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1、(10)申请公布号 CN 104177240 A (43)申请公布日 2014.12.03 CN 104177240 A (21)申请号 201310204312.X (22)申请日 2013.05.28 C07C 49/753(2006.01) C07C 69/18(2006.01) A61K 31/122(2006.01) A61K 31/22(2006.01) A61K 36/06(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 曾卉菱 地址 中国台湾台北市 (72)发明人 曾卉菱 张温良 姚振文 严逸钊 曾宛平 曾泰霖 郭盈妤 (74)专利代理机构 北京银龙知。
2、识产权代理有限 公司 11243 代理人 许静 安利霞 (54) 发明名称 分离自牛樟芝的化合物、 萃取物及其用途 (57) 摘要 本发明揭露一种分离自牛樟芝的化合物， 以 式 I 表示 ：其 中R1为氢或乙酰基。 更揭露一种将该化合物用于 制备抑制肿瘤生长药物的用途， 其中该肿瘤为肺 腺癌、 结肠癌、 前列腺癌、 及肝癌其中之一。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 附图6页 (10)申请公布号 CN 104177240 A CN 104177240 A 1/1 页 。
3、2 1. 一种分离自牛樟芝的化合物， 以式 I 表示 ： 其中 R1 为氢或乙酰基。 2. 如申请专利范围第 1 项所述的化合物， 其中该化合物的 R1 为氢， 以式 (II) 表示 ： 3. 如申请专利范围第 1 项所述的化合物， 其中该化合物的 R1 为乙酰基， 以式 (III) 表 示 ： 4. 一种将如申请专利范围第 1 项所述的化合物用于制备抑制肿瘤生长药物的用途， 其 中该肿瘤为肺腺癌、 结肠癌、 前列腺癌、 及肝癌其中之一。 5. 一种萃取自牛樟芝的萃取物， 该萃取物以下列步骤进行萃取而得 ： 取牛樟芝菌丝 体、 子实体或二者的混合物以 10 倍量的酒精抽取 2 次后合并浓缩得到。
4、一粗抽物， 将该粗抽 物以二氯甲烷 / 水 (1:1) 进行分配萃取法 3 次， 以分为一二氯甲烷层及一水层， 取该二氯甲 烷层以硅胶柱层析法经过正己烷/二氯甲烷(1:4)、 二氯甲烷、 甲醇/二氯甲烷(5:95)的溶 媒分离得到该萃取物。 6. 一种将如申请专利范围第 5 项所述的萃取物用于制备抑制肿瘤生长药物的用途， 其 中该肿瘤为肺腺癌、 结肠癌、 前列腺癌、 及肝癌其中之一。 权 利 要 求 书 CN 104177240 A 2 1/7 页 3 分离自牛樟芝的化合物、 萃取物及其用途 技术领域 0001 本发明是关于一种分离自牛樟芝的化合物、 萃取物及其用途， 特别是关于将该化 合物及。
5、萃取物应用于抑制肿瘤生长的用途。 背景技术 0002 牛樟芝 (Antrodia camphorata)， 又称樟芝、 牛樟菇或红樟芝等， 属于非褶菌目 (Aphyllophorales)、 多孔菌科 (Polyporaceae) 的多年生蕈菌类， 为台湾特有种真菌， 仅生 长于台湾保育类树种 - 牛樟树 （Cinnamoum kanehirai Hay） 的中空腐朽心材内壁上。由于 牛樟树分布数量极为稀少， 加上人为的盗伐， 使得寄生于其中方能生长的野生牛樟芝数量 更形稀少， 且由于其子实体生长相当缓慢， 生长期亦仅在六月至十月之间， 因此价格非常昂 贵。 0003 牛樟芝的子实体为多年生，。
6、 无柄， 呈木栓质至木质， 其具强烈的樟树香气， 且形态 多变化， 有板状、 钟状、 马蹄状或塔状。 初生时为扁平型并呈鲜红色， 之后其周边会呈现放射 反卷状， 并向四周扩展生长， 颜色亦转变为淡红褐色或淡黄褐色， 并有许多细孔， 且其为牛 樟芝的药用价值最丰富的部位。 0004 在台湾民俗医学上， 牛樟芝具有解毒、 减轻腹泻症状、 消炎、 治疗肝脏相关疾病及 抗癌等功用。牛樟芝如同一般食药用的蕈菇类， 具有许多复杂的成分， 已知的生理活性成 分中， 包括 ： 三萜类化合物 （triterpenoids） 、 多醣体 （polysaccharides， 如 -D- 葡聚醣） 、 腺苷 (ade。
