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1、(10)申请公布号 CN 104177475 A (43)申请公布日 2014.12.03 CN 104177475 A (21)申请号 201410416308.4 (22)申请日 2014.08.21 C07K 7/06(2006.01) C07K 1/16(2006.01) C07K 1/06(2006.01) C07K 1/04(2006.01) (71)申请人 南京医科大学 地址 210029 江苏省南京市鼓楼区汉中路 140 号 (72)发明人 朱云霞 王富强 王丁俐 吴智鹏 (74)专利代理机构 安徽省合肥新安专利代理有 限责任公司 34101 代理人 汪祥虬 (54) 发明名称。
2、 一种 19F 核磁共振探针及其制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种 19F 核磁共振探针及其制 备方法， 特征是采用固相合成法将两个肽段分别 合成出来， 得到具有第一类特征结构()的第一 种化合物X1和第二种化合物X2能够被弗林蛋白酶 特异性识别剪切发生自组装缩合反应 ； 具有第二 类特征结构 ( ) 的第三种化合物 Y1和第四种化 合物Y2不能被酶识别不能发生自组装反应的对照 化合物 ； 第二种化合物 X2和第四种化合物 Y2中含 有 19F 原子， 可用来做体外验证实验和细胞摄取实 验。 本发明的探针是小分子， 亲水性好， 制备容易 ； 该探针的前体小分子有弗林蛋白酶特异性识别的 。
3、肽段可主动靶向所需检测的酶， 实现在体外和活 体细胞内控制性自组装含 19F 原子的纳米结构， 研 究肿瘤细胞内弗林蛋白酶的活性。 (51)Int.Cl. 权利要求书 3 页 说明书 9 页 附图 8 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书3页 说明书9页 附图8页 (10)申请公布号 CN 104177475 A CN 104177475 A 1/3 页 2 1. 一种 19F 核磁共振探针的制备方法， 其特征在于 ： 第一步、 先采用固相合成方法分别合成两段肽链， 过程如下， 按 ： 将 1 毫摩尔 2- 氯三苯 甲基氯树脂在 4-6 毫升 N， N- 。
4、二甲基甲酰胺里溶胀 4-8 分钟后， 加入 2 毫摩尔第一个氨基酸 赖氨酸， 再加入 2 毫摩尔 N， N- 二异丙基乙胺， 反应 2-3 小时后， 用 100 微升甲醇反应 10-20 分钟， 切去赖氨酸的保护基， 加入活化的 1.6 毫摩尔第二个氨基酸半胱氨酸反应 2-3 小时， 切去半胱氨酸的保护基， 加入活化的1.6毫摩尔第三个氨基酸精氨酸反应2-3小时， 切去精 氨酸的保护基， 加入活化的1.6毫摩尔第四个氨基酸精氨酸反应2-3小时， 切去精氨酸的保 护基， 加入活化的 1.6 毫摩尔第五个氨基酸缬氨酸反应 2-3 小时， 切去缬氨酸的保护基， 再 加入活化的 1.6 毫摩尔第六个氨。
5、基酸精氨酸反应 3-4 小时， 切去最后一个氨基酸精氨酸的 保护基， 加 2-3 毫摩尔醋酐反应 20-30 分钟， 最后用含体积浓度为 1的三氟乙酸的二氯甲 烷从该树脂上切下上述合成的肽段， 用乙醚层出冷冻离心倾去上层乙醚， 待溶剂挥发干之 后所得到的白色固体粉末即是赖氨酸-半胱氨酸-精氨酸-精氨酸-缬氨酸-精氨酸肽段 ； 再将 1 毫摩尔 2- 氯三苯甲基氯树脂在 4-6 毫升 N， N- 二甲基甲酰胺里溶胀 4-8 分钟后， 加 入 2 毫摩尔第一个氨基酸缬氨酸， 再加入 2 毫摩尔 N， N- 二异丙基乙胺， 反应 2-3 小时后， 用 100 微升甲醇反应 10-20 分钟， 切去缬。
6、氨酸的保护基， 加入活化的 1.6 毫摩尔第二个氨基 酸精氨酸反应2-3小时， 切去精氨酸的保护基， 加入活化的1.6毫摩尔第三个氨基酸半胱氨 酸反应2-3小时， 切去半胱氨酸的保护基， 加入活化的1.6毫摩尔第四个氨基酸精氨酸反应 2-3小时， 切去精氨酸的保护基， 加入活化的1.6毫摩尔第五个氨基酸赖氨酸反应2-3小时， 切去赖氨酸的保护基， 再加入活化的1.6毫摩尔第六个氨基酸精氨酸反应3-4小时， 切去最 后一个氨基酸精氨酸的保护基， 加 2-3 毫摩尔醋酐反应 20-30 分钟， 最后用体积浓度为 1 的三氟乙酸的二氯甲烷溶液从该树脂上切下上述合成的肽段， 采用乙醚层出冷冻离心倾去 。
