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1、(10)申请公布号 CN 104031998 A (43)申请公布日 2014.09.10 CN 104031998 A (21)申请号 201410246787.X (22)申请日 2014.05.30 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/70(2006.01) (71)申请人 中国动物卫生与流行病学中心 地址 266032 山东省青岛市南京路 369 号 (72)发明人 张永强 刘朔 赵永刚 吴晓东 李金明 王志亮 (54) 发明名称 一种 PCR 试剂盒中防止阳性对照污染待测样 品的方法 (57) 摘要 本发明涉及一种 PCR 试剂盒中防止阳性对照 污染待测样品的方法， 。
2、通过具体分析阳性模板核 酸序列， 在特定条件下将用做阳性对照的模板缩 短50-100bp左右的碱基， 完成相关PCR反应后， 通 过琼脂糖凝胶电泳即可观察和区分出待检样品的 阳性条带是真阳性还是因操作失误造成待检样品 中污染阳性对照而产生的假阳性。本发明能不改 变反应过程的情况下直观反映各种样品检测的真 实信息， 不会出现假阳性。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 1 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 序列表1页 附图2页 (10)申请公布号 CN 104031998 A CN 10403。
3、1998 A 1/1 页 2 1. 一种 PCR 试剂盒中防止阳性对照污染待测样品的方法， 其特征在于， 通过分析具体 核酸序列， 在符合下述条件下将用做阳性对照的模板缩短 50-100bp 左右的碱基 ： 1) 两者 具有相同或相近的 GC 百分比 ； 2) 未增加或减少发卡结构 ； 3) 未增加或减少二聚体、 错配的 G 值 ； 4) 扩增片段超过 450bp， 阳性对照模板缩短 100bp ； 低于 450bp， 阳性对照模板缩短 50bp ； 5) 不在靠近上下游引物的地方删减碱基 ； 完成相关 PCR 反应后， 通过琼脂糖凝胶电泳即可观察和区分出待检样品的阳性条带是 真阳性还是因操作。
4、失误造成待检样品中污染阳性对照而产生的假阳性。 2. 根据权利要求 1 所述的 PCR 试剂盒中防止阳性对照污染待测样品的方法， 其特征在 于， 以新城疫病毒检测方法为例， 该具体过程为 ： 步骤 a， 阳性模板制备 ； 根据新城疫检测技术国家标准 (GB/T 16550-2008) 提供引物扩 增的片段序列， 人工合成或利用其他分子生物学方法在片段中间删减 100bp， 使片段长度为 435bp， 连接 T 载体后作为阳性模板 ； 步骤 b， 检测 ； 按照新城疫检测技术国家标准 (GB/T 16550-2008) 提供条件对阳性和阴性样品检测。 3. 根据权利要求 2 所述的 PCR 试剂。
5、盒中防止阳性对照污染待测样品的方法， 其特征在 于， 以新城疫检测为例， 上述步骤 a 中， 人工合成的序列为 ： 序列 2 ： ATGGGCTCCAGATCTTCTACCAGGATCCCAGTACCCCTGATGCTGACTGTCCGACTTGTGCTGGCACTGAGT TGCGTCTGCCCGACCAGCTCCCTTGATGGCAGGCCTCTTGCAGCTGCAGGGATTGTGGTAACAGGAGACAAGGCAGT CAACATATACACCTCATCTCAGACAGGGTCAATCATAGTCAAGTTACTCCCAAATATCAAGAGTCTGTGACCACATC TGGAGG。
