一种大黄鱼脑细胞系及其建立方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104004706 A (43)申请公布日 2014.08.27 CN 104004706 A (21)申请号 201310703461.0 (22)申请日 2013.12.19 CCTCC NO:C2013156 2013.10.31 C12N 5/071(2010.01) C12R 1/91(2006.01) (71)申请人 集美大学 地址 361021 福建省厦门市集美区银江路 185 号 (72)发明人 王艺磊 庄道华 张子平 李敏 (74)专利代理机构 厦门市首创君合专利事务所 有限公司 35204 代理人 李雁翔 (54) 发明名称 一种大黄鱼脑细胞系及其。

2、建立方法 (57) 摘要 本发明公开了一种大黄鱼脑细胞系及其构建 方法， 该细胞系于 2013 年 10 月 31 日保藏在中 国典型培养物保藏中心， 保藏登记入册编号为 ： CCTCCNO:C2013156。本发明的大黄鱼脑细胞系可 连续传代， 能够提供大量的大黄鱼脑细胞系， 用于 病原特性研究、 疫苗研制、 功能基因研究及育种研 究等 ； 其性状优良， 为上皮状细胞， 呈现出扁平不 规则的三角形和多边形等。分裂旺盛， 传代时间 短， 易消化， 贴壁率好， 耐饥饿。 本发明的构建方法 重复性强、 构建的细胞系稳定性好。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书。

3、 6 页 附图 9 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 附图9页 (10)申请公布号 CN 104004706 A CN 104004706 A 1/1 页 2 1. 一种大黄鱼脑细胞系， 其特征在于 ： 该细胞系于 2013 年 10 月 31 日保藏在中国典型 培养物保藏中心， 保藏登记入册编号为 ： CCTCC NO:C2013156。 2. 一种权利要求 1 所述的大黄鱼脑细胞系的建立方法， 其特征在于 ： 包括如下步骤 ： （1） 大黄鱼脑组织的获取 ： 将7个月大， 长9-11cm的大黄鱼鱼苗在含青霉素及链霉素双 抗的灭菌海水。

4、中暂养 1-1.5 小时， 然后滴入占灭菌海水体积 0.005-0.015% 的丁香酚， 直至 鱼体翻转， 腹部朝上， 对刺激物应激行为为止 ； 以灭菌纱布块擦除鱼体表面粘液， 以浸有酒 精的棉球擦拭鱼体表面后， 取出大黄鱼脑组织并置于含青霉素及链霉素双抗的 D-hanks 液 中 ； （2） 原代培养 ： 将上述大黄鱼脑组织切碎至 0.7-2.0mm3的小组织块， 以 D-hanks 液漂 洗， 最后以完全培养液洗 ； 漂洗后将上述小组织块接种于细胞培养瓶中， 吸除多余培养液， 翻转瓶身 27恒温干贴 24 小时， 再加入完全培养液翻正瓶身以使小组织块浸入培养液中， 于 27恒温培养启动原代。

5、培养， 每周更换完全培养液一次 ； （3） 传代培养 ： 原代培养至贴壁细胞增殖至至少 50-60% 覆盖率时， 移除旧培养液 , 并 清洗去除残留的血清和二价金属离子 ； 然后以 0.25% 胰酶消化法传代悬起细胞， 以 1:2-10 进行传代 ； 以后每隔 2-8 天传代一次， 所述大黄鱼脑细胞系建立成功。 3. 如权利要求 2 所述的一种大黄鱼脑细胞系的建立方法， 其特征在于 ： 所述完全培养 液中包括 ： DMEM/F12 培养液、 胎牛血清 FBS、 - 巯基乙醇、 N- 乙酰葡糖糖胺、 羧甲基纤维素 钠、 人 FGF-basic、 人 EGF、 人 HGF、 青霉素及链霉素。 4.。