7、上层乙醚， 待溶剂挥发干之后所得到的白色固体粉末即是缬氨酸 - 精氨酸 - 半胱氨酸 - 精 氨酸 - 赖氨酸 - 精氨酸肽段 ； 第二步、 将上述合成的赖氨酸 - 半胱氨酸 - 精氨酸 - 精氨酸 - 缬氨酸 - 精氨酸肽段 取 0.1 毫摩尔溶于 2 毫升四氢呋喃溶剂中， 加入 0.15 毫摩尔 N- 甲基吗啡， 冷却至零度时 加入 0.12 毫摩尔氯甲酸异丁酯， 活化半小时后， 加入 0.12 毫摩尔 2- 氨基 -6- 氰基苯并噻 唑， 保持温度在 0一个小时， 室温搅拌反应过夜， 经过高效液相色谱分离提纯， 收集在紫外 320 纳米处有强吸收的组分， 即为第一类初产物 ； 再将上述合。
8、成的缬氨酸 - 精氨酸 - 半胱氨 酸 - 精氨酸 - 赖氨酸 - 精氨酸肽段取 0.1 毫摩尔溶于 2 毫升四氢呋喃溶剂中， 加入 0.15 毫 摩尔 N- 甲基吗啡， 冷却至零度时加入 0.12 毫摩尔氯甲酸异丁酯， 活化半小时后， 加入 0.12 毫摩尔 2- 氨基 -6- 氰基苯并噻唑， 保持温度在 0一个小时， 室温搅拌反应过夜， 经过高效 液相色谱分离提纯， 收集在紫外 320 纳米处有强吸收的组分， 即为第二类初产物 ； 第三步、 先将上述制备的第一类初产物溶解在 5 毫升体积浓度为 95的三氟乙酸的二 氯甲烷溶液中搅拌反应2小时， 经过高效液相色谱分离提纯， 收集在紫外320纳。
9、米处有强吸 收组分即为终产物第一种化合物 X1； 再将第二类初产物溶解在 5 毫升体积浓度为 95的三 氟乙酸的二氯甲烷溶液中搅拌反应2小时， 经过高效液相色谱分离提纯， 收集在紫外320纳 米处有强吸收组分即为终产物第三种化合物 Y1； 第四步、 将 1 毫摩尔终产物第一种化合物 X1溶解在 2 毫升 N， N- 二甲基甲酰胺中， 加入 1 毫摩尔 1- 羟基苯并三唑， 1 毫摩尔苯并三氮唑 -N,N,N,N- 四甲基脲六氟磷酸盐， 2 毫摩 权 利 要 求 书 CN 104177475 A 2 2/3 页 3 尔 N， N- 二异丙基乙胺以及 1.5 毫摩尔 3,5- 双 ( 三氟甲基 )。
10、 苯甲酸， 室温下搅拌反应过夜， 经过高效液相色谱分离提纯， 收集在紫外 320 纳米处有强吸收组分即为终产物第二种化合 物 X2； 再将 1 毫摩尔终产物第三种化合物 Y1溶解在 2 毫升 N， N- 二甲基甲酰胺中， 加入 1 毫 摩尔 1- 羟基苯并三唑， 1 毫摩尔苯并三氮唑 -N,N,N,N- 四甲基脲六氟磷酸盐， 2 毫摩尔 N， N- 二异丙基乙胺以及 1.5 毫摩尔 3,5- 双 ( 三氟甲基 ) 苯甲酸， 室温下搅拌反应过夜， 经 过高效液相色谱分离提纯， 收集在紫外 320 纳米处有强吸收组分即为终产物第四种化合物 Y2； 其中固相所用的氨基酸都是以 9- 芴甲氧羰基作为 。
11、- 氨基保护基， 赖氨 酸的侧链氨基保护基为叔丁氧羰基， 半胱氨酸的巯基由叔丁硫基保护， 精氨酸侧链氨基由 保护 ； 其中活化氨基酸的试剂是与氨基酸同物质的量的 1- 羟基苯并三唑 和苯并三氮唑 -N,N,N,N- 四甲基脲六氟磷酸盐 ； 在每接上一个氨基酸和切去保护基时， 都要用凯撒测试试剂检测亚氨基存在与否 ： 若阳性显蓝色， 即表明保护基团已剪切完 ； 若 阴性显黄色， 则表明氨基酸已接上。 2. 权利要求 1 所述方法制备的 19F 核磁共振探针， 特征在于其为具有第一类特征结构 ( ) 或第二类特征结构 ( ) 的以下四种化合物 ： 权 利 要 求 书 CN 104177475 A 。
12、3 3/3 页 4 上面结构式中的基团 R1选自 H 或R2选自 H 或 即， 其中具有第一类特征结构 ( ) 的化合物为 ： 第一种化合物 X1： 其结构式中的基团 R1为 H ； 第二种化合物 X2： 其结构式中的基团 R1为 具有第二类特征结构 ( ) 的化合物为 ： 第三种化合物 Y1： 其结构式中的基团 R3为 H ； 第四种化合物 Y2： 其结构式中的基团 R3为 所述具有第一类特征结构 ( ) 的第一种化合物 X1和第二种化合物 X2是可以被酶特 异性识别剪切发生自组装缩合反应的化合物， 所述具有第二类特征结构 ( ) 的第三种化 合物Y1和第四种化合物Y2是不能被酶识别从而也不。