6、AGGGAAACAGGGACGTCTTATAGGCGCCATTATCGGTGGTGCGGCTCTCGGGGTTGCAACCGCTGCACAGA TAACAGCAGCCTCGGCTCTAATACAAGCCAATCAAAATGCTGCCAACATTCTCCGGCTTAAGGAGAGCATTGCTGCA ACCAATGAGGCTGTGCACGAGGTCACTGACGGATTATCACAACTAGCAGTGGCAG。 权 利 要 求 书 CN 104031998 A 2 1/3 页 3 一种 PCR 试剂盒中防止阳性对照污染待测样品的方法 技术领域 0001 本发明涉及生物检测领域， 尤其涉及一种 P。
7、CR 试剂盒中防止阳性对照污染待测样 品的方法。 背景技术 0002 现有技术中的 PCR 类检测试剂盒所用阳性对照， 一般是将目的片段突变某一个或 数个位点后插入某一质粒中， 将该质粒线性化后作为阳性对照。由于阳性对照目的片段进 行了突变， 因此通过测序可确定检测为阳性的样品是真阳性， 还是因反应体系污染阳性对 照模板而导致的假阳性。但是测序工作一般需要交由测序公司进行， 从送交样品算起大概 需要一周左右的时间， 大大浪费了时间。此外， 对于某些有保密要求的样品来说， 送交公司 测序增加了泄密的可能性。 0003 并且， PCR 试剂盒中通常以含有扩增片段目的基因的质粒作为阳性对照的模板， 。
8、PCR 灵敏度高， 操作过程中容易造成阳性质粒污染待检测的样品， 从而造成待检样品假阳 性。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种 PCR 试剂盒中防止阳性对照污染待测样品的方法， 用 以克服上述技术缺陷。 0005 为实现上述目的， 本发明提供一种 PCR 试剂盒中防止阳性对照污染待测样品的 方法， 比较分析具体的阳性模板核酸序列， 将用做阳性对照的模板缩短 50-100bp 左右的 碱基， 缩短后的阳性对照模板与原阳性对照模板相比， 必须符合以下条件 ： 1) 两者具有相 同或相近的 GC 百分比 ； 2) 未增加或减少发卡结构 ； 3) 基本未增加或减少二聚体、 错配的 G 值 。
9、； 4) 扩增片段超过 450bp， 阳性对照模板缩短 100bp。低于 450bp， 阳性对照模板缩短 50bp ； 5)尽量不在靠近上下游引物的地方删减碱基。 以该模板为阳性对照， 完成相关PCR反 应后， 通过琼脂糖凝胶电泳即可观察和区分出待检样品的阳性条带是真阳性还是因操作失 误造成待检样品中污染阳性对照而产生的假阳性， 同时不影响反应过程。 0006 进一步， 以新城疫检测技术为例， 该具体过程为 ： 0007 步骤 a， 阳性模板制备 ； 根据新城疫检测技术国家标准 (GB/T 16550-2008) 提供引 物扩增的片段序列， 人工合成或利用其他分子生物学方法在片段中间删减 10。
10、0bp， 使片段长 度为 435bp， 连接 T 载体后作为阳性模板 ； 0008 步骤 b， 检测 ； 0009 按照新城疫检测技术国家标准 (GB/T 16550-2008) 提供条件对阳性和阴性样品检 测。 0010 进一步， 上述步骤 a 中， 人工合成的序列为 ： 0011 序列 2 ： 0012 ATGGGCTCCAGATCTTCTACCAGGATCCCAGTACCCCTGATGCTGACTGTCCGACTTGTGCTGGCACTG 说 明 书 CN 104031998 A 3 2/3 页 4 AGTTGCGTCTGCCCGACCAGCTCCCTTGATGGCAGGCCTCTTGC。
11、AGCTGCAGGGATTGTGGTAACAGGAGACAAGGC AGTCAACATATACACCTCATCTCAGACAGGGTCAATCATAGTCAAGTTACTCCCAAATATCAAGAGTCTGTGACCAC ATCTGGAGGAGGGAAACAGGGACGTCTTATAGGCGCCATTATCGGTGGTGCGGCTCTCGGGGTTGCAACCGCTGCAC AGATAACAGCAGCCTCGGCTCTAATACAAGCCAATCAAAATGCTGCCAACATTCTCCGGCTTAAGGAGAGCATTGCT GCAACCAATGAGGCTGTGCACGAGGTCACTGA。
