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1、(10)申请公布号 CN 104178577 A (43)申请公布日 2014.12.03 CN 104178577 A (21)申请号 201410454387.8 (22)申请日 2014.09.09 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12 号 (72)发明人 张友军 郭兆将 康师 朱勋 吴青君 王少丽 徐宝云 谢文 (74)专利代理机构 北京知本村知识产权代理事 务所 11039 代理人 刘江良 (54) 发明名称 基于 ABCC2 基因的小菜蛾对 Bt。
2、 杀虫蛋白 Cry1Ac 抗性的检测方法及其试剂盒 (57) 摘要 本发明公开了一种基于 ABCC2 基因的小菜蛾 对 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 抗性的实时荧光定量 PCR 检测方法及其试剂盒， 所述试剂盒包含以下靶标 基因特异引物序列 ： 正向引物如 SEQIDNO.2 所示， 反向引物如SEQIDNO.3所示。 本发明方法， 需人力 及样品量少， 检测数量大， 而且灵敏度高、 特异性 强、 快速简便和准确可靠， 因而能有效的检测小菜 蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac的抗性水平， 适合于小菜 蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的早期快速诊断， 同 时可用于田间小菜蛾 Bt 杀虫蛋白 Cry1A。
3、c 抗性的 实时监控和预警预报， 应用前景广泛。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 9 页 序列表 1 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书9页 序列表1页 附图2页 (10)申请公布号 CN 104178577 A CN 104178577 A 1/1 页 2 1. 一种用于检测小菜蛾对 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 抗性的 PCR 引物对， 其特征在于 ： 所述引物对的序列为 ： 正向引物如 SEQ ID NO.2 所示， 反向引物如 SEQ ID NO.3 所示。 2. 一种用于检测小菜蛾对 Bt 杀虫蛋白。
4、 Cry1Ac 抗性的 PCR 检测试剂盒， 其特征在于 ： 所述试剂盒包含权利要求 1 所述的引物对。 3. 一种检测小菜蛾对 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 抗性的 PCR 检测方法， 其特征在于 ： 其采用如权利要求 1 所述的引物对或权利要求 2 所述的试剂盒进行 PCR。 4. 如权利要求 3 所述的检测小菜蛾对 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 抗性的 PCR 检测方法， 具体 包括以下步骤 ： (1) 提取待测小菜蛾的 RNA 样品， 并反转录为 cDNA 模板 ； (2) 将所述 cDNA 模板加入到含有所述引物对的 PCR 反应液中得到 PCR 反应体系 ； (3) 进行实时荧光定。
5、量 PCR 检测。 5.如权利要求4所述的检测小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的PCR检测方法， 其中， 所述实时荧光定量PCR检测的扩增程序为 ： 94预变性15 min， 94变性15 sec， 55退火 30 sec， 72延伸 32 sec， 40 个循环。 6.如权利要求4所述的检测小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的PCR检测方法， 其中， PCR 过程完成后， 按 0.l s-1的升温速率从 72升至 95进行融解曲线的分析验证， 具体 过程为 ： 95进行 15 s， 然后 60进行 1 min， 接着 95进行 30 s， 最后再在 60进行 15 s ； 若所述待测小。
6、菜蛾的样品产生典型的 “S” 型扩增曲线及单峰融解曲线， 且 Ct 值 Ct 值( 目的基因 ABCC2-内参基因 L32) 7， 则说明所述小菜蛾待测的样品对 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 产生抗 性 ； 若 Ct 值 Ct 值 ( 目的基因 ABCC2-内参基因 L32) 6， 则说明待测小菜蛾的样品未对 Bt 杀虫蛋 白 Cry1Ac 产生抗性。 7. 根据权利要求 4 至 6 任一项所述的方法， 其特征在于 ： 所述待测小菜蛾的 RNA 样品 为小菜蛾 4 龄幼虫中肠的 RNA 样品。 权 利 要 求 书 CN 104178577 A 2 1/9 页 3 基于 ABCC2 基因的小菜蛾。