7、nosine） 、 维生素 ( 如维生素 B、 烟碱酸 )、 蛋白质 （含免疫球蛋白） 、 超氧歧化酵素 （superoxide dismutase,SOD） 、 微量元素 ( 如 ： 钙、 磷、 锗 )、 核酸、 固醇类以及血压稳定物质 ( 如 antodia acid) 等， 此些生理活性成分被认为具有抗肿瘤、 增加免疫能力、 抗过敏、 抗病 菌、 抗高血压、 降血糖及降胆固醇等多种功效。 0005 牛樟芝众多成分中以三萜类化合物被研究的最多， 三萜类化合物是由三十个 碳元素结合成六角形或五角形天然化合物的总称， 牛樟芝所具的苦味即主要来自三萜 类此成分。1995 年时， Cherng 等。
8、人发现牛樟芝子实体萃取物中含有三种新的以麦角甾 烷 （ergostane）为骨架的三萜类化合物 ： antcin A、 antcin B 与 antcin C（Cherng,I. H.,and Chiang,H.C.1995.Three new triterpenoids fromAntrodia cinnamomea.J.Nat. Prod.58:365-371） 。Chen 等人以乙醇萃取樟芝子实体后发现 zhankuic acid A、 zhankuic acid B 及 zhankuic acid C 等三种三萜类化合物 （Chen,C.H.,and Yang,S.W.1995.New。
9、 steroid acids from Antrodiacinnamomea, a fungus parasitic on Cinnamomum micranthum.J.Nat.Prod.58:1655-1661） 。此外， Chiang 等人于 1995 年也由子实体萃 取物中发现另外三种分别为倍半萜内酯 （sesquiterpene lactone）与两种双酚类衍生 物的新三萜类化合物， 此即 antrocin,4,7- 二甲氧基 -5- 甲基 -1,3- 苯并二氧环 （4,7-d imethoxy-5-methy-1,3-benzodioxole）与 2,2,5,5- 四甲氧基 -3,。
10、4,3,4- 双 - 亚甲 二 氧 基 -6,6- 二 甲 基 联 苯 （2,2,5,5-teramethoxy-3,4,3,4-bi-methylenedioxy- 6,6-dimethylbiphenyl） (Chiang,H.C.,Wu,D.P.,Cherng,I.W.,and Ueng,C.H.1995.A 说 明 书 CN 104177240 A 3 2/7 页 4 sesquiterpene lactone,phenyl and biphenyl compoundsfrom Antrodia cinnamomea. Phytochemistry.39:613-616)。到了 199。
11、6 年， Cherng 等人以同样分析方法再度发现四 种新的三萜类化合物 ： antcin E、 antcin F、 methyl antcinate G、 methyl antcinate H（Cherng,I.H.,Wu,D.P.,and Chiang,H.C.1996.Triteroenoids from Antrodia cinnamomea.Phytochemistry.41:263-267） ; 而 Yang 等人则发现了二种以麦角甾烷为骨 架的新化合物 zhankuic acid D、 zhankuic acid E， 和三种以羊毛甾烷 （lanostane） 为 骨架的新化合物。
12、 ： 15 乙酰 - 去氢硫色多孔菌酸 （15-acetyl-dehydrosulphurenic acid） 、 去氢齿孔酸 （dehydroeburicoic acid） 与去水硫色多孔菌酸 （dehydrasulphurenic acid） （Yang,S.W.,Shen,Y.C.,and Chen,C.H.1996.Steroids and triterpenoids of Antrodiacinnamomea a fungus parasitic on Cinnamomum micranthum. Phytochemistry.41:1389-1392） 。其中， 某些成分陆续被发现。