6、 如权利要求 3 所述的一种大黄鱼脑细胞系的建立方法， 其特征在于 ： 所述完全培养 液为 ： 以 DMEM/F12 培养液为基础， 包括终浓度分别为 16.7% 胎牛血清 FBS、 0.5 - 巯基 乙醇、 50g/mL N-乙酰葡糖糖胺、 50g/mL羧甲基纤维素钠、 10g/L人FGF-basic、 5g/ L 人 EGF、 1g/L 人 HGF、 100IU/mL 青霉素以及 100g/mL 链霉素。 权 利 要 求 书 CN 104004706 A 2 1/6 页 3 一种大黄鱼脑细胞系及其建立方法 技术领域 0001 本发明属于鱼类细胞培养技术领域， 具体涉及一种大黄鱼脑细胞系及其。

7、建立方 法。 背景技术 0002 大黄鱼 （Larimichthys crocea） ， 硬骨鱼纲， 鲈形目， 石首鱼科， 黄鱼属。 肉质鲜嫩， 经济价值较高， 市场需求量较大。上世纪 70 年代以前野生大黄鱼资源较充沛， 年平均捕捞 量一度达到 12 万吨的水平。70 年代初由于对野生大黄鱼尤其是对其越冬群体的滥捕乱 捞， 致使野生大黄鱼产量迅速枯竭。80 年代以后， 随着近海经济开发、 环境污染等原因， 导 致近海的原各大产卵场不再适宜大黄鱼产卵， 现野生大黄鱼捕获量极低。1986 年大黄鱼人 工育苗得以突破， 随后得到重视迅猛发展， 现阶段市场大黄鱼都是由海水养殖大黄鱼来提 供 84。然。

8、而， 现阶段伴随工业化发展， 近海养殖环境进一步恶化 ； 大黄鱼病害频发 ； 大黄鱼 亲鱼资源枯竭， 种质退化等因素极大的限制了大黄鱼养殖的进一步发展， 现阶段大黄鱼养 殖产量约 8.6 万吨， 不及 70 年代以前的捕捞量。因此对大黄鱼病害防治、 良种选育、 遗传背 景的研究极为迫切。 0003 建立鱼类细胞系能为鱼类病毒分离、 抗病毒机制、 疫苗研发、 转基因技术、 嵌合体 组织工程等研究提供极大的便捷， 且设施人力等资源要求相对活体实验低， 重复性好， 研究 周期短。目前关于大黄鱼细胞系的建立仅有孙爱在 2010 年报道建立了大黄鱼成鱼的鱼鳍、 吻端、 脾脏三种细胞系， 而未见其他组织细。

9、胞系的报道。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种大黄鱼脑细胞系。 0005 本发明的另一目的在于提供上述大黄鱼脑细胞系的建立方法。 0006 本发明的技术方案如下 ： 0007 一种大黄鱼脑细胞系， 该细胞系于2013年11月保藏在中国典型培养物保藏中心， 保藏登记入册编号为 ： CCTCC NO:C2013156。 0008 本发明的另一技术方案如下 ： 0009 一种上述大黄鱼脑细胞系的建立方法， 包括如下步骤 ： 0010 （1） 大黄鱼脑组织的获取 ： 将7个月大， 长9-11cm的大黄鱼鱼苗在含青霉素及链霉 素双抗的灭菌海水 （青霉素及链霉素双抗购自康宁公司， 该双抗的 1。

10、00X 浓缩液含 10000U/ mL 青霉素以及 10000g/mL 链霉素， 配制海水时每 100mL 海水加入 1mL 青霉素及链霉素双 抗的100X浓缩液） 中暂养1-1.5小时， 然后滴入占灭菌海水体积0.005-0.015%的丁香酚， 直 至鱼体翻转， 腹部朝上， 对刺激物应激行为为止 ； 以灭菌纱布块擦除鱼体表面粘液， 以浸有 酒精的棉球擦拭鱼体表面后， 取出大黄鱼脑组织并置于含青霉素及链霉素双抗的 D-hanks 液 （100mL D-hanks 液加入 1mL 青霉素及链霉素双抗的 100X 浓缩液） 中 ； 0011 （2） 原代培养 ： 将上述大黄鱼脑组织切碎至 0.7-。