7、对 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 抗性的检 测方法及其试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及生物领域， 尤其涉及小菜蛾对 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 抗性的实时荧光定 量 PCR 检测方法及其试剂盒。 背景技术 0002 小菜蛾Plutella xylostella (L.)， 又名菜蛾， 方块蛾， 属鳞翅目 (Lepidoptera) 菜蛾科 (Plutellidae)， 寄主多达 40 种以上， 但主要危害十字花科植物， 是一种世界性危害 的十字花科蔬菜重要害虫。在我国， 上世纪 70 年代以来， 小菜蛾逐渐上升为华南和长江中 下游地区十字花科蔬菜的主要害虫， 且其分布不断向北扩展 ( 。
8、赵建周等， 1994)。目前， 每年 在世界范围内用于小菜蛾防治的费用已高达 40-50 亿美元 (Furlong et al., 2013)。小 菜蛾之所以危害如此严重主要是因为它能很快对多种化学药剂产生抗药性。 它几乎对用于 防治其危害的各类杀虫剂都产生了不同程度的抗药性， 这其中除了化学农药， 还包括生物 源农药如阿维菌素、 多杀菌素和苏云金芽孢杆菌 Bt 等 ( 唐振华和周成理， 1992)。 0003 苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis， 简称 Bt) 是一种在芽孢形成期间可 产生杀虫晶体蛋白 (Insecticidal Crystal Proteins，。
9、 简称 ICPs， 又被称为 - 内毒素 ) 的革兰氏阳性细菌。自上世纪 30 年代以来， Bt 即作为生物杀虫剂被广泛用于田间害虫防 治。由于其杀虫谱广， 专一性强， 对人畜无害， 对环境友好等优点， Bt 制剂现已成为世界上 应用最广的一类微生物杀虫剂。多年来， 它在害虫防治中发挥了重要作用。但是 Bt 制剂 大量及不合理的使用最终造成了害虫产生 Bt 抗性。在实验室内， 许多害虫已经汰选出了 Bt 抗性， 更为可怕的是， 目前在世界范围内至少已有 7 种害虫被报道已经在田间产生 Bt 抗 性 (Tabashnik et al., 2011; Tabashnik et al., 2013)。
10、。小菜蛾 Bt 抗性问题已日趋 严重。因此， 为了更有效的使用 Bt 生物农药防治小菜蛾， 开发有效地小菜蛾 Bt 抗性早期 快速分子诊断技术就显得尤为重要。目前， 尽管一些基于 PCR 方法的分子标记技术如 RAPD (Random Amplifi ed Polymorphic DNA， 随机扩增多态性 DNA)、 AFLP (Amplifi ed Fragment Length Polymorphism， 扩增片段长度多态性 ) 已经用于小菜蛾抗性相关基因的寻找上， 但 这些标记并未直接用于小菜蛾抗性检测， 小菜蛾 Bt 抗性检测仍局限于生物测定方法。然 而， 传统的生物测定方法有一些缺点。
11、 ： (1) 灵敏度低 ： 生物测定很难检测早期抗性或低频率 抗性 ； (2) 周期长 ： 小菜蛾的 Bt 生物测定结果一般需要 2 天 (48 小时 ) 以上 ； (3) 对试虫 数量要求很大 ： 测定一个标准曲线完成一次生测至少需要约 200 头试虫， 且对昆虫饲养的 要求也很高。(4) 操作麻烦且标准性不强 ： 方法比较繁琐， 操作起来比较复杂， 从虫源、 饲养 到测定难以做到真正的标准化， 尤其要求试虫的大小一致， 不仅导致生测的工作量加大， 而 且诸多人为因素也会影响生测结果 ； (5) 传统的方法从软件绘出的标准曲线求出的 LC50和 LC90值的重复性和精确性较低 ； (6) 传。
12、统的生物测定方法对供试昆虫测得的抗性水平往往 具有滞后性。 0004 随着分子生物学技术进一步的飞速发展， 人们已经将实时荧光定量 PCR 技术 说 明 书 CN 104178577 A 3 2/9 页 4 (Real Time-quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-qPCR) 广泛应用于多种病 毒、 细菌的抗药性检测， 并开始应用于转录水平上昆虫 Bt 抗药性靶标基因的表达量检测。 实时荧光定量 PCR 就是在 PCR 扩增过程中， 通过荧光信号， 对 PCR 进程进行实时检测。由于 在 PCR 扩增的指数时期， 模板的 Ct 值 ( 每个反应。