13、能发生自组装反应的对照化合物 ； 第二 种化合物 X2和第四种化合物 Y2含有 19F 原子， 用来做体外验证实验和细胞摄取实验。 权 利 要 求 书 CN 104177475 A 4 1/9 页 5 一种 19F 核磁共振探针及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于纳米探针技术领域， 具体涉及用于体外和活细胞内弗林蛋白酶活性检 测的 19F 核磁共振探针及其制备方法。 背景技术 0002 英国 自然杂志化学子刊 (Nat.Chem.， 2009， Vol.1(7),P.557) 公开了一种利 用 19F 核磁共振信号的出现 / 消失来检测和显像蛋白质的自组装19F 核磁共振纳米探针及 其。
14、制备方法。这种探针自组装后 19F 核磁共振信号消失， 而结合靶蛋白后解组装又使得19F 核磁共振信号恢复。虽然该探针能够检测某些特定的蛋白， 但要求靶蛋白与小分子配体能 够特异性结合， 这就限制了该探针的应用。英国 自然 杂志化学子刊 (Nat.Chem.， 2010， Vol.2(3),P.54) 报道了关于氰基 - 半胱氨酸缩合反应的研究与应用， 依据此反应平台， 目 前已有中国专利申请号为 201210342504.2 的 一类磁共振成像显像剂和双光子成像显像 剂及其制备方法 以及申请号为 201210164547.6 的 一种单光子发射计算机断层成像显像 剂及其制备方法 ， 它们与 。
15、19F 核磁共振属于完全不同的成像领域。但由于生物体背景中存 在大量的水质子， 所以申请号 201210342504.2 中的显像剂具有对比度 - 噪声比低的缺陷， 且其使用的显像剂为金属钆的螯合物， 具有一定的生物毒性。而申请号 201210164547.6 中 使用的显像剂为具有放射性的碘元素， 也会对生物体造成伤害。 发明内容 0003 本发明的目的是提出一种 19F 核磁共振探针及其制备方法， 以获得能实时控制性 自组装的 19F 纳米探针， 用于体外和活细胞内弗林蛋白酶活性检测， 克服传统探针制备难 度高， 细胞摄取率低等缺点， 可用于研究肿瘤细胞内弗林蛋白酶的活性， 从而能够实施非。
16、侵 入、 直观、 快速地进行疾病的早期诊断。 0004 本发明的 19F 核磁共振探针的制备方法， 其特征在于 ： 0005 第一步、 先采用固相合成方法分别合成两段肽链， 过程如下， 按 ： 将 1 毫摩尔 2- 氯 三苯甲基氯树脂在 4-6 毫升 N， N- 二甲基甲酰胺里溶胀 4-8 分钟后， 加入 2 毫摩尔第一个氨 基酸赖氨酸， 再加入 2 毫摩尔 N， N- 二异丙基乙胺， 反应 2-3 小时后， 用 100 微升甲醇反应 10-20 分钟， 切去赖氨酸的保护基， 加入活化的 1.6 毫摩尔第二个氨基酸半胱氨酸反应 2-3 小时， 切去半胱氨酸的保护基， 加入活化的 1.6 毫摩尔。
17、第三个氨基酸精氨酸反应 2-3 小时， 切去精氨酸的保护基， 加入活化的1.6毫摩尔第四个氨基酸精氨酸反应2-3小时， 切去精氨 酸的保护基， 加入活化的1.6毫摩尔第五个氨基酸缬氨酸反应2-3小时， 切去缬氨酸的保护 基， 再加入活化的1.6毫摩尔第六个氨基酸精氨酸反应3-4小时， 切去最后一个氨基酸精氨 酸的保护基， 加 2-3 毫摩尔醋酐反应 20-30 分钟， 最后用含体积浓度为 1的三氟乙酸的二 氯甲烷从该树脂上切下上述合成的肽段， 用乙醚层出冷冻离心倾去上层乙醚， 待溶剂挥发 干之后所得到的白色固体粉末即是赖氨酸 - 半胱氨酸 - 精氨酸 - 精氨酸 - 缬氨酸 - 精氨酸 肽段 。
18、； 再将 1 毫摩尔 2- 氯三苯甲基氯树脂在 4-6 毫升 N， N- 二甲基甲酰胺里溶胀 4-8 分钟 说 明 书 CN 104177475 A 5 2/9 页 6 后， 加入 2 毫摩尔第一个氨基酸缬氨酸， 再加入 2 毫摩尔 N， N- 二异丙基乙胺， 反应 2-3 小时 后， 用 100 微升甲醇反应 10-20 分钟， 切去缬氨酸的保护基， 加入活化的 1.6 毫摩尔第二个 氨基酸精氨酸反应2-3小时， 切去精氨酸的保护基， 加入活化的1.6毫摩尔第三个氨基酸半 胱氨酸反应2-3小时， 切去半胱氨酸的保护基， 加入活化的1.6毫摩尔第四个氨基酸精氨酸 反应 2-3 小时， 切去精氨。
