝蛋白膜的力学 性能， 操作简单， 生产周期短 ： 提取工艺简单、 高 效， 没有复杂繁琐的矿化过程， 时间上大为节省。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104151592 。
3、A CN 104151592 A 1/1 页 2 1. 一种通过生物矿化提高丝蛋白膜力学性能的方法， 其特征在于 ： 具体步骤如下 ： (1) 将丝蛋白水溶液或者丝蛋白粉溶解在有机溶剂中， 得到丝蛋白溶液， 再将丝蛋白水 溶液或者丝蛋白溶液滴加到塑料板上， 干燥后得到丝蛋白膜 ； (2) 将步骤 (1) 中的丝蛋白膜进行后处理， 得到不溶性的丝蛋白膜 ； (3) 将步骤 (2) 中的丝蛋白膜浸渍于 pH 值为 6.0-8.0 的 CaCl2水溶液中浸泡半小时， 得到预矿化的柞蚕丝蛋白膜 ； (4) 将一定量纳米羟基磷灰石粉末加入到 40mL 去离子水中， 再加入 0.64mL 浓度为 0.1 。
4、摩尔每升的 HCl， 超声 10 分钟， 使其形成均一的乳白色悬浊液， 为羟基磷灰石工作液 ； (5) 将步骤 (4) 中的羟基磷灰石工作液， 加入 3gNaCl 和 200mL 去离子水， 持续搅拌均 匀， 得到羟基磷灰石矿化液， 将步骤 (3) 中的预矿化的丝蛋白膜放入羟基磷灰石矿化液中 搅拌并缓慢将 pH 调至 7.4 ； (6) 持续搅拌 0.1-48h， 温度控制在 4-100 度， 使得丝蛋白膜表面逐渐沉积羟基磷灰石 晶体， 得到矿化的丝蛋白膜。 2. 根据权利要求 1 所述的通过生物矿化提高丝蛋白膜力学性能的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 (1) 中丝蛋白种类是家蚕丝素、 丝胶。
5、蛋白、 丝腺蛋白、 野蚕丝素、 丝胶蛋白、 蜘蛛丝 蛋白、 重组丝蛋白、 柞蚕丝蛋白中的任意一种。 3. 根据权利要求 1 所述的通过生物矿化提高丝蛋白膜力学性能的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 (1) 中， 所述的有机溶剂是六氟丙酮、 六氟异丙醇、 乙酸、 甲酸中的任意一种。 4. 根据权利要求 1 所述的通过生物矿化提高丝蛋白膜力学性能的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 (2) 中的后处理方法， 是将丝蛋白膜浸泡在含甲醇、 乙醇、 甲醚、 乙醚、 丙酮和甲基 丙二醇中的一种或几种中溶液中处理 0.1-48h。 5. 根据权利要求 1 所述的通过生物矿化提高丝蛋白膜力学性能的方法， 其特征。
6、在于 ： 所述步骤 (4) 中， 所述的羟基磷灰石粉末为自制或者商业购买。 6. 根据权利要求 1 所述的通过生物矿化提高丝蛋白膜力学性能的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 (4) 中， 对羟基磷灰石工作液配置， 加入的羟基磷灰石粉末与去离子水质量比为 1 ： 10-1 ： 1000。 7. 根据权利要求 1 所述的通过生物矿化提高丝蛋白膜力学性能的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 (5) 中， 丝蛋白膜与矿化液的质量比为 1 ： 10-1 ： 200。 权 利 要 求 书 CN 104151592 A 2 1/5 页 3 一种通过生物矿化提高丝蛋白膜力学性能的方法 技术领域 0001 本发明。