13、管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历 的循环数 ) 和该模板的起始拷贝数存在线性关系， 所以成为定量的依据。相对于生测等常 规 Bt 抗性检测手段， 实时荧光定量 PCR 具有操作简单， 灵敏度高， 重复性好等优点， 因而已 开始成为昆虫抗药性靶标基因转录水平表达量检测的首选方法， 在抗药性检测上日益显示 出强大的优势。 0005 目前， 利用PCR技术对Bt杀虫蛋白受体基因-类钙粘蛋白基因 (cadherin-like gene) 在对 Bt 杀虫蛋白抗性的棉红铃虫 (Pectinophora gossypiella) 及烟芽夜蛾 (Heliothis virescens) 中缺失突变位点来。
14、检测这两种害虫对 Bt 杀虫蛋白抗性情况已 经被报道， 但是田间害虫种群检测效果并不理想 (Morin et al., 2004; Gahan et al., 2007)。而且， 研究表明， 形成 Bt 杀虫蛋白抗性小菜蛾的类钙粘蛋白基因并未发生突变， 小 菜蛾 Bt 杀虫蛋白抗性与该基因无关 (Baxter et al., 2005)。最近， 却有研究表明， ABC 转运蛋白 (ATP-binding cassette transporter, ABC transporter) 超家族中 ABCC 亚家 族的 ABCC2 基因发生突变并导致小菜蛾对 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 产生抗性 (。
15、Baxter et al., 2011)， 而且， 该实验中所用的小菜蛾种群是田间进化的Bt杀虫蛋白Cry1Ac高抗种群， 这说 明 ABCC2 基因发生突变的小菜蛾可以在田间存活， 这就为田间小菜蛾 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 抗性检测提供了很好的靶标基因。然而， 我们随后的实验并未发现 ABCC2 基因突变与 Bt 杀 虫蛋白 Cry1Ac 抗性相关， 然而， 我们最近利用实时荧光定量 PCR 技术研究发现， 该 ABCC2 基 因表达量下调与 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 抗性密切相关， 那么， 利用实时荧光定量 PCR 技术检测 ABCC2表达量的下降水平是一种有效检测田间害虫Bt 。
16、Cry类杀虫毒素抗性的好方法。 毫无 疑问， 小菜蛾早期抗药性分子检测与诊断技术的开发将为其抗性治理措施的评价以及抗药 性风险预警提供技术手段， 在减少害虫危害损失、 减少农药对环境的污染、 保障蔬菜产品的 质量和保障人民身体健康等方面具有重要的意义。 因此， 建立一种准确、 简便、 快速、 可靠的 小菜蛾 Bt 抗性检测手段尤为迫切。所以为了更好的检测小菜蛾 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 抗性， 开发出更有效地小菜蛾 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 抗性检测手段， 我们开展了该研究内容。 发明内容 0006 本发明针对现有小菜蛾 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 抗性检测技术中存在的灵敏度低、 周。
17、 期长、 重复性差及材料要求高等问题， 拟通过特异性荧光定量 PCR 引物筛选及其反应体系 的优化等步骤， 建立一种快速准确的实时荧光定量 PCR 分子检测方法及快速、 简便、 准确、 高效的检测小菜蛾 Bt 抗性的检测试剂盒， 为小菜蛾 Bt 抗性有效检测提供有效工具。 0007 本发明的一个目的是提供了一种用于检测小菜蛾对 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 抗性的 PCR 引物对， 所述引物对的序列 ： 正向引物如 SEQ ID NO.2 所示， 反向引物如 SEQ ID NO.3 所示。 0008 所述特异性引物对包括以小菜蛾中肠 ABC 转运蛋白超家族中 ABCC 亚家族 ABCC2 基因。
18、的保守片段区为靶目标序列设计得到的靶标基因特异性引物对以及已报道的小菜蛾 持家基因核糖体蛋白L32基因的保守片段区为靶目标序列设计得到的内参基因L32特异性 说 明 书 CN 104178577 A 4 3/9 页 5 引物序列。 0009 本发明还提供一种用于检测小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的PCR检测试剂盒， 其特征在于 ： 所述试剂盒包含所述的引物对。 进一步的， 本试剂盒中还包括本实验室已发表 的 (Fu et al., 2013) 以小菜蛾持家基因核糖体蛋白 L32 基因的保守片段区为靶目标序 列设计得到的内参基因 L32 特异性引物序列 （正向引物 ： 5 -CCAATTT。