13、可能对于 AMPK 及 TOR 讯息传 递路径扮演重要角色， 透过AMPK的活化及对mTOR转译路径的抑制， 达到对癌细胞周期中G1 期的良好控制， 完全阻断癌细胞周期的进展， 造成一连串的癌细胞雕亡。 0006 虽然由目前诸多的实验可得知牛樟芝萃取物具有前述功效， 且其所含成分亦陆续 被分析出， 但牛樟芝萃取物中是否仍有其他具抗癌活性或其他医疗用途的化合物未被找出 来， 仍有待进一步实验研究来厘清。 发明内容 0007 据此， 本发明之一目的在提供一种分离自牛樟芝的化合物， 以式 I 表示 ： 0008 0009 其中 R1 为氢或乙酰基。 0010 较佳地， 该化合物的 R1 为氢， 以式。
14、 (II) 表示 ： 0011 0012 较佳地， 其中该化合物的 R1 为乙酰基， 以式 (III) 表示 ： 0013 说 明 书 CN 104177240 A 4 3/7 页 5 0014 本发明的又一目的在于提供一种将上述化合物用于制备抑制肿瘤生长药物的用 途， 其中该肿瘤为肺腺癌、 结肠癌、 前列腺癌、 及肝癌其中之一。 0015 本发明的另一目的在于提供一种萃取自牛樟芝的萃取物， 该萃取物以下列步骤进 行萃取而得 ： 取牛樟芝菌丝体、 子实体或二者的混合物以 10 倍量的酒精抽取 2 次后合并浓 缩得到一粗抽物， 将该粗抽物以二氯甲烷 / 水 (1:1) 进行分配萃取法 3 次， 。
15、以分为一二氯甲 烷层及一水层， 取该二氯甲烷层以硅胶柱层析法经过正己烷 / 二氯甲烷 (1:4)、 二氯甲烷、 甲醇 / 二氯甲烷 (5:95) 的溶媒分离得到该萃取物。 附图说明 0016 图 1- 图 3 为本发明实施例提供的 Antrocamol LT1 的结构鉴定 ； 0017 图 4- 图 6 为本发明实施例提供的 Antrocamol LT2 的结构鉴定。 具体实施方式 0018 取牛樟芝 （Antrodia camphorata） 菌丝体、 子实体或二者的混合物 (1.0kg) 以 10 倍量的酒精抽取 2 次后， 合并浓缩可得粗抽物约 230g(LT-E)， 粗抽物以二氯甲烷 。
16、/ 水 (1:1) 进行分配萃取法 3 次， 分为二氯甲烷层约 102.6g(LT-E-D) 及水层约 127.4g(LT-E-W)， 取二 氯甲烷层 6.0g 以硅胶柱层析法经过正己烷 / 二氯甲烷 (1:4)、 二氯甲烷、 甲醇 / 二氯甲烷 (5:95) 的溶媒分离， 分为 ANCA-E-D-1、 ANCA-E-D-2、 ANCA-E-D-3、 ANCA-E-D-4 等四层。 0019 牛樟芝萃取物的抗癌活性 0020 分别针对 A549 细胞株 ( 肺腺癌 )、 CT26 细胞株 ( 结肠癌 )、 DU145 细胞株 ( 前列腺 癌 )、 HepG2 细胞株 ( 肝癌 )、 MDCK 。
17、细胞株 ( 肾癌 )、 PC3 细胞株 ( 前列腺癌 ) 进行细胞存活 检测 （MTT cell viability assay） ， 结果参阅如下列表 1 6。 0021 将上述细胞株分别于适当的培养液中培养24小时。 将增生后的细胞以PBS清洗一 次， 并以 1 倍的胰蛋白酶 -EDTA 处理细胞， 随后于 1,200rpm 下离心 5 分钟， 将细胞沈淀并丢 弃上清液。之后加入 10ml 的新培养液， 轻微摇晃使细胞再次悬浮， 再将细胞分置于 96 孔微 量盘内。测试时， 分别于每一孔内加入 0.01 200g/ml 的牛樟芝萃取物， 于 37、 5%CO2 下培养 48 小时。其后， 。
18、于避光的环境下于每一孔内加入 2.5mg/ml 的 MTT， 反应 4 小时后再 于每一孔内加入 100l 的 lysis buffer 终止反应。最后以酵素免疫分析仪在 570nm 吸 光波长下测定其吸光值， 藉以计算细胞的存活率， 并推算出其生长半抑制率所需浓度 ( 即 IC50 值 ) 所有实验资料均以平均值 标准误差表示。实验资料以配对 t 考验 (paired-t test) 进行统计分析。以 p 值小于 0.05 视为具有统计学上差异。 0022 说 明 书 CN 104177240 A 5 4/7 页 6 0023 表 1 ： A549 细胞株 ( 肺腺癌 ) 0024 0025。