11、2.0mm3的小组织块， 以 D-hanks 液 说 明 书 CN 104004706 A 3 2/6 页 4 漂洗， 最后以完全培养液漂洗 ； 漂洗后将上述小组织块接种于细胞培养瓶中， 吸除多余培养 液， 翻转瓶身 27恒温干贴 24 小时， 再加入完全培养液， 翻正瓶身以使小组织块浸入培养 液中， 于 27恒温培养启动原代培养， 每周更换完全培养液一次 ； 0012 （3）传代培养 ： 原代培养至贴壁细胞增殖至至少 50-60% 覆盖率时， 移除旧培养 液 , 并清洗去除残留的血清和二价金属离子 ； 然后以 0.25% 胰酶消化法传代悬起细胞， 以 1:2-10 进行传代 ； 以后每隔 2。

12、-8 天传代一次， 所述大黄鱼脑细胞系建立成功。 0013 在本发明的一个优选实施方案中， 所述完全培养液中包括 ： DMEM/F12 培养液、 胎 牛血清 FBS、 - 巯基乙醇、 N- 乙酰葡糖糖胺、 羧甲基纤维素钠、 人 FGF-basic、 人 EGF、 人 HGF、 青霉素及链霉素。 0014 在本发明的一个优选实施方案中， 所述完全培养液为 ： 以 DMEM/F12 培养液为基 础， 包括终浓度分别为 16.7% 胎牛血清 FBS、 0.5 - 巯基乙醇、 50g/mL N- 乙酰葡糖糖 胺、 50g/mL羧甲基纤维素钠、 10g/L人FGF-basic、 5g/L人EGF、 1g。

13、/L人HGF、 100IU/ mL 青霉素以及 100g/mL 链霉素。 0015 本发明的有益效果是 ： 0016 1、 本发明的大黄鱼脑细胞系可连续传代， 迄今已传代 40 代， 能够提供大量的大黄 鱼脑细胞系， 用于病原特性研究、 疫苗研制、 功能基因研究及育种研究等。 0017 2、 本发明的大黄鱼脑细胞系的构建方法重复性强、 构建的细胞系稳定性好 ； 0018 3、 本发明的大黄鱼脑细胞系的细胞性状优良。为上皮状细胞， 呈现出扁平不规则 的三角形和多边形等。分裂旺盛， 传代时间短， 易消化， 贴壁率好， 耐饥饿 ； 0019 4、 本发明的构建方法所使用的完全培养液中包括 DMEM/。

14、F12 培养液、 胎牛血清 FBS、 - 巯基乙醇、 N- 乙酰葡糖糖胺、 羧甲基纤维素钠、 人 FGF-basic、 人 EGF、 人 HGF、 青霉 素及链霉素， DMEM/F12 培养液和胎牛血清 FBS 为细胞生长提供了充足的营养 ； - 巯基乙 醇、 N- 乙酰葡糖糖胺、 羧甲基纤维素钠、 人 FGF-basic、 人 EGF 和人 HGF 的加入可以刺激细胞 活性、 加速细胞分裂增殖， 同时为细胞体外培养提供了良好的缓冲环境， 能够使细胞在长期 培养时维持稳定的 pH ； 青霉素和链霉素加大了抗菌谱， 特别在原代培养时， 能有效地抑制 细菌生长， 防止细胞污染。 附图说明 0020。

15、 图 1 为本发明的大黄鱼脑细胞系原代培养第 3 天的显微镜照片 （50） ； 0021 图 2 为本发明的大黄鱼脑细胞系原代培养第 10 天的显微镜照片 （50） ； 0022 图 3 为本发明的大黄鱼脑细胞系原代培养第 15 天的显微镜照片 （50） ； 0023 图 4 为本发明的大黄鱼脑细胞系传代培养第 2 代的显微镜照片 （50） ； 0024 图 5 为本发明的大黄鱼脑细胞系传代培养第 3 代的显微镜照片 （50） ； 0025 图 6 为本发明的大黄鱼脑细胞系传代培养第 15 代的显微镜照片 （50） ； 0026 图 7 为本发明的大黄鱼脑细胞系传代培养第 28 代的显微镜照片。