12、CGGATTATCACAACTAGCAGTGGCAG。 0013 与现有技术相比较本发明的有益效果在于 ： 本发明通过分析具体核酸序列， 在符 合下述条件的情况下将用做对照的模板减少 50-100bp 左右的碱基 ： 1) 两者具有相同或相 近的 GC 百分比 ； 2) 未增加或减少发卡结构 ； 3) 基本未增加或减少二聚体、 错配的 G 值 ； 4) 扩增片段超过 450bp， 阳性对照模板缩短 100bp。低于 450bp， 阳性对照模板缩短 50bp ； 5) 尽量不在靠近上下游引物的地方删减碱基。不影响扩增效果的同时， 通过 PCR 反应结束 后的琼脂糖凝胶电泳结果即可判断待检样品是真。
13、阳性还是假阳性， 能有效防止假阳性的出 现 ； 并且本发明能直观反映各种样品检测的真实信息， 不会出现假阳性。 附图说明 0014 图 1 为本发明 1 阳性和阴性样品没有被阳性对照污染 ； 0015 图 2 为本发明 2 阳性和阴性样品被阳性对照污染 ； 0016 图 3 为本发明 3 阳性样品被阳性对照污染 ； 0017 图 4 为本发明 4 阴性样品被阳性对照污染。 具体实施方式 0018 以下结合附图， 对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。 0019 本发明通过比较分析具体核酸序列， 将用做阳性对照的模板在符合下述条件的情 况下缩短 50-100bp 左右的碱基 ： 1。
14、) 两者具有相同或相近的 GC 百分比 ； 2) 未增加或减少发 卡结构 ； 3) 基本未增加或减少二聚体、 错配的 G 值 ； 4) 扩增片段超过 450bp， 阳性对照模 板缩短 100bp。低于 450bp， 阳性对照模板缩短 50bp ； 5) 尽量不在靠近上下游引物的地方删 减碱基。完成相关 PCR 反应后， 通过琼脂糖凝胶电泳即可观察和区分出待检样品的阳性条 带是真阳性还是因操作失误造成待检样品中污染阳性对照而产生的假阳性。 0020 以新城疫检测技术为例， 该具体过程为 ： 0021 步骤 a， 阳性模板制备 ； 0022 根据新城疫检测技术国家标准 (GB/T 16550-20。
15、08) 提供引物扩增的片段序列 ( 序 列长度 535bp)( 序列见 “序列 1” )， 人工合成或利用其他分子生物学方法在片段中间删减 100bp， 使片段长度为 435bp( 序列见 “序列 2” )， 连接 T 载体后作为阳性模板。 0023 步骤 b， 检测 ； 0024 按照新城疫检测技术国家标准 (GB/T 16550-2008) 提供条件对阳性和阴性样品检 测， 阳性对照为按照本发明提供的方法制备。 0025 检测结果出现如下 4 种情况。 0026 说明 ： 下面4个模式图中， 泳道1为核酸分子量标志 ； 泳道2为阳性对照 ； 泳道3为 阳性待检样品 ； 泳道 4 为阴性待检。
16、样品。 0027 图 1 中， 1 阳性和阴性样品没有被阳性对照污染 ； 说 明 书 CN 104031998 A 4 3/3 页 5 0028 图 2 中， 2 阳性和阴性样品被阳性对照污染 ； 0029 图 3 中， 3 阳性样品被阳性对照污染 ； 0030 图 4 中， 4 阴性样品被阳性对照污染。 0031 上述 4 种情况涵盖检测过程中所有可能出现的情况， 由于阳性对照条带与阳性样 品条带大小不同， 所以无论出现何种情况， 本发明均能直观反映样品检测的真实信息， 不会 出现假阳性。 0032 本发明不限于以上所述的实施例， 而是可在随附权利要求的范围内进行修改， 只 需满足本发明的技术构思和主要精神。 说 明 书 CN 104031998 A 5 1/1 页 6 0001 序 列 表 CN 104031998 A 6 1/2 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104031998 A 7 2/2 页 8 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 104031998 A 8 。