19、ACCGCCCTACC-3； 反 向引物 ： 5 -TACCCTGTTGTCAATACCTCT-3） ， 用于校正样品间实验误差。本试剂盒中含有 的逆转录酶， DNase， RNase 抑制剂， dNTP 混合物， 特异性引物， MgCl2溶液， 热启动 Taq DNA 聚合酶， 荧光定量反应液， Buffer 缓冲液， RNase-free 水等实验组分对于本领域技术人员 来说属于公知常识， 可根据自身需要选用。 此外， 本试剂盒还包括符合该试剂盒要求的阳性 对照及阴性对照样品。 0010 本发明进而提供一种检测小菜蛾对 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 抗性的 PCR 检测方法， 其 特征在于。
20、 ： 其采用如所述的引物对或所述的试剂盒进行 PCR。 0011 具体包括以下步骤 ： (1) 提取待测小菜蛾的 RNA 样品， 并反转录为 cDNA 模板 ； (2) 将所述 cDNA 模板加入到含有所述引物对的 PCR 反应液中得到 PCR 反应体系 ； (3) 进行实时荧光定量 PCR 检测 ； 所述实时荧光定量PCR检测的扩增程序为 ： 94预变性15 min， 94变性15 sec， 53 退火 30 sec， 72延伸 32 sec， 40 个循环。 0012 PCR 过程完成后， 按 0.ls-1的升温速率从 72升至 95进行融解曲线的分析 验证， 具体过程为 ： 95进行15。
21、 s， 然后60进行1 min， 接着95进行30 s， 最后再在60 进行 15 s。 0013 优选地， 所述待测小菜蛾的 RNA 样品为小菜蛾 4 龄幼虫中肠的 RNA 样品。 0014 优选的， 本发明使用 ABI Prism 7500 实时荧光定量 PCR 仪进行检测。 0015 本发明使用 ABI Prism 7500 实时荧光定量 PCR 仪进行检测。 0016 ABI Prism 7500 实时荧光定量 PCR 仪进行结果分析时， 基线设置取 3-15 个循环 的荧光信号。为便于比较， 样品、 阴性及阳性对照的所有扩增曲线的阈值均设定为 0.50153 ( 位于扩增曲线对数期中。
22、间位置， 其它仪器基线和阈值设定可根据仪器作相应调整 )。 0017 对上述步骤中荧光定量 PCR 反应产物进行荧光定量检测， 在特定的波长条件下， 根据荧光检测的抗敏样品间各自靶标基因ABCC2与内参基因L32之间的Ct值差值 （即Ct 值） 判断结果， 若所述待测小菜蛾样品产生典型的 “S” 型扩增曲线及单峰融解曲线， 且 Ct 值 7， 则说明所述小菜蛾待测样品对 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 产生抗性 ； 若 Ct 值 6， 则说 明待测小菜蛾样品未对 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 产生抗性。若 Ct 值位于两者中间， 则建议重 做， 样品对 Bt 杀虫蛋白抗性产生与否视重做结果而定。。
23、 0018 本发明系选择小菜蛾中肠 ABCC2 基因的保守片段区为靶目标序列， 根据该基因特 点和实时荧光定量 PCR 引物的设计原则， 设计了一对特异性引物， 再配合已发表的内参基 因 L32 特异性引物， 建立了一种用于小菜蛾 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 抗性检测的实时荧光定量 PCR 试剂盒及其检测方法。较之现有生物测定技术而言， 本发明所提供的小菜蛾 Bt 杀虫蛋 白抗性检测的实时荧光定量 PCR 检测试剂盒及其使用方法， 具有如下效果及优点 ： (1)特异性更强。 本发明是利用小菜蛾中肠ABCC2基因的保守片段区为靶目标序列， 设 说 明 书 CN 104178577 A 5 4/。
24、9 页 6 计了一对特异性引物， 从而在 PCR 过程中可以对靶目标序列进行特异性扩增， 通过将未知 样品和阳性对照间的 ABCC2 基因表达量差异进行比对即可测定未知样品是否产生抗性 ； 而 传统的生测方法是通过观察判断试虫在不同Bt杀虫蛋白Cry1Ac浓度下死亡情况来粗略判 断小菜蛾是否对 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 产生抗性， 其判断较之基因检测特异性差得多。 0019 (2) 灵敏度和准确度更高。本发明中涉及的小菜蛾 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 抗性检 测方法是通过检测 PCR 实时荧光强度确定抗性相关基因表达量来判断小菜蛾是否产生抗 性， 而实时荧光强度的仪器检测， 相对于传统的。