16、 （50） ； 0027 图 8 为本发明的大黄鱼脑细胞系在不同传代比例下的增殖曲线 ； 0028 图 9 为本发明的大黄鱼脑细胞系冻存后复苏 24h 后的显微镜照片 （50） ； 0029 图 10 为本发明的大黄鱼脑细胞系冻存后复苏 72h 后的显微镜照片 （50） ； 0030 图 11 为本发明的大黄鱼脑细胞系冻存复苏后再传代的显微镜照片 （50） 说 明 书 CN 104004706 A 4 3/6 页 5 0031 图 12 为本发明的大黄鱼脑细胞系的染色体图 （100） ； 0032 图 13 为本发明的大黄鱼脑细胞系的染色体数目分布图 ； 0033 图 14 为本发明的大黄鱼脑。

17、细胞系饥饿处理 30 天后的显微镜照片 （50） ； 0034 图 15 为本发明的大黄鱼脑细胞系饥饿处理后更换完全培养液 36h 的显微镜照片 （50） ； 0035 图 16 为本发明的大黄鱼脑细胞系转染 pEGFP-N1 质粒 36h 的显微照片 （100） 0036 图 17 为本发明的大黄鱼脑细胞系转染 Oct4-pEGFP-N1 重组载体 36h 的显微镜照 片 （100） 。 具体实施方式 0037 以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。 0038 溶液配制 0039 D-Hanks 溶 液 ：取 0.4g KCl， 0.06g KH2PO4， 8。

18、.0g NaCl， 0.35g NaHCO3， 0.132g NaH2PO412H2O 定容至 1L， 于 121 20min 高压灭菌， 4保存。另取 D-Glucose 配成 200g/ L 贮存液， 121 20min 高压灭菌， 冷却后 -20长期贮存。使用时每 L D-Hanks 溶液加入 5mL D-Glucose 贮存液以及 10mL100 双抗溶液 （购自康宁公司， 该双抗的 100X 浓缩液含 10000U/mL 青霉素以及 10000g/mL 链霉素） 。 0040 含双抗的灭菌海水:取新鲜海水， 于12120min高压灭菌， 使用时每1L灭菌海水 加入 10mL100 双。

19、抗溶液 （购自康宁公司， 该双抗的 100X 浓缩液含 10000U/mL 青霉素以及 10000g/mL 链霉素） 。 0041 完全培养液 ： 取商品化 500mL DMEM/F12 培养液， 然后加入终浓度分别为 16.7% 胎 牛血清 FBS、 0.5 - 巯基乙醇、 50g/mL N- 乙酰葡糖糖胺、 50g/mL 羧甲基纤维素钠、 10g/L人FGF-basic、 5g/L人EGF、 1g/L人HGF、 100IU/mL青霉素以及100g/mL链霉 素。4保存， 使用时间不超过 1 个月。 0042 10% 甘油冻存液 ： 甘油于 121 20min 高压灭菌。取 10mL 甘油与。

20、 90mL 的胎牛血清 混匀， 4保存。 0043 秋水仙碱贮存液 ： 取上述配置 D-hanks 溶液， 加入 250mg 秋水仙碱， 定容至 125mL， 充分溶解， 于超净台内以 0.22m 针头过滤器过滤除菌。贮存液浓度为 2mg/mL （100） ， 除 菌后密封， 4保存。 0044 低渗溶液 ： 称取 0.3g KCl 溶于 100mL 超纯水中。室温长期有效。 0045 MTT 贮存液 ： 取上述配置 D-hanks 溶液， 加入 250mg MTT 粉末， 充分溶解， 定容至 50mL， 于超净台内以0.22m针头过滤器过滤除菌。 贮存液浓度为5mg/mL， 除菌后以锡箔纸 。