19、酸的保护基， 加入活化的 1.6 毫摩尔第五个氨基酸赖氨酸反应 2-3 小时， 切去赖氨酸的保护基， 再加入活化的 1.6 毫摩尔第六个氨基酸精氨酸反应 3-4 小时， 切去最后一个氨基酸精氨酸的保护基， 加2-3毫摩尔醋酐反应20-30分钟， 最后用体积浓度 为 1的三氟乙酸的二氯甲烷溶液从该树脂上切下上述合成的肽段， 采用乙醚层出冷冻离 心倾去上层乙醚， 待溶剂挥发干之后所得到的白色固体粉末即是缬氨酸 - 精氨酸 - 半胱氨 酸 - 精氨酸 - 赖氨酸 - 精氨酸肽段 ； 0006 第二步、 将上述合成的赖氨酸 - 半胱氨酸 - 精氨酸 - 精氨酸 - 缬氨酸 - 精氨酸肽 段取 0.1 。
20、毫摩尔溶于 2 毫升四氢呋喃溶剂中， 加入 0.15 毫摩尔 N- 甲基吗啡， 冷却至零度时 加入 0.12 毫摩尔氯甲酸异丁酯， 活化半小时后， 加入 0.12 毫摩尔 2- 氨基 -6- 氰基苯并噻 唑， 保持温度在 0一个小时， 室温搅拌反应过夜， 经过高效液相色谱分离提纯， 收集在紫外 320 纳米处有强吸收的组分， 即为第一类初产物 ； 再将上述合成的缬氨酸 - 精氨酸 - 半胱氨 酸 - 精氨酸 - 赖氨酸 - 精氨酸肽段取 0.1 毫摩尔溶于 2 毫升四氢呋喃溶剂中， 加入 0.15 毫 摩尔 N- 甲基吗啡， 冷却至零度时加入 0.12 毫摩尔氯甲酸异丁酯， 活化半小时后， 加。
21、入 0.12 毫摩尔 2- 氨基 -6- 氰基苯并噻唑， 保持温度在 0一个小时， 室温搅拌反应过夜， 经过高效 液相色谱分离提纯， 收集在紫外 320 纳米处有强吸收的组分， 即为第二类初产物 ； 0007 第三步、 先将上述制备的第一类初产物溶解在 5 毫升体积浓度为 95的三氟乙酸 的二氯甲烷溶液中搅拌反应2小时， 经过高效液相色谱分离提纯， 收集在紫外320纳米处有 强吸收组分即为终产物第一种化合物 X1； 再将第二类初产物溶解在 5 毫升体积浓度为 95 的三氟乙酸的二氯甲烷溶液中搅拌反应 2 小时， 经过高效液相色谱分离提纯， 收集在紫外 320 纳米处有强吸收组分即为终产物第三种。
22、化合物 Y1； 0008 第四步、 将 1 毫摩尔终产物第一种化合物 X1溶解在 2 毫升 N， N- 二甲基甲酰胺中， 加入 1 毫摩尔 1- 羟基苯并三唑， 1 毫摩尔苯并三氮唑 -N,N,N,N- 四甲基脲六氟磷酸盐， 2 毫摩尔 N， N- 二异丙基乙胺以及 1.5 毫摩尔 3,5- 双 ( 三氟甲基 ) 苯甲酸， 室温下搅拌反应 过夜， 经过高效液相色谱分离提纯， 收集在紫外 320 纳米处有强吸收组分即为终产物第二 种化合物 X2； 再将 1 毫摩尔终产物第三种化合物 Y1溶解在 2 毫升 N， N- 二甲基甲酰胺中， 加 入 1 毫摩尔 1- 羟基苯并三唑， 1 毫摩尔苯并三氮唑。
23、 -N,N,N,N- 四甲基脲六氟磷酸盐， 2 毫 摩尔 N， N- 二异丙基乙胺以及 1.5 毫摩尔 3,5- 双 ( 三氟甲基 ) 苯甲酸， 室温下搅拌反应过 夜， 经过高效液相色谱分离提纯， 收集在紫外 320 纳米处有强吸收组分即为终产物第四种 化合物 Y2； 0009 其中固相所用的氨基酸都是以 9- 芴甲氧羰基作为 - 氨基保护基， 赖氨酸的侧链氨基保护基为叔丁氧羰基， 半胱氨酸的巯基由叔丁硫基保护， 精氨酸侧链氨 说 明 书 CN 104177475 A 6 3/9 页 7 基由保护 ； 其中活化氨基酸的试剂是与氨基酸同物质的量的 1- 羟基苯并 三唑和苯并三氮唑 -N,N,N,。
24、N- 四甲基脲六氟磷酸盐 ； 在每接上一个氨基酸和切去保护基 时， 都要用凯撒测试 (kaiser test) 试剂检测亚氨基存在与否 ： 若阳性显蓝色， 即表明保护 基团已剪切完 ； 若阴性显黄色， 则表明氨基酸已接上。 0010 由此， 本发明 19F核磁共振探针的制备方法中合成了具有第一类特征结构()或 第二类特征结构 ( ) 的以下四种化合物 ： 0011 0012 上面结构式中的基团 R1选自 H 或R2选自 H 或 0013 其中具有第一类特征结构 ( ) 的化合物为 ： 0014 第一种化合物 X1： 其结构式中的基团 R1为 H ； 0015 第二种化合物 X2： 其结构式中的。