7、涉及一种丝蛋白膜的生物矿化方法， 尤其是涉及一种显著提高丝蛋白膜力 学性能的生物矿化方法， 属于材料的加工方法。 背景技术 0002 羟基磷灰石具有良好的生物相容性， 是构成人体骨骼和牙齿的主要无机成分。全 世界每年因外伤、 疾病、 遗传等各种因素造成的骨缺损患者多达数千万人。 模拟天然骨骼主 要成分， 通过矿物质和材料相结合制备的生物支架， 使得骨修复成为一种可能。 将天然高分 子材料通过矿化的方法， 能够制备出与天然骨成分在物化性质上相近的支架材料， 这也是 是生物支架材料制备中常用的方法。 0003 家蚕丝蛋白、 野蚕丝蛋白 ( 柞蚕丝和天蚕丝等 ) 和蜘蛛丝等丝蛋白纤维是天然的 高分子。
8、。 丝蛋白纤维具有良好的生物相容性和机械强度， 是一种可降解的生物高分子材料， 其降解产物对细胞或者机体无毒副作用， 也很少产生免疫排斥或者炎症反应， 利用丝蛋白 的这些优点， 可将丝蛋白加工成多孔支架或者膜材料， 然后进行生物矿化， 用于科学研究和 临床应用。然而普通的矿化方法 ( 物理或者化学矿化 ) 使得丝蛋白膜的力学性能显著降 低， 而且普遍存在矿化不完全， 容易生成除羟基磷灰石以外的杂物， 因此不能满足科学研究 与生产的需要。如公开日为 2012 年 07 月 04 日， 公开号为 CN102532573A 的中国专利中， 公 开了一种丝胶蛋白 / 羟基磷灰石复合膜的快速成型方法， 。
9、该方法是对丝胶蛋白 / 羟基磷灰 石复合膜进行快速成型， 但容易生成羟基磷灰石的副产物。 0004 综上所述， 目前还没有一种工序简单， 操作容易， 矿化物纯净， 又能提高丝蛋白膜 力学性能的仿生矿化方法。 发明内容 0005 本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足， 利用仿生矿化方法， 通过丝 蛋白肽链中的某些功能基团 ( 如羧基 ) 来诱导羟基磷灰石在丝蛋白膜表面的成核， 快速地 使羟基磷灰石沉积在丝蛋白膜表面。 在该矿化体系中， 羟基磷灰石提供强有力的刚性， 而丝 蛋白膜提供较大的延展性， 使得羟基磷灰石与丝蛋白膜两者优势互补， 发明出一种显著提 高丝蛋白膜力学性能的新型矿化方法。。
10、 0006 本发明解决上述问题所采用的技术方案是如下 ： 0007 一种通过生物矿化提高丝蛋白膜力学性能的方法， 具体包括如下步骤 ： 0008 (1) 将丝蛋白水溶液或者丝蛋白粉溶解在六氟丙酮、 六氟异丙醇、 甲酸等有机溶剂 中， 得到丝蛋白溶液， 再将丝蛋白水溶液或者丝蛋白溶液滴加到塑料板上， 干燥后得到丝蛋 白膜 ； 0009 (2) 将步骤 (1) 中的丝蛋白膜进行后处理， 得到不溶性的丝蛋白膜 ； 0010 (3) 将步骤 (2) 中的丝蛋白膜浸渍于 pH 值为 6.0-8.0 的 CaCl2水溶液中浸泡半小 时， 得到预矿化的柞蚕丝蛋白膜 ； 说 明 书 CN 104151592 。
11、A 3 2/5 页 4 0011 (4)将一定量纳米羟基磷灰石粉末加入到40mL去离子水中， 再加入0.64mL浓度为 0.1 摩尔每升的 HCl， 超声 10 分钟， 使其形成均一的乳白色悬浊液， 为羟基磷灰石工作液 ； 0012 (5)将步骤(4)中的羟基磷灰石工作液， 加入3gNaCl和200mL去离子水， 持续搅拌 均匀， 得到羟基磷灰石矿化液， 将步骤 (3) 中的预矿化的丝蛋白膜放入羟基磷灰石矿化液 中搅拌并缓慢将 pH 调至 7.4 ； 0013 (6) 持续搅拌 0.1-48h， 温度控制在 4-100 度， 使得丝蛋白膜表面逐渐沉积羟基磷 灰石晶体， 得到矿化的丝蛋白膜 ； 。
12、0014 (7) 力学性能测试表明矿化的丝蛋白膜力学性能显著提高， 红外光谱和 X- 射线 衍射结果表明得到的矿化沉积物为单一的羟基磷灰石晶体。细胞实验表明人 MSC 细胞和 MG-63 细胞能够在矿化的丝蛋白膜上粘附与增殖， 具有良好的生物相容性。 0015 作为进一步地改进， 本发明所述步骤 (1) 中丝蛋白种类是家蚕丝素、 丝胶蛋白、 丝 腺蛋白、 野蚕丝素、 丝胶蛋白、 蜘蛛丝蛋白、 重组丝蛋白、 柞蚕丝蛋白中的任意一种。 0016 作为进一步地改进， 本发明所述步骤 (1) 中， 溶解丝蛋白的有机溶剂是六氟丙酮、 六氟异丙醇、 乙酸、 甲酸中的任意一种。 0017 作为进一步地改进，。