25、通过人为观察判断试虫在不同 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac浓度下死亡情况来粗略判断小菜蛾是否对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性这种误判率 及重复性较差的生测方法， 抗性检测的灵敏度和准确度大大提高。 0020 (3) 检测周期短。生测过程至少需要 48 小时的时间， 而本发明方法仅需 3 小时即 可完成判断， 一次可以同时检测多个样品， 特别适合于大批量样品的快速检测。 0021 (4) 材料要求少。小菜蛾毒力生物测定中测定一个标准曲线至少需要约 200 头标 准试虫， 这些试虫的饲养及挑取需要花费一定的人力、 物力和财力。 而本发明对一个种群的 检测只需要几十头左右的 4 龄试虫， 甚至可以检。
26、测单头 4 龄试虫。 0022 综上所述， 本发明的方法可替代传统的生物测定方法， 它可以准确、 快速、 特异、 方 便的检出供试小菜蛾是否具有 Bt 抗性， 对田间小菜蛾 Bt 抗性的监测监控具有重要意义。 0023 尤其需要指出的是， 本发明人之前研究认为利用 PCR 技术检测小菜蛾中肠膜结合 形式的碱性磷酸酶基因 (mALP) 表达量变化可作为小菜蛾 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 抗性的好方 法 （已申请国家发明专利， 专利号 201210273591.0） ， 然而， 与 mALP 相比， ABCC2 基因才是小 菜蛾 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 抗性的主效基因且其表达量变化与小菜蛾。
27、该抗性性状紧密连锁， 那么在不同抗性倍数小菜蛾中 ABCC2 基因表达量变化要比 mALP 表达量变化更为灵敏， 因 此， 与该发明专利内容相比， 本发明专利所利用的检测 ABCC2 基因表达量变化的方法更能 反应不同抗性基因频率水平与抗性倍数之间的关系， 从而能更好的检测形成不同程度抗性 的田间小菜蛾种群。 0024 本发明所提供的小菜蛾对 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 抗性的 PCR 检测方法， 需人力及样 品量少， 检测数量大的特点， 而且灵敏度高、 特异性强、 快速简便和准确可靠， 因而能有效的 检测小菜蛾对 Bt 杀虫蛋白的抗性， 适合于小菜蛾对 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 抗性的。
28、早期快速诊 断， 同时可用于田间小菜蛾 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 抗性的实时监控和预警预报， 应用前景广 泛。 附图说明 0025 图 1 为本发明中所用特异性引物对扩增小菜蛾中肠 ABCC2 基因 cDNA 片段序列。 0026 图 2 为图 1 中目的基因 ABCC2 和内参基因 L32 在 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 敏感的 4 龄 小菜蛾幼虫中肠cDNA样品PCR扩增片段的2%琼脂糖凝胶电泳图。 其中， 1 ： 目的基因ABCC2 的 PCR 扩增片段 (101bp) ； 2 ： 内参基因 L32 的 PCR 扩增片段 (120bp) ； M ： Marker 。 0027 图 。
29、3 为标准品梯度稀释进行实时荧光定量 PCR 所得到的标准扩增曲线。其中， 横 坐标代表循环数 (Cycle)， 纵坐标代表第 n 次 PCR 循环时的荧光信号强度 (Rn)， 图中平行 且远离横坐标的直线代表荧光阈值， 字母代表样品 cDNA 的 5 个 2 梯度稀释浓度。 0028 图 4 是根据图 3 中得出的数据绘制的荧光定量 PCR 所得到的标准曲线。其中， 横 说 明 书 CN 104178577 A 6 5/9 页 7 坐标代表标准样品 cDNA 浓度的对数值， 纵坐标代表循环阈值即 Ct 值。 0029 图 5 为实施例 1 的检测小菜蛾 Bt 杀虫蛋白抗性的荧光定量 PCR 。
30、检测结果。其中， A ： 对Bt杀虫蛋白Cry1Ac敏感小菜蛾种群DBM1Ac-S的4龄幼虫中肠cDNA样品 ； B ： 对Bt杀 虫蛋白 Cry1Ac 产生抗性小菜蛾种群 SZ-R 的 4 龄幼虫中肠 cDNA 的样品。 0030 图6 为实施例2的检测小菜蛾Bt抗性的荧光定量PCR检测结果。 其中， A ： 实施例 1 中对 Bt 敏感的小菜蛾种群 DBM1Ac-S 的 4 龄幼虫中肠 cDNA 阴性对照样品 ； B ： 实施例 1 中 对 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 产生抗性的小菜蛾种群 SZ-R 的 4 龄幼虫中肠 cDNA 阳性对照样品 ； C ： 对 Btk 制剂产生抗性的小菜蛾。