25、基团 R1为 0016 具有第二类特征结构 ( ) 的化合物为 ： 0017 第三种化合物 Y1： 其结构式中的基团 R3为 H ； 说 明 书 CN 104177475 A 7 4/9 页 8 0018 第四种化合物 Y2： 其结构式中的基团 R3为 0019 本发明采用固相合成法将两个肽段分别合成出来， 得到对应的初产物和最终产 物。其中所述具有第一类特征结构 ( ) 的第一种化合物 X1和第二种化合物 X2， 能够被弗 林蛋白酶特异性识别， 剪切发生自组装缩合反应 ； 所述具有第二类特征结构()的第三种 化合物 Y1和第四种化合物 Y2是不能被酶识别， 从而也不能发生自组装反应的对照化合。
26、物 ； 第二种化合物 X2和第四种化合物 Y2中含有 19F 原子， 可以用来做体外验证实验和细胞摄取 实验。 0020 本发明的探针是小分子， 亲水性好， 制备容易 ； 又因该探针的前体小分子有弗林蛋 白酶特异性识别的肽段， 因此可主动靶向所需检测的酶， 从而实现在体外和活体细胞内控 制性自组装含 19F 原子的纳米结构， 研究肿瘤细胞内弗林蛋白酶的活性。 0021 与现有以 1H 原子或放射性元素作为信号源的检测技术相比较， 特别是与中国专利 申请号为 201210342504.2 的 一类磁共振成像显像剂和双光子成像显像剂及其制备方法 以及中国专利申请号为 201210164547.6 。
27、的 一种单光子发射计算机断层成像显像剂及其 制备方法 相比较， 由于本发明利用 19F 原子作为核磁共振信号核素， 其优点在于不需要引 入额外的金属试剂或放射性元素， 生物相容性好， 且在生物体内几乎不存在背景信号， 对特 定目标成像效果好。本发明的另一个显著优点是通过小分子被弗林蛋白酶识别剪切后， 自 组装成纳米材料， 导致 19F 核磁共振波谱信号因横向弛豫而消失 ； 与传统的纳米探针不同的 是， 由于本发明的 19F 核磁共振探针的前体是小分子， 亲水性很好， 制备容易， 因此本发明的 19F核磁共振探针在具备纳米材料的优点的同时又克服了一般纳米材料制备难、 低摄取和靶 向难的难题。 由。
28、于本发明的纳米探针的前体小分子有弗林蛋白酶特异性识别的肽段， 因此， 利用本发明可以控制性自组装含 19F 原子的纳米结构， 利用19F 核磁共振波谱信号的出现与 消失， 用于弗林蛋白酶的活性研究。目前这方面的研究工作尚未见有文献公开报道。 附图说明 0022 图 1 为实施例 1 中合成的第一种化合物 X1的基质辅助激光解吸 / 电离飞行时间 质谱谱图 ； 0023 图 2 为实施例 1 中合成的第二种化合物 X2的高分辨基质辅助激光解吸 / 电离飞 行时间质谱谱图 ； 0024 图 3 为实施例 1 中合成的第三种化合物 Y1的基质辅助激光解吸 / 电离飞行时间 质谱谱图 ； 0025 图。
29、 4 为实施例合成 1 中的第四种化合物 Y2的高分辨基质辅助激光解吸 / 电离飞 行时间质谱谱图。 0026 图 5 为实施例 2 中第二种化合物 X2体外缩合形成纳米粒子的透射电子显微镜表 征 ； 0027 图 6 为实施例 2 中第二种化合物 X2体外缩合形成纳米粒子的扫描电子显微镜表 说 明 书 CN 104177475 A 8 5/9 页 9 征 ； 0028 图 7 为实施例 2 中第二种化合物 X2的 19F 核磁共振波谱谱图 ； 0029 图 8 为实施例 2 中第四种化合物 Y2的 19F 核磁共振波谱谱图 ； 0030 图 9 为实施例 2 中第二种化合物 X2体外验证实验。
30、后的 19F 核磁共振波谱谱图 ； 0031 图 10 为实施例 2 中第四种化合物 Y2体外验证实验后的 19F 核磁共振波谱谱图 ； 0032 图 11 为实施例 3 中第二种化合物 X2细胞摄取后 19F 核磁共振波谱谱图 ； 0033 图 12 为实施例 3 中第四种化合物 Y2细胞摄取后 19F 核磁共振波谱谱图。 具体实施方式 0034 下面结合附图以具体实施例来对本发明作进一步具体详细的说明。实施例 1 中提 供了探针的合成， 其中所述具有第一类特征结构 ( ) 的化合物是可以被弗林蛋白酶特异 性识别剪切发生自组装缩合反应的化合物， 所述具有第二类特征结构 ( ) 的化合物是不 。