13、 本发明所述步骤 (2) 中的后处理方法， 是将丝蛋白膜浸泡在 含甲醇、 乙醇、 甲醚、 乙醚、 丙酮和甲基丙二醇中的一种或几种中溶液中处理 0.1-48h。 0018 作为进一步地改进， 本发明所述步骤 (4) 中， 使用到的羟基磷灰石粉末为自制或 者商业购买。 0019 作为进一步地改进， 本发明所述步骤 (4) 中， 对羟基磷灰石工作液配置， 加入的羟 基磷灰石粉末与去离子水质量比为 1 ： 10-1 ： 1000 0020 作为进一步地改进， 本发明所述步骤 (5) 中， 丝蛋白膜与矿化液质量比为 1 ： 10-1 ： 200。 0021 本发明所述的方法工艺简单， 操作容易， 制备周。
14、期短， 生物相容性好。通过这种矿 化方法， 矿化羟基磷灰石附着在丝蛋白膜的表面， 能够确保得到的无机矿化物为羟基磷灰 石晶体， 羟基磷灰石纯度很高。这种方法不仅可用于家蚕、 野蚕 ( 柞蚕丝和天蚕丝等 ) 和蜘 蛛等丝蛋白膜的矿化， 甚至可用于其它大分子材料的矿化。本发明制备的矿化丝蛋白膜材 料具有生物相容性。 通过此方法矿化后的柞蚕丝素膜杨氏模量可达70MPa， 是普通柞蚕丝素 膜的 2.5 倍。此发明丰富了生物矿化的类型， 为生物材料和组织工程领域提供新思路， 具有 广阔的应用前景。 0022 由于上述技术方案的运用， 本发明与现有技术相比具有以下突出特点 ： 0023 (1)显著提高了丝。
15、蛋白膜的力学性能(包括弹性模量和最大应力)， 通过本发明制 备而成的成品做成的生物膜与家蚕丝素或者其它天然高分子蛋白做成的生物膜相比， 具有 很高的弹性模量以及应力， 从而达到科学研究和临床医学的应用。 0024 (2) 操作简单， 生产周期短 ： 提取工艺简单、 高效， 没有复杂繁琐的矿化过程， 时间 上大为节省。 0025 (3) 因为使用高纯的羟基磷灰石晶体， 因此矿化过程中得到的晶体始终是羟基磷 灰石， 没有其它杂物的污染。 0026 (4) 良好的生物相容性 ： 丝蛋白膜或者降解物对细胞或组织无毒性反应 ； 细胞实 验表现出较高的细胞粘附率和增殖率， 具有良好的生物相容性， 生物安全。
16、性高， 能满足生物 说 明 书 CN 104151592 A 4 3/5 页 5 医学中的应用。 附图说明 0027 图 1- 为实施例 1 中几种矿化时间不同的丝蛋白膜力学性能的比较， 其中， ASF 为 柞蚕丝素膜 ； ASF-8h 为矿化 8h 的柞蚕丝素膜 ； ASF-24h 为矿化 24h 的柞蚕丝素膜。 具体实施方式 0028 下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明， 以下实施例是对本发明的解释而 本发明并不局限于以下实施例。 0029 实施例 1 0030 本实施例中生物矿化提高丝蛋白膜力学性能的方法依次包括如下步骤 ： 0031 (1) 将柞蚕丝素粉溶解在六氟丙酮机溶剂中， 。
17、得到柞蚕丝素蛋白溶液， 再将柞蚕丝 素蛋白溶液滴加到塑料板上， 干燥后得到丝蛋白膜 ； 0032 (2)将步骤(1)中的丝蛋白膜浸泡在75的酒精当中处理12h， 得到不溶性的柞蚕 丝素蛋白膜 ； 0033 (3) 将步骤 (2) 中的柞蚕丝素蛋白膜浸渍于 pH 值为 6.0 的 CaCl2水溶液中浸泡半 小时， 得到预矿化的柞蚕丝素蛋白膜 ； 0034 (4)将1g纳米羟基磷灰石粉末加入到40mL去离子水中， 再加入0.64mL浓度为0.1 摩尔每升的 HCl， 超声 10 分钟， 使其形成均一的乳白色悬浊液， 为羟基磷灰石工作液 ； 0035 (5)将步骤(4)中的羟基磷灰石工作液， 加入3。