31、种群 SH-R 的 4 龄幼虫中肠 cDNA 待测样品 ； D ： 对 Bt 杀虫 蛋白 Cry1Ac 产生抗性的近等基因系小菜蛾种群 DBM1Ac-R 的 4 龄幼虫中肠 cDNA 待测样品 ； E ： 对 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 产生抗性的小菜蛾种群 NIL-R 的 4 龄幼虫中肠 cDNA 待测样品。 0031 具体实施方式 0032 以下结合实施例对本发明作进一步描述与说明， 但本发明的保护范围并不仅限于 此。 0033 实验前材料样品准备 ： (1) 小菜蛾 Bt 杀虫蛋白敏感种群 (DBM1Ac-S) ： 该小菜蛾种群在中国农业科学院蔬菜 花卉研究所昆虫组昆虫饲养室内用无虫甘。
32、蓝苗进行继代饲养， 期间未接触任何有毒杀虫 剂， 对 Bt 制剂及其产生的毒素敏感 ； 记载过小菜蛾 Bt 敏感种群 (DBM1Ac-S) 的非专利文献 是 ： Yang, Z.X., Wu, Q.J., Wang, S.L., Chang, X.L., Wang, J.H., Guo, Z.J., Lei, Y.Y., Xu, B.Y., Zhang, Y.J. (2012) Expression of cadherin, aminopeptidase N and alkaline phosphatase genes in Cry1Ac-susceptible and Cry1Ac-resi。
33、stant strains of Plutella xylostella (L.). Journal of Applied Entomology, 136, 539548. (2) 小菜蛾 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 抗性种群 (DBM1Ac-R) ： 该种群在中国农业科学院蔬菜 花卉研究所昆虫组昆虫饲养室内用 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac ( 提取方法参考 Luo, K., Banks, D., Adang, M.J. (1999) Toxicity, binding, and permeability analyses of four Bacillus thuringiensis Cry。
34、1 -endotoxins using brush border membrane vesicles of Spodoptera exigua and Spodoptera frugiperda. Applied and Environmental Microbiology, 65, 457464.) 进行抗性汰选， 连续饲养至今 ； 记载过小菜蛾 Bt 杀虫蛋 白 Cry1Ac 抗性种群 (DBM1Ac-R) 的非专利文献是 ： Yang, Z.X., Wu, Q.J., Wang, S.L., Chang, X.L., Wang, J.H., Guo, Z.J., Lei, Y.Y., X。
35、u, B.Y., Zhang, Y.J. (2012) Expression of cadherin, aminopeptidase N and alkaline phosphatase genes in Cry1Ac-susceptible and Cry1Ac-resistant strains of Plutella xylostella (L.). Journal of Applied Entomology, 136, 539548. (3) 小菜蛾 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 抗性近等基因系种群 (NIL-R) ： 该种群在敏感种群 DBM1Ac-S 和抗性种群 DBM1Ac-R 。
36、经过多达 7 次的多组单对杂交、 回交及汰选后建立的与 DBM1Ac-S 敏感种群遗传背景高度相似的近等基因系 Cry1Ac 抗性种群。该种群建成后在本 实验室内用 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 进行持续抗性汰选， 连续饲养至今 ； 记载过该小菜蛾 Bt 杀 虫蛋白 Cry1Ac 抗性近等基因系种群 (NIL-R) 的非专利文献是 ： Zhu, X., Lei, Y., Yang, 说 明 书 CN 104178577 A 7 6/9 页 8 Y., Baxter, S.W., Li, J., Wu, Q., Wang, S., Xie, W., Guo, Z., Fu, W., Zhang,。