19、 表 3 ： DU145 细胞株 ( 前列腺癌 ) 0026 说 明 书 CN 104177240 A 6 5/7 页 7 0027 表 4 ： HepG2 细胞株 ( 肝癌 ) 0028 0029 表 5 ： MDCK 细胞株 ( 肾癌 ) 0030 0031 表 6 ： PC3 细胞株 ( 前列腺癌 ) 0032 在表 1 6 中， 0 25% 细胞存活 :+/-， 25 50% 细胞存活 :+， 50 75% 细胞存 活:+， 75100%细胞存活:+， 100%细胞存活:+。 溶剂为DMSO， 其IC50为2.34%， 意 谓当药物稀释至DMSO含量为2.34%时， 会造成细胞50%死。
20、亡， 此处当药物稀释至100g/ml 的 DMSO 含量为 0.5%。ANCA-E、 ANCA-E-D、 ANCA-E-W、 ANCA-E-D-1、 ANCA-E-D-2、 ANCA-E-D-3、 说 明 书 CN 104177240 A 7 6/7 页 8 ANCA-E-D-4、 LT-80 及 LT-C80 分别为不同的牛樟芝萃取物。 0033 依据上列各表结果显示， 其中的 ANCA-E-D-2、 ANCA-E-D-3、 ANCA-E-D-4 对于各种 不同的癌细胞生长具有较佳的抑制效果。 例如， 其中的ANCA-E-D-2及ANCA-E-D-3对于A549 细胞株 ( 肺腺癌 )、 C。
21、T26 细胞株 ( 结肠癌 )、 DU145 细胞株 ( 前列腺癌 )、 HepG2 细胞株 ( 肝 癌 )、 MDCK 细胞株 ( 肾癌 )、 PC3 细胞株 ( 前列腺癌 )， 相比于相对其他组别而言， 具有相对 较佳的抑制效果。而 ANCA-E-D-4 虽然略低于 ANCA-E-D-2 及 ANCA-E-D-3， 但对于各种肿瘤 细胞亦有一定的抑制效果。 据此， 可将该等萃取物用于制备抑制肿瘤生长药物的用途， 包括 肺腺癌、 结肠癌、 前列腺癌、 及肝癌其中之一， 并可进一步纯化其中的有效单一成分。 0034 自牛樟芝萃取制备 Antrocamol LT1 及 Antrocamol LT。
22、2 0035 依据上述结果， 将 ANCA-E-D-2 及 ANCA-E-D-3 进一步进行纯化， 将 ANCA-E-D-3 层 经制备型逆相柱层析法 (C-18 逆相层析管柱 ) 以 80%MeOH/H20 在 18.75 分钟附近可得一 新化合物 Antrocamol LT1 约 150mg， 而 LT-E-D-2 层经制备型逆相柱层析法 (C-18 逆相层 析管柱 ) 以 80%MeOH/H20 在 25.10 分钟附近可得另一新化合物 Antrocamol LT2 约 170mg。 Antrocamol LT1 的结构鉴定结果如下 ： 0036 Antrocamol LT1 为无色的液。
23、体产物， 经分析该化合物的分子式为 C24H38O5， 分子 量为 406， 完整中文英名称为 4- 羟基 -2,3- 二甲氧基 -6- 甲基 -5- （9- 羟基 -3,7,11- 三甲 基 -2,6,10- 十二碳三烯） -2- 环己烯酮、 4-hydroxy-5-9-hydroxy-3,7,11-trimethyldode ca-2,6,10-trienyl-2,3-dimethoxy-6-methyl-cyclohex-2-enone。 0037 LT1 结构鉴定资料 ( 参阅附图 1- 图 3) ： 1H-NMR(400MHz,CDCl3): 1.12(3H,d,J= 7.2Hz,)。
24、,1.61(3H,s),1.64(3H,s),1.66(3H,s),1.68(3H,s),1.72(1H,m),1.982.30(8H), 2.51(1H,dq,J=11.6,7.2Hz),3.62(3H,s),4.02(3H,s),4.33(1H,d,J=2.8Hz),4.35(1H,dt, J=9.2,4.0Hz),5.09(1H,d,J=8.4Hz),5.14(1H,t,J=7.2Hz),5.15(1H,t,J=7.2Hz);13C-NMR( 100MHz,CDCl3):12.17(q),15.95(q),16.19(q),18.13(q),25.72(q),25.93(t),26.78。