18、gNaCl和200mL去离子水， 持续搅拌 均匀， 得到羟基磷灰石矿化液， 将步骤 (3) 中的预矿化的柞蚕丝素蛋白膜放入羟基磷灰石 矿化液中搅拌并缓慢将 pH 调至 7.4 ； 0036 (6) 持续搅拌 8h， 温度控制在 25 度， 使得柞蚕丝素蛋白膜表面逐渐沉积羟基磷灰 石晶体， 得到矿化的柞蚕丝素蛋白膜 ； 0037 (7) 红外光谱和 X- 射线衍射结果表明得到的矿化柞蚕丝素蛋白膜表面的沉积物 为单一的羟基磷灰石晶体 ； 0038 (8) 力学性能测试该矿化的柞蚕丝素蛋白膜， 杨氏模量可达 60MPa。 0039 弹性模量作为衡量材料产生弹性变形难易程度的指标， 其值越大， 使材料。
19、发生一 定弹性变形的应力也越大， 即材料刚度越大。图 1 为实施例 1 中几种矿化时间不同的丝蛋 白膜弹性模量的比较， ASF为柞蚕丝素膜 ； ASF-8h为矿化8h的柞蚕丝素膜 ； ASF-24h为矿化 24h 的柞蚕丝素膜。柞蚕丝素膜作为对照组， 在未矿化时， 其杨氏模量约为 33MPa ； 矿化 8 小 时后， 杨氏模量约为 50MPa ； 矿化 24 小时后， 杨氏模量约为 61MPa， 与柞蚕丝素膜相比， 差异 极显著， *p0.01。说明通过此矿化方法能够显著提高丝蛋白膜的力学性能， 同时， 随着矿 化时间的增加， 丝蛋白矿化膜的力学性能也逐渐增加。 0040 实施例 2 0041。
20、 本实施例中促进细胞生长的柞蚕丝素的生物矿化方法依次包括如下步骤 ： 0042 (1) 将丝素蛋白粉溶解在六氟异丙醇中， 得到丝素蛋白溶液， 再将丝蛋白溶液滴加 到塑料板上， 干燥后得到丝素蛋白膜 ； 0043 (2)将步骤(1)中的丝素蛋白膜浸泡在75的酒精中处理24h， 得到不溶性的丝素 说 明 书 CN 104151592 A 5 4/5 页 6 蛋白膜 ； 0044 (3)将步骤(2)中的丝素蛋白膜浸渍于pH值为7.0的CaCl2水溶液中浸泡半小时， 得到预矿化的丝素蛋白膜 ； 0045 (4)将2g纳米羟基磷灰石粉末加入到40mL去离子水中， 再加入0.64mL浓度为0.1 摩尔每升。
21、的 HCl， 超声 10 分钟， 使其形成均一的乳白色悬浊液， 为羟基磷灰石工作液 ； 0046 (5) 将步骤 (4) 中的羟基磷灰石工作液加入 3gNaCl 和 200mL 去离子水， 持续搅拌 均匀， 得到羟基磷灰石矿化液， 将步骤 (3) 中的预矿化的丝素蛋白膜放入羟基磷灰石矿化 液中搅拌并缓慢将 pH 调至 7.4 ； 0047 (6)持续搅拌24h， 温度控制在25度， 使得丝素蛋白膜表面逐渐沉积羟基磷灰石晶 体， 得到矿化的丝素蛋白膜 ； 0048 (7) 红外光谱和 X- 射线衍射结果表明得到的矿化丝素蛋白膜表面的沉积物为单 一的羟基磷灰石晶体 ； 0049 (8) 力学性能测。
22、试该矿化的柞蚕丝素蛋白膜， 杨氏模量可达 70MPa。 0050 实施例 3 0051 本实施例中生物矿化提高丝蛋白膜力学性能的方法依次包括如下步骤 ： 0052 (1) 将柞蚕丝素粉溶解在六氟丙酮机溶剂中， 得到柞蚕丝素蛋白溶液， 再将柞蚕丝 素蛋白溶液滴加到塑料板上， 干燥后得到丝蛋白膜 ； 0053 (2)将步骤(1)中的丝蛋白膜浸泡在75的酒精当中处理12h， 得到不溶性的柞蚕 丝素蛋白膜 ； 0054 (3) 将步骤 (2) 中的柞蚕丝素蛋白膜浸渍于 pH 值为 6.0 的 CaCl2水溶液中浸泡半 小时， 得到预矿化的柞蚕丝素蛋白膜 ； 0055 (4)将1g纳米羟基磷灰石粉末加入。
23、到40mL去离子水中， 再加入0.64mL浓度为0.1 摩尔每升的 HCl， 超声 10 分钟， 使其形成均一的乳白色悬浊液， 为羟基磷灰石工作液 ； 0056 (5)将步骤(4)中的羟基磷灰石工作液， 加入3gNaCl和200mL去离子水， 持续搅拌 均匀， 得到羟基磷灰石矿化液， 将步骤 (3) 中的预矿化的柞蚕丝素蛋白膜放入羟基磷灰石 矿化液中搅拌并缓慢将 pH 调至 7.4 ； 0057 (6)持续搅拌24h， 温度控制在25度， 使得柞蚕丝素蛋白膜表面逐渐沉积羟基磷灰 石晶体， 得到矿化的柞蚕丝素蛋白膜。 0058 (7)MG-63 细胞接种在该矿化的柞蚕丝素蛋白膜上， 细胞能够在矿。