31、可以被弗林蛋白酶识别从而也不能发生自组装反应的对照化合物。第二种化合物 X2和第 四种化合物 Y2含有 19F 原子， 用来做体外验证实验和细胞摄取实验。实施例 2 为体外验证 实验。实施例 3 为细胞摄取实验。 0035 实施例 1 ： 0036 先采用固相合成法将赖氨酸 - 半胱氨酸 - 精氨酸 - 精氨酸 - 缬氨酸 - 精氨酸和缬 氨酸 - 精氨酸 - 半胱氨酸 - 精氨酸 - 赖氨酸 - 精氨酸两个肽段分别合成出来。 0037 本实施例中第二种化合物 X2(Acetyl-Arg-Val-Arg-Arg-Cys(StBu)-Lys(FMBA)-C BT) 的合成路线如下 ： 0038 。
32、0039 先采用固相合成法将赖氨酸 - 半胱氨酸 - 精氨酸 - 精氨酸 - 缬氨酸 - 精氨酸肽段 合成出来， 具体步骤如下 ： 将 0.33 毫摩尔 2- 氯三苯甲基氯树脂在 2 毫升 N， N- 二甲基甲酰 说 明 书 CN 104177475 A 9 6/9 页 10 胺里溶胀五分钟后， 在反应器中加入 0.66 毫摩尔第一个氨基酸， 加入 0.66 毫摩尔 N， N- 二 异丙基乙胺 , 反应两个小时后， 用 30 微升甲醇反应二十分钟， 切去第一个氨基酸保护基， kaiser 测试显蓝色， 加入活化的 0.55 毫摩尔第二个氨基酸半胱氨酸反应两个小时， kaiser 测试显黄色， 。
33、切去保护基， kaiser 测试显蓝色， 加入活化的 0.55 毫摩尔第三个氨基酸精氨 酸反应三个小时， kaiser测试显黄色， 切去保护基， kaiser测试显蓝色， 加入活化的0.55毫 摩尔第四个氨基酸精氨酸反应三个小时， kaiser 测试显黄色， 切去保护基， kaiser 测试显 蓝色， 加入活化的 0.55 毫摩尔第五个氨基酸缬氨酸反应两个小时， kaiser 测试显黄色， 切 去保护基， kaiser 测试显蓝色， 加入活化的 0.55 毫摩尔第六个氨基酸精氨酸反应四小时， kaiser 测试显黄色， 切去保护基， kaiser 测试显蓝色， 加 1 毫摩尔醋酐反应二十分钟，。
34、 最后 用含体积浓度为 1三氟乙酸的二氯甲烷从树脂上切下肽段， 采用乙醚层出冷冻离心倾去 上层乙醚， 待溶剂挥发干后得到白色固体粉末即是所要合成的肽段 ； 将上述合成的肽段取 用 0.1 毫摩尔溶于 2 毫升四氢呋喃溶剂中， 加入 0.15 毫摩尔 N- 甲基吗啡， 冷却至零度时加 入 0.12 毫摩尔氯甲酸异丁酯， 半小时后加入 0.12 毫摩尔 2- 氨基 -6- 氰基苯并噻唑， 保持 温度在 0至 10一个小时， 室温搅拌反应过夜， 经过高效液相色谱分离提纯， 收集在紫外 320 纳米处有强吸收组分即得第一类初产物 ； 然后将上一步中得到的第一类初产物溶解在 10毫升体积浓度为95的三氟。
35、乙酸的二氯甲烷中室温搅拌反应3小时， 经过高效液相色谱 分离提纯， 收集在紫外 320 纳米处有强吸收组分即为第一种化合物 X1。上述反应步骤后， 将 1 毫摩尔终产物第一种化合物 X1溶解在 2 毫升 N， N- 二甲基甲酰胺中， 加入 1 毫摩尔 1- 羟 基苯并三唑， 1 毫摩尔苯并三氮唑 -N,N,N,N- 四甲基脲六氟磷酸盐， 2 毫摩尔 N， N- 二异丙 基乙胺以及 1.5 毫摩尔 3,5- 双 ( 三氟甲基 ) 苯甲酸， 室温下搅拌反应过夜， 经过高效液相 色谱分离提纯， 收集在紫外 320 纳米处有强吸收组分即为终产物第二种化合物 X2。 0040 利用基质辅助激光解吸 / 。