25、(t ),39.41(t),39.98(d),43.29(d),47.94(t),58.81(q),60.48(q),65.35(d),67.24(d),121 .64(d),127.64(d),128.42(d),132.03(s),134.99(s),135.97(s),137.42(s),160.82(s), 197.15(s)。 0038 Antrocamol LT2( 参阅附图 4- 图 6): 为无色的液体产物， 经分析该化合物的分 子式为 C26H40O6; 分子量为 448， 完整中文英名称为 4- 乙酰羧基 -2,3- 二甲氧基 -6- 甲 基 -5-（9- 羟基 -3,7,。
26、11- 三甲基 -2,6,10- 十二碳三烯） -2- 环己烯酮、 4-acetoxy-5-9-h ydroxy-3,7,11-trimethyldodeca-2,6,10-trienyl-2,3-dimethoxy-6-methyl-cyclohex -2-enone。 0039 LT2 结构鉴定资料 ： 1H-NMR(400MHz,CDCl3): 1.18(3H,d,J=7.2Hz,),1.54(3H,s ),1.64(3H,s),1.67(3H,s),1.69(3H,s),1.72(1H,m),1.802.40(8H),2.50(1H,dq,J=11.6 ,7.2Hz),3.65(3H,。
27、s),3.98(3H,s),4.36(1H,m),5.10(1H,t,J=6.8Hz),5.12(1H,d,J=8.0Hz ),5.20(1H,t,J=6.4Hz),5.72(1H,t,J=3.2Hz);13C-NMR(100MHz,CDCl3):12.80(q),15.96 (q),16.09(q),18.14(q),20.93(q),25.72(q),26.19(t),26.76(t),39.47(t),41.25(d),4 2.98(d),48.12(t),59.65(q),60.67(q),65.53(d),68.98(d),120.74(d),127.42(d),128. 25(d)。
28、,131.74(s),134.70(s),137.31(s),137.56(s),158.21(s),169.73(s),196.84(s)。 0040 依前述实验方法进行 MTT assay( 在此不再重复 )， 利用分析仪在 570nm 吸光波 说 明 书 CN 104177240 A 8 7/7 页 9 长下测定其吸光值， 藉以计算细胞的存活率， 并推算出其生长半抑制率所需浓度 ( 即 IC50 值 )， 测试 Antrocamol LT1 及 Antrocamol LT2 的抗癌活性， 并与 ANCA-E、 ANCA-E-D 及 ANCA-E-D-3 作比较。所有实验资料均以平均值 标。
29、准误差表示。实验资料以配对 t 考验 (paired-t test) 进行统计分析。以 p 值小于 0.05 视为具有统计学上差异。并将其半抑制 浓度 (IC50) 整理为下表 ( 表 7)。 0041 0042 0043 表 7 0044 IC50 是指被抑制一半时抑制剂的浓度。IC50 值通常用来衡量药物诱导细胞雕 亡的能力， 即诱导能力越强， 数值越低。由表中结果可看出， 新化合物 Antrocamol LT1 及 Antrocamol LT2与ANCA-E、 ANCA-E-D及ANCA-E-D-3等萃取物， 均具有颇佳的抗癌活性。 据 此， 可将该等化合物用于制备抑制肿瘤生长药物的用途。
30、， 包括肺腺癌、 结肠癌、 前列腺癌、 及 肝癌其中之一， 并可进一步发展为抗癌药物。 0045 本发明所提供的分离自牛樟芝的化合物、 萃取物及其用途确具产业上的利用价 值， 惟以上的叙述仅为本发明的较佳实施例说明， 凡精于此项技艺者当可依据上述的说明 而作其它种种的改良， 惟这些改变仍属于本发明的精神及以下所界定的专利范围中。 说 明 书 CN 104177240 A 9 1/6 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 104177240 A 10 2/6 页 11 图 2 说 明 书 附 图 CN 104177240 A 11 3/6 页 12 图 3 说 明 书 附 图 CN 104177240 A 12 4/6 页 13 图 4 说 明 书 附 图 CN 104177240 A 13 5/6 页 14 图 5 说 明 书 附 图 CN 104177240 A 14 6/6 页 15 图 6 说 明 书 附 图 CN 104177240 A 15 。