21、包裹避光， -20保存。 0046 卡诺氏固定液 ： 将醋酸与甲醇按照 1:3 的比例混合， 而后置于 -20短期保存， 配 好后有效期不超过 1 天。 0047 Giemsa 染液母液 ： 称取 0.5g Giemsa 干粉， 加入 5mL 甘油， 充分碾磨 ； 继续加入 28mL 甘油， 以锡箔纸包裹， 于 60加热 2h ； 添加 33mL 甲醇， 混匀。母液存放于棕色玻璃瓶 中， 放置 3 周以后使用， 室温长期保存。 0048 实施例 1 说 明 书 CN 104004706 A 5 4/6 页 6 0049 本发明大黄鱼脑细胞系的建立 ： 0050 （1） 由于大黄鱼属石首鱼科鱼类。

22、， 对次氯酸盐极度敏感， 故在体表消毒步骤采用含 双抗的灭菌海水代替次氯酸消毒液。将 7 个月大， 长 9-11cm 的大黄鱼鱼苗在含双抗的灭菌 海水中暂养 1 2h。结束时滴入 3-4 滴丁香酚， 直至鱼体翻转， 腹部向上， 对刺激无应激行 为为止。以灭菌纱布块擦除鱼体表黏液。以浸有 75% 酒精的棉球擦拭鱼体表 2 次。将鱼体 移入超净台， 用解剖器具取出脑组织， 并放入事先加好 D-hanks 中培养皿中漂洗 3-4 次。 0051 （2） 将脑组织块以两把 11 号手术刀交叉切碎至 1mm3大小左右的小组织块。将切 好的小组织块以含双抗的 D-hanks 溶液漂洗 2 次， 最后以含血。

23、清生长因子的培养液漂洗一 次。将组织块接种于 25cm2细胞培养瓶中， 吸除多余培养液。轻轻翻转瓶身， 使之倒置。于 27恒温干贴 24h。小心加入 5mL 完全培养液 （含双抗、 生长因子） ， 轻轻翻正培养瓶以使组 织块浸入培养液中。于 27恒温培养启动原代培养， 每周换完全培养液一次。 0052 如图 1 至图 3 所示， 大黄鱼脑组织启动原代培养后第 3 天即有贴壁细胞迁徙出组 织块 （图 1） ， 至第 10 天已有小片细胞簇出现 （图 2） ， 至第 15 天一些组织块周围出现密集细 胞堆叠现象 （图 3） 。 0053 （3） 当大黄鱼脑细胞系原代培养贴壁细胞覆盖率达到 50-6。

24、0% 或是更高时， 原代细 胞可能会出现较明显的接触抑制， 此时以胰酶消化法启动传代培养。采用经典细胞消化步 骤 ： 移除原先培养瓶中的旧培养液 ； 加入 5mLD-Hanks 溶液， 清洗 1 次以去除原培养液中的 血清、 二价金属离子 （此类物质会极大地影响胰蛋白酶的消化作用） ； 倒出上述 D-Hanks 溶 液， 加入 2.5mL0.25% 的商品化的含 EDTA 的胰酶消化液， 晃动瓶体， 使胰酶溶液与底层细胞 充分接触， 倒出胰酶消化液 （此步应较快进行， 否则易造成消化过度 ； 移除胰酶消化液时应 留有足够使平底保持湿润的溶液， 否则瓶底易出现部分区域变干而影响消化） ； 移出培。

25、养 瓶， 倒置显微镜下观察， 至大多数细胞变圆解除贴壁后， 立即移入超净台加入 5mL 含血清培 养液终止消化 ； 吹打， 镜检吹打效果， 如若残余细胞过多则可重复消化一次 ； 以 1:2-10 的比 例将细胞悬液接种至新培养瓶， 补齐培养液至 5mL 后将培养瓶置于 27恒温培养， 以后每 隔 2-8 天传代一次。如图 4 至 7 所示， 大黄鱼脑细胞系从 2 代至第 28 代较稳定地呈现类纤 维状多边形。 0054 实施例 2 0055 实施例 1 的大黄鱼脑细胞系的冻存与复苏。 0056 （1） 冻存 ： 取一瓶 75cm2的生长旺盛铺满培养瓶瓶底的大黄鱼脑细胞系细胞， 采用 胰酶消化法。