37、 Y. (2014) Construction and characterisation of near-isogenic Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) strains resistant to Cry1Ac toxin. Pest Management Science, DOI: 10.1002/ps.3785. (4) 深圳汰选种群 (SZ-R, 又叫 T2-R) ： 该种群是 2003 年在广东省深圳田间采集的小 菜蛾种群， 在本实验室内用 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 浸叶汰选至今 ； (5) 上海汰选种群 (SH-R) 。
38、： 该种群是 2005 年在上海田间采集的小菜蛾种群， 在本实验 室内用 Btk 制剂 ( 购自湖北省农科院 Bt 研究开发中心 ) 浸叶进行抗性选育至今。 0034 以上所用的5个种群 ： 小菜蛾Bt杀虫蛋白敏感种群(DBM1Ac-S)、 小菜蛾Bt杀虫蛋 白Cry1Ac抗性种群(DBM1Ac-R)、 小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性近等基因系种群(NIL-R)、 深圳汰选种群 (SZ-R) 和上海汰选种群 (SH-R)。 0035 上述五个小菜蛾种群均在室内进行隔离饲养， 将蛹放入成虫饲养笼中 （R=10 cm， L=40 cm） ， 笼四周以80目的纱网包围， 成虫羽化后， 笼内挂浸过。
39、10%蜂蜜糖水的脱脂棉球一 个， 为成虫补充营养， 让其在甘蓝苗上产卵， 卵孵化后再转入新鲜的甘蓝苗上饲养。饲养温 度是 251， 相对湿度为 60%-70%， 光周期为光照 ： 黑暗 =16h ： 8h。 0036 实施例 1 利用实时荧光定量 PCR 技术对 DBM1Ac-S 及 SZ-R 的 4 龄幼虫中肠 cDNA 样品的检测及 本检测试剂盒和其使用方法的建立。 0037 1. 以小菜蛾中肠 ABCC2 基因的保守片段区为靶目标序列 （SEQ ID NO.1） ， 根据实 时荧光定量 PCR 引物设计原则， 设计特异性荧光定量引物序列如下 ： 正向引物 (qCC2-F) ： 5 -AG。
40、TCTTGGCACGCAAACGG-3（SEQ ID NO.2） ； 反向引物 (qCC2-R) ： 5 -CGAACAGACGCATGAAGGACAT-3（SEQ ID NO.3） ； 该特异性引物扩增片段序列如图1所示， 其扩增特异性如图2 （其中， 1 ： 目的基因ABCC2 的 PCR 扩增片段 ； 2 ： 内参基因 L32 的 PCR 扩增片段 ； M ： Marker 。 ） 所示， 从图中可看出该 引物扩增特异性高， 扩增条带单一， 大小为 101bp， 符合实时荧光定量 PCR 反应要求。此外， 从图中也可看出本实验中使用的内参基因 L32 的引物扩增特异性也很高， 扩增条带单。
41、一， 大小为 120bp， 也符合实时荧光定量 PCR 反应要求。 0038 2. 提取两种群 4 龄小菜蛾中肠 RNA 样品， 然后反转录为 cDNA 模板， 在包括步骤 1 所述特异性引物的实时荧光定量 PCR 反应体系中进行反应 ； (1) 小菜蛾中肠 RNA 的提取步骤如下 ： 取敏感、 抗性种群小菜蛾 4 龄幼虫， 使用解剖镊冰上取出中肠组织， 并使用 0.7% NaCl 溶液漂洗干净 ； 将中肠组织放入玻璃匀浆器内， 并向匀浆器中加入l ml的Trizol试剂充分匀浆， 匀 浆后将液体倒入 1.5ml 离心管内， 室温放置 5min ； 向离心管中加入 0.2 ml 的氯仿， 剧烈。
42、振荡 15 s， 然后室温放置 3 min ； 在 4条件下 12,000 rpm 离心 15 min ； 吸取上清液转入到一个新的离心管中， 加入0.5 ml异丙醇， 将管中液体轻轻混匀， 室 温静置 10 min ； 在 4条件下 12,000 rpm 离心 10 min ； 说 明 书 CN 104178577 A 8 7/9 页 9 弃上清， 然后加入l ml 75% 的乙醇， 轻轻洗涤沉淀， 4， 7,500 rpm离心5 min， 弃上 清 ； RNA 沉淀自然干燥后， 加入约 50l DEPC 水溶解， 冰上保存， 测 OD260/OD280值， 电泳检 测条带， 选择符合条件的。
43、 RNA 样品进行以下反转录实验或 -80保存备用。 0039 (2) 反转录合成 cDNA 模板 ： 下面以日本 TaKaRa 公司去基因组的 PrimeScript RT 试剂盒为例， 实验过程如下 ： 使用前将试剂盒各组分解冻并离心混匀 ； 基因组 DNA 的去除反应 ： 反转录反应 ( 冰上进行 ) ： (3) 实时荧光定量 PCR 标准曲线的建立 ： 对样品 cDNA 进行 5 个梯度稀释 （稀释倍数分别为 A ： 1、 B ： 2、 C ： 4、 D ： 8、 E ： 16） ， 然后采用 SYBR Green 嵌合荧光法进行实时荧光定量 PCR ： 荧光定量 PCR 反应体系 2。