36、电离飞行时间质谱得到两种化合物的质谱如图 1 和图 2 所示。图 1 是本实施例中合成的第一种化合物 X1的质谱谱图 ； 图 2 为第二种化合物 X2的高 分辨质谱谱图。第一种化合物 X1分子式为 C46H77N19O7S3， 分子量 :1104.4217， 所得质谱为 m/ z 1104.5421 ； 第二种化合物 X2分子式为 C55H79F6N19O8S3， (M+H)+ 1344.55036， 观察到的 高分辨质谱为 m/z 1344.55035。 0041 第四种化合物 Y2(Acetyl-Arg-Lys(FMBA)-Arg-Cys(StBu)-Arg-Val-CBT) 的合成 路线。
37、如下 ： 0042 说 明 书 CN 104177475 A 10 7/9 页 11 0043 先采用固相合成法将缬氨酸 - 精氨酸 - 半胱氨酸 - 精氨酸 - 赖氨酸 - 精氨酸肽段 合成出来， 具体步骤如下 ： 将 0.33 毫摩尔 2- 氯三苯甲基氯树脂在 2 毫升 N， N- 二甲基甲酰 胺里溶胀五分钟后， 在反应器中加入 0.66 毫摩尔第一个氨基酸， 加入 0.66 毫摩尔 N， N- 二 异丙基乙胺 , 反应两个小时后， 用 30 微升甲醇反应二十分钟， 切去第一个氨基酸保护基， kaiser 测试显蓝色， 加入活化的 0.55 毫摩尔第二个氨基酸半胱氨酸反应两个小时， kai。
38、ser 测试显黄色， 切去保护基， kaiser 测试显蓝色， 加入活化的 0.55 毫摩尔第三个氨基酸精氨 酸反应三个小时， kaiser测试显黄色， 切去保护基， kaiser测试显蓝色， 加入活化的0.55毫 摩尔第四个氨基酸精氨酸反应三个小时， kaiser 测试显黄色， 切去保护基， kaiser 测试显 蓝色， 加入活化的 0.55 毫摩尔第五个氨基酸缬氨酸反应两个小时， kaiser 测试显黄色， 切 去保护基， kaiser 测试显蓝色， 加入活化的 0.55 毫摩尔第六个氨基酸精氨酸反应四小时， kaiser 测试显黄色， 切去保护基， kaiser 测试显蓝色， 加 1 毫。
39、摩尔醋酐反应二十分钟， 最后 用含体积浓度为 1三氟乙酸的二氯甲烷从树脂上切下肽段， 采用乙醚层出冷冻离心倾去 上层乙醚， 待溶剂挥发干后得到白色固体粉末即是所要合成的肽段 ； 将上述合成的肽段取 用 0.1 毫摩尔溶于 2 毫升四氢呋喃溶剂中， 加入 0.15 毫摩尔 N- 甲基吗啡， 冷却至零度时加 入 0.12 毫摩尔氯甲酸异丁酯， 半小时后加入 0.12 毫摩尔 2- 氨基 -6- 氰基苯并噻唑， 保持 温度在 0至 10一个小时， 室温搅拌反应过夜， 经过高效液相色谱分离提纯， 收集在紫外 320 纳米处有强吸收组分即得第二类初产物 ； 然后将上一步中得到的第二类初产物溶解在 10毫。
40、升体积浓度为95的三氟乙酸的二氯甲烷中室温搅拌反应3小时， 经过高效液相色谱 分离提纯， 收集在紫外 320 纳米处有强吸收组分即为第三种化合物 Y1。上述反应步骤后， 将 1 毫摩尔终产物第三种化合物 Y1溶解在 2 毫升 N， N- 二甲基甲酰胺中， 加入 1 毫摩尔 1- 羟 基苯并三唑， 1 毫摩尔苯并三氮唑 -N,N,N,N- 四甲基脲六氟磷酸盐， 2 毫摩尔 N， N- 二异丙 基乙胺以及 1.5 毫摩尔 3,5- 双 ( 三氟甲基 ) 苯甲酸， 室温下搅拌反应过夜， 经过高效液相 色谱分离提纯， 收集在紫外 320 纳米处有强吸收组分即为终产物第四种化合物 Y2。 说 明 书 C。
41、N 104177475 A 11 8/9 页 12 0044 利用基质辅助激光解吸 / 电离飞行时间质谱得到两种化合物的质谱如图 3 和图 4 所示。图 3 为第四种化合物 Y1的质谱谱图 ； 图 4 为第四种化合物 Y2的高分辨质谱谱图第 三种化合物 Y1分子式为 C46H77N19O7S3， 分子量 :1104.4217， 所得质谱为 m/z 1104.54937 ； 第 四种化合物 Y2分子式为 C55H79F6N19O8S3， (M+H)+ 1344.55036， 观察到的高分辨质谱为 m/ z 1344.55035。 0045 实施例 2 ： 体外验证实验 0046 首先培养恶性乳腺。