26、， 离心后收集细胞沉淀， 缓慢加入 3mL 配置好的细胞冻存液， 并轻轻吹打细胞， 使其均匀分散在细胞冻存液中， 使用移液枪将液体移入冻存管中。冻存管在 4放置 1h， 再 置于冰盒中， 将冰盒置于 -80放置 1 天， 最后取出冻存管并浸入液氮中， 可长期冻存。 0057 （2） 将冻存管从液氮中取出， 迅速放置在已经调节好温度 （40） 的水浴锅中， 融 化细胞的过程中应不断地摇晃冻存管， 使其快速均匀解冻， 直至完全融化。 将融化的细胞悬 液转移到 25cm2培养瓶离心管中， 向培养瓶中补齐 5mL 的完全培养液， 于 27， 5%CO2培养。 24h 后更换新的完全培养液， 继续培养。。

27、 0058 如图 9 所示， 对于大黄鱼脑细胞系冻存后复苏 24h 贴壁率达到 60%-80%， 与冻存前 的细胞形态无明显差异 ； 如图 10 所示冻存后复苏 72h 后细胞可长满培养瓶瓶底 ； 如图 11， 复苏后的大黄鱼脑细胞可以进行正常传代， 且与冻存前细胞以及冻存复苏后的细胞形态无 说 明 书 CN 104004706 A 6 5/6 页 7 差异。 0059 实施例 3 0060 实施例 1 的大黄鱼脑细胞系不同传代比例增殖曲线的影响及群体倍增时间分析 ： 0061 从实施例 1 所建立的大黄鱼脑细胞系中选取形态良好、 增殖旺盛的细胞， 消化传 代， 分别以 1:2、 1:3、 1。

28、:5 和 1:10 进行传代至 25cm2细胞培养瓶 （即向 4 个培养瓶分别加入 2.5mL， 1.6mL， 1mL， 0.5mL细胞悬液， 而后以培养液将各瓶溶液总量补齐至5mL） 。 从传代24h 起每隔 24h 拍照一次， 采用经典五点交叉取样法对培养细胞进行倒置显微拍摄统计视野观 测细胞数， 每组取 5 点观测细胞数总和作图分析。 0062 如图8所示， 对于大黄鱼脑细胞系， 1:3传代组和1:2传代组更具优势， 以过低的传 代比例会造成细胞增殖缓慢或者停滞。1:3 传代组和 1:2 传代组在第 2、 3 天就进入快速分 裂期。1:10 传代组的细胞增值几乎不增值。 0063 实施例。

29、 4 0064 实施例 1 的大黄鱼脑细胞系的染色体分析 ： 0065 取分裂旺盛取分裂旺盛的大黄鱼脑细胞， 接种至 75cm2细胞培养瓶， 待细胞增长 处于对数期， 加入终浓度为 20g/mL 的秋水仙碱， 继续培养 6-8h 后收集细胞得到细胞悬 液。将细胞悬液移至 15mL 离心管， 1000g 离心 10min， 轻轻吸出上清液， 加入 4mL3 KCl 低 渗 30min ； 加入 0.5mL 新鲜配置预冷的卡诺氏固定液预固定 10min， 2000g 离心 10min ； 取细 胞沉淀加入0.5mL卡诺氏固定液， 以移液枪重悬沉淀 ； 再加入1mL固定液 ； 30cm高度向玻璃 载。

30、玻片 ( 于 -20预处理 ) 滴片， 水平放置以使其彻底延展， 65干燥 ； 而后浸入含 Giemsa 染液工作液的染缸中染色 10min， 双蒸水冲洗以去除玻片表面渣滓， 干燥， 中性树脂封片， 1000 油镜观察计数。 0066 如图 12 和图 13 所示， 对大黄鱼细胞系的染色体分析显示大黄鱼细胞系的核型均 呈现近似正态分布 ： 51% 观测到的分裂相细胞染色体数目为 48 条 ； 染色体数目均分布在单 倍体与四倍体之间 (24-96 条 )。 0067 实施例 5 0068 实施例 1 的大黄鱼脑细胞系的饥饿处理 0069 取细胞覆盖率 80%-100% 的大黄鱼细胞， 用完全培养。