44、5l 组成如下 ： 说 明 书 CN 104178577 A 9 8/9 页 10 * 该产品为北京天根生物科技有限公司 SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) 试剂 盒。 0040 荧光定量 PCR 反应条件为 ： 94预变性 15 min， 94变性 15 sec， 53退火 30 sec， 72延伸 32 sec， 40 个循环。 0041 PCR 过程完成后， 按 0.ls-1的升温速率从 72升至 95进行融解曲线的分析 验证， 具体过程为 ： 95进行15 s， 然后60进行1 min， 接着95进行30 s， 最后再在60 进行 15 s。 0042。
45、 最终得到的标准扩增曲线如图 3 所示 ； 其中， 横坐标代表循环数， 纵坐标代表第 n 次 PCR 循环时的荧光信号强度， 图中平行且远离横坐标的直线代表荧光阈值， A、 B、 C、 D、 E 字 母代表样品 cDNA 的 5 个稀释浓度。 0043 最终得到的标准曲线如图4所示 ； 其中， 横坐标代表标准样品cDNA浓度的对数值， 纵坐标代表循环阈值即 Ct 值。 0044 (4) 实时荧光定量 PCR 反应过程 ： 实时荧光定量 PCR 反应过程的体系及条件如上面步骤 (3) 所述。 0045 3. 检测 ： 本发明使用 ABI Prism 7500 实时荧光定量 PCR 仪进行检测。 。
46、0046 4. 结果分析 ： ABI Prism 7500实时荧光定量PCR仪进行结果分析时， 基线设置取3-15个循环的荧光 信号。 为便于比较， 样品 （供试小菜蛾种群4龄幼虫中肠cDNA样品） 、 阴性对照 （对Bt杀虫蛋 白敏感的小菜蛾种群 DBM1Ac-S 的 4 龄幼虫中肠 cDNA 为阴性对照样品） 及阳性对照 （对 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 产生抗性的小菜蛾种群 SZ-R 的 4 龄幼虫中肠 cDNA 为阳性对照样品） 的所 有扩增曲线的阈值均设定为 0.50153 ( 位于扩增曲线对数期中间位置， 其它仪器基线和阈 值设定可根据仪器作相应调整 )。 0047 对上述步骤中。
47、荧光定量PCR反应产物进行荧光定量检测， 如图5中所示， 在特定的 波长条件下， 根据荧光检测的抗敏样品间各自靶标基因 ABCC2 与内参基因 L32 之间的 Ct 值 差值 （即 Ct 值） 判断结果， 可知两样品产生了典型的 “S” 型扩增曲线， 且 DBM1Ac-S 的样 品的 Ct 值为 5.670.14(SEM)， SZ-R 的样品的 Ct 值为 7.950.18(SEM)， 通过统计学 分析， 两者之间的表达量差异达到了极显著水平， 由此， 通过 Bt 抗敏样品间该基因的表达 量差异可知， 可以很明显的区分出两者， 那么区分标准可初步设定为 ： Ct 值 7， 则说明 待测样品已对。
48、 Bt 杀虫蛋白产生抗性 ； 若 Ct 值 6， 则说明待测样品为敏感种群， 尚未对 Bt 杀虫蛋白产生抗性 ； 若 Ct 值位于两者中间， 则建议重做， 样品对 Bt 杀虫蛋白抗性产生 与否视重做结果而定。 0048 实施例 2 通过其他三个 Bt 抗性小菜蛾种群 DBM1Ac-R， NIL-R 及 SH-R 验证实施例 1 中的试剂盒 及检测方法的可用性， 具体实验过程如实施例 1 所示。 0049 最终的荧光定量 PCR 反应检测结果如图 6 中所示， 其中， A ： 实施例 1 中对 Bt 杀虫 蛋白敏感的小菜蛾种群 DBM1Ac-S 的 4 龄幼虫中肠 cDNA 阴性对照样品 ； B。
49、 ： 实施例 1 中对 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 产生抗性的小菜蛾种群 SZ-R 的 4 龄幼虫中肠 cDNA 阳性对照样品 ； C ： 对 Btk产生抗性的小菜蛾种群SH-R的4龄幼虫中肠cDNA待测样品 ； D ： 对Bt杀虫蛋白Cry1Ac 说 明 书 CN 104178577 A 10 9/9 页 11 产生抗性的小菜蛾种群DBM1Ac-R的4龄幼虫中肠cDNA待测样品 ； E ： 对Bt杀虫蛋白Cry1Ac 产生抗性的小菜蛾近等基因系种群 NIL-R 的 4 龄幼虫中肠 cDNA 待测样品。 0050 在特定的波长条件下， 根据荧光检测的抗敏样品间各自 Ct 值判断结果， 可知两 样品产生了典型的 “S” 型扩增曲线， 且 SH-R样品的Ct值为8.470.17(SEM)， DBM1Ac-R 样品的 Ct 值为 8.910.21(SEM)， N。