42、癌细胞株 MDA-MB-468， 具体操作如下 ： 恶性乳腺癌细胞株 MDA-MB-468 使用含体积浓度 10的牛血清蛋白的 DMEM 培养基培养， 细胞在含体积浓度为 5 CO2的空气环境的 37恒温箱里培养， 隔一天换一次培养基。再用胰酶将 468 细胞消化 处理， 然后用细胞裂解液， 提取胞内蛋白。 0047 具体方法为， 将高表达弗林蛋白酶的 MDA-MB-468 细胞用胰酶消化， 然后加入 250L细胞裂解液， 在冰上震荡裂解1520分钟后， 放入冷冻离心机高速离心20分钟， 胞 内不溶物沉淀在离心管底部， 取上清液， 即为具有活性的胞内蛋白。将第二种化合物 X2和 第四种化合物 。
43、Y2分别加入到上清液中 ( 浓度 100M， 体积 100L)， 在 37的水浴锅中孵 育 6 小时。再直接蘸取上述混合液进行表征以及进行 19F 核磁共振波谱分析。 0048 图 5 给出了本实施例中第二种化合物 X2体外缩合形成纳米粒子的透射电子显微 镜表征 ； 图 6 为本实施例中第二种化合物 X2体外缩合形成纳米粒子的扫描电子显微镜表 征， 表明了缩合反应的发生以及纳米粒子的形成。 0049 图 7 和图 8 分别是第二种化合物 X2和第四种化合物 Y2的 19F 核磁共振波谱， 其化 学位移分别为 -61.30ppm 和 -61.44ppm。图 9 和图 10 分别是第二种化合物 X。
44、2和第四种化 合物 Y2的经体外验证实验后的 19F 核磁共振波谱。当第二种化合物 X 2和第四种化合物 Y2 分别与 468 细胞的裂解液孵育后， 第二种化合物 X2经弗林蛋白酶剪切， 缩合形成的二聚体 自组装形成纳米粒子， 其 19F 核磁共振信号由于横向弛豫而消失， 而作为对照的第四种化合 物 Y2由于不能被弗林蛋白酶识别剪切， 其 19F 信号几乎保持不变。 0050 实施例 3 ： 细胞摄取实验 0051 在37， 5CO2的细胞培养箱中， 当MDA-MB-468细胞长满6cm的培养皿后， 移去原 培养基， 加不含牛血清的培养基培养4小时。 移去培养基， 用胰酶将细胞消化， 收集在1。
45、.5mL 的离心管中 , 分别加入 500M 的第二种化合物 X2和第四种化合物 Y2500L， 在 37的恒 温振荡器上继续培养 0.5 小时。然后移去培养基， 分别用 100L 细胞裂解液裂解细胞， 直 接用于 19F 核磁共振波谱分析。 0052 图 11 和图 12 分别是第二种化合物 X2和第四种化合物 Y2的经细胞摄取实验后的 19F 核磁共振波谱。细胞摄取能够被弗林蛋白酶识别剪切的第二种化合物 X 2后， 得到图 11 的 19F 核磁共振波谱信号消失， 而摄取不能被弗林蛋白酶识别剪切的第四种化合物 Y 2后， 得 到图 12 的 19F 核磁共振波谱信号仍然存在。 0053 通。
46、过上述实施例及其结果可知 ： 本发明的纳米探针通过小分子在靶点处智能的自 组装成纳米材料， 使得原本存在的 19F 核磁共振信号消失 ； 由于本发明的探针的前体是小分 子， 亲水性很好， 制备容易， 因此本发明的探针具备纳米材料的优点的同时又克服了一般纳 米材料制备难、 低摄取和靶向难的难题。由于本发明的纳米探针的前体小分子有弗林蛋白 酶特异性识别的肽段， 因此， 利用本发明可以控制性自组装含 19F 原子的纳米结构， 利用19F 说 明 书 CN 104177475 A 12 9/9 页 13 核磁共振波谱信号的出现与消失， 用于弗林蛋白酶的活性研究。综上， 利用本发明的 19F 核 磁共振。
47、及其制备方法可以控制性自组装放射性纳米结构， 以用于弗林蛋白酶活性的检测研 究。 说 明 书 CN 104177475 A 13 1/8 页 14 图 1 说 明 书 附 图 CN 104177475 A 14 2/8 页 15 图 2 说 明 书 附 图 CN 104177475 A 15 3/8 页 16 图 3 说 明 书 附 图 CN 104177475 A 16 4/8 页 17 图 4 说 明 书 附 图 CN 104177475 A 17 5/8 页 18 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 104177475 A 18 6/8 页 19 图 7 图 8 图 9 说 明 书 附 图 CN 104177475 A 19 7/8 页 20 图 10 图 11 说 明 书 附 图 CN 104177475 A 20 8/8 页 21 图 12 说 明 书 附 图 CN 104177475 A 21 。