31、液换液， 于 27， 5%CO2 培养， 30d后发现培养液颜色由橙色变成浅黄色， 说明培养液中的营养物质被大量消耗。 显微镜下 观察大黄鱼脑细胞形态， 如图 14 所示， 可见由大量细胞解除贴壁而形成空洞状 ； 部分细胞 由于营养消耗细胞发生皱缩， 在显微镜下观察折光性增强 ； 细胞仍有较多细胞存活且形态 未发生变化。如图 15 所示， 当再次补给新鲜的完全培养液后， 存活下来的细胞可以再次增 值， 分裂仍然旺盛， 形态也未发生变化。 0070 实施例 6 0071 实施例 1 的大黄鱼脑细胞系转染 pEGFP-N1 质粒以及功能基因 oct4 0072 设计大黄鱼 oct4 基因的正反向引。

32、物， 扩增不含终止密码子的大黄鱼 oct4 基 因 的 orf。 正 向 引 物 oct4F ： TACGAGCTCGCCACCATGACGGAGAGACC 和 反 向 引 物 oct4R ： ACGGAATTCTTCCAGTCAGGTGACTAACC， 其中 GAGCTC 为 SacI 酶切位点， GCCACC 为增强表达的 Kozak 序列， GAATTC 为 EcoRI 酶切位点， T 为避免三联子移码突变的占位碱基。用 SacI 和 EcoRI内切酶对pEGFP-N1质粒进行双酶切， 并将扩增出的大黄鱼oct4基因的orf片段链接 说 明 书 CN 104004706 A 7 6/6 。

33、页 8 到真核表达质粒 pEGFP-N1 上， 成功构建出 oct4-pEGFP-N1 重组质粒。 0073 感受态细菌细胞制备 ： 采用大肠杆菌 DH5 菌种， 采用经典氯化钙法制备感受态 细胞， -80长期保存。 0074 质粒转化 ： 取1ng DNA溶液置于EP管中， 冰浴放置。 从-80冰箱取出100L感受 态细菌悬液， 迅速溶解， 加入 DNA 溶液中， 冰浴 10min。42， 水浴 2min。将 EP 管于 37 220 转培养 1h。而后将转化后的菌液涂布于含抗生素的 LB 固体培养平板上。 0075 质粒制备 ： 按照HiPure Plasmid MaxiPrep Kit质。

34、粒大提试剂盒 （TransGene公司） 说明书提取 pEGFP-N1 质粒和 oct4-pEGFP-N1 重组质粒， -20保存。 0076 转染细胞 ： 取旺盛生长的大黄鱼脑细胞系细胞， 以1:2接种于12孔板， 27， 5%CO2 培养。待细胞覆盖率至 70%80% 后， 按照 sofast 转染试剂 （购自太阳马公司） 说明书进行 操作。27， 5%CO2培养， 24h 以后检测荧光表达。 0077 利用梭华Sofast 介导质粒 DNA 转染大黄鱼脑细胞系 24h 后， 于荧光显微镜下镜 检能够检测到绿色荧光， 即如图 16 和图 17 所示， pEGFP-N1 质粒以及大黄鱼功能基。

35、因 oct4 在该细胞系中有表达。转染 36h 后， 仍能观察到绿色荧光。说明建立的大黄鱼脑细胞系可 以适应外源基因的转染实验。 0078 以上所述， 仅为本发明的较佳实施例而已， 故不能依此限定本发明实施的范围， 即 依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰， 皆应仍属本发明涵盖的范围内。 说 明 书 CN 104004706 A 8 1/9 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104004706 A 9 2/9 页 10 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 104004706 A 10 3/9 页 11 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 104004706 A 11 4/9 页 12 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 104004706 A 12 5/9 页 13 图 9 图 10 说 明 书 附 图 CN 104004706 A 13 6/9 页 14 图 11 图 12 说 明 书 附 图 CN 104004706 A 14 7/9 页 15 图 13 图 14 说 明 书 附 图 CN 104004706 A 15 8/9 页 16 图 15 图 16 说 明 书 附 图 CN 104004706 A 16 9/9 页 17 图 17 说 明 书 附 图 CN 104004706 A 17 。