24、化的柞蚕丝素蛋 白膜上粘附与增殖， 具有良好的生物相容性。 0059 实施例 4 0060 本实施例中生物矿化提高丝蛋白膜力学性能的方法依次包括如下步骤 ： 0061 (1) 将柞蚕丝素粉溶解在六氟丙酮机溶剂中， 得到柞蚕丝素蛋白溶液， 再将柞蚕丝 素蛋白溶液滴加到塑料板上， 干燥后得到丝蛋白膜 ； 0062 (2)将步骤(1)中的丝蛋白膜浸泡在75的酒精当中处理12h， 得到不溶性的柞蚕 丝素蛋白膜 ； 0063 (3) 将步骤 (2) 中的柞蚕丝素蛋白膜浸渍于 pH 值为 6.0 的 CaCl2水溶液中浸泡半 小时， 得到预矿化的柞蚕丝素蛋白膜 ； 0064 (4)将1g纳米羟基磷灰石粉末。
25、加入到40mL去离子水中， 再加入0.64mL浓度为0.1 说 明 书 CN 104151592 A 6 5/5 页 7 摩尔每升的 HCl， 超声 10 分钟， 使其形成均一的乳白色悬浊液， 为羟基磷灰石工作液 ； 0065 (5)将步骤(4)中的羟基磷灰石工作液， 加入3gNaCl和200mL去离子水， 持续搅拌 均匀， 得到羟基磷灰石矿化液， 将步骤 (3) 中的预矿化的柞蚕丝素蛋白膜放入羟基磷灰石 矿化液中搅拌并缓慢将 pH 调至 7.4 ； 0066 (6)持续搅拌24h， 温度控制在25度， 使得柞蚕丝素蛋白膜表面逐渐沉积羟基磷灰 石晶体， 得到矿化的柞蚕丝素蛋白膜。 0067 (。
26、7) 人 MSC 细胞接种在该矿化的柞蚕丝素蛋白膜上， 细胞能够在矿化的柞蚕丝素 蛋白膜上粘附与增殖， 具有良好的生物相容性。 0068 实施例 5 0069 本实施例中生物矿化提高丝蛋白膜力学性能的方法依次包括如下步骤 ： 0070 (1) 将柞蚕丝素粉溶解在六氟丙酮机溶剂中， 得到柞蚕丝素蛋白溶液， 再将柞蚕丝 素蛋白溶液滴加到塑料板上， 干燥后得到丝蛋白膜 ； 0071 (2)将步骤(1)中的丝蛋白膜浸泡在75的酒精当中处理12h， 得到不溶性的柞蚕 丝素蛋白膜 ； 0072 (3) 将步骤 (2) 中的柞蚕丝素蛋白膜浸渍于 pH 值为 6.0 的 CaCl2水溶液中浸泡半 小时， 得到。
27、预矿化的柞蚕丝素蛋白膜 ； 0073 (4)将1g纳米羟基磷灰石粉末加入到40mL去离子水中， 再加入0.64mL浓度为0.1 摩尔每升的 HCl， 超声 10 分钟， 使其形成均一的乳白色悬浊液， 为羟基磷灰石工作液 ； 0074 (5)将步骤(4)中的羟基磷灰石工作液， 加入3gNaCl和200mL去离子水， 持续搅拌 均匀， 得到羟基磷灰石矿化液， 将步骤 (3) 中的预矿化的柞蚕丝素蛋白膜放入羟基磷灰石 矿化液中搅拌并缓慢将 pH 调至 7.4 ； 0075 (6) 持续搅拌 8h， 温度控制在 25 度， 使得柞蚕丝素蛋白膜表面逐渐沉积羟基磷灰 石晶体， 得到矿化的柞蚕丝素蛋白膜。 0076 (7) 人 HEK-293 细胞接种在该矿化的柞蚕丝素蛋白膜上， 细胞能够在矿化的柞蚕 丝素蛋白膜上粘附与增殖， 具有良好的生物相容性。 0077 最后， 还需要注意的是， 以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然， 本发明不 限于以上实施例子， 还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直 接导出或联想到的所有变形， 均应认为是本发明的保护范围。 说 明 书 CN 104151592 A 7 1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 104151592 